PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)

1. Técnica Cirúrgica <ol><li> Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de anestesia em anexo e marcar em uma concentração de isoflurano de 4%, até a respiração desacelerou e se o animal está tranqüilo. </li><li> Em seguida, mudar o fluxo de gás para o anexo máscara de gás para o quadro estereotáxico e colocar o animal no aparelho estereotáxico. Por sua vez a concentração de isoflurano para 2% e monitorar anestesia. Animais de maior porte (&gt; 300g) pode exigir uma maior concentração de isoflurano. A anestesia deve ser monitorizada durante a cirurgia e dosagem isoflurano ajustado em conformidade. Profundidade e taxa de respiração deve ser constantemente avaliados e avaliação toe pitada (a cada 5 minutos) para a ausência de dor profunda deve ser realizada. </li><li> Uma vez que a cirurgia está completa, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos antes da remoção do dispositivo estereotáxico. Temperatura corporal deve ser mantida, cobrindo o animal com um cobertor cirúrgica e / ou usar um cobertor de aquecimento regulados durante a cirurgia. </li></ol> 3. Preparação seringa para injeções intra-oculares <ol><li> Em primeiro lugar, montar o sistema de seringa para a realização das injeções intra-ocular. A 10 mL estanque ao gás RN 1701 Seringa Hamilton é utilizado para a injeção. Remova qualquer agulha ou RN presente porca na extremidade da seringa. </li><li> Inserir a ponteira PFA no copo PEEK ponteira do encaixe de compressão. Em seguida, insira a instalação completa no final da seringa e vagamente parafuso a porca RN por cima. </li><li> Insira uma extremidade do tubo PEEK 1 / 16 polegadas para o encaixe de compressão, através da abertura na porca RN. Certifique-se o tubo PEEK está totalmente encaixado. Aperte a porca RN para comprimir a anilha, selando o tubo PEEK. </li><li> Executar Etapa 3.2 em ambas as extremidades do engate duplo vidro RN. Anexar a extremidade livre do tubo PEEK a uma extremidade do acoplador duplo vidro RN, apertando a porca RN. </li><li> A micropipeta de vidro puxado formarão a agulha e barril para o sistema de injeção. Use 1,5 milímetros OD tubo de vidro com paredes espessas capilar para fabricar as pipetas de vidro, e inserir a pipeta de vidro na extremidade livre do acoplador duplo vidro RN. Aperte a porca RN para corrigir a pipeta no lugar. </li><li> A ponta fina de micropipetas de vidro puxado é tipicamente muito pequeno para a realização de injeções intra-oculares. A fim de criar uma ponta de diâmetro adequado, quebrar a ponta da pipeta de vidro sob a orientação visual, usando um microscópio cirúrgico. O fim de um slide fosco espécime de vidro é bem adequado para quebrar a pipeta. Manter a pipeta em um ângulo e esfregue a ponta ao longo da cobertura de vidro para criar uma quebra. Idealmente, a ponta final deve ser ligeiramente chanfrado. Pode demorar algumas tentativas para produzir uma boa dica, para puxar pipetas múltiplas antes de usar. </li><li> O sistema de injeção é hidráulico. Portanto, a seringa, linker tubulação PEEK, Dual RN acoplador de vidro ea micropipeta de vidro deve ser preenchido com óleo mineral antes de usar. Usando o kit de Priming Hamilton Seringa Co. (PRMKIT), preencher a seringa priming com óleo mineral. Use uma agulha de grande diâmetro para permitir a passagem fácil do óleo viscoso. Substituir a agulha com o 90030 Hamilton agulha que se encaixa dentro do cilindro da seringa Hamilton 10 mL. Em seguida, coloque um septo de borracha ao longo dos 90.030 Hamilton agulha, a fim de proporcionar uma vedação enquanto está a injectar o óleo mineral. </li><li> Insira o Hamilton 90.030 agulha da seringa priming na parte traseira do cano da seringa Hamilton de 10 L do sistema de injeção. Pressione o septo firmemente contra a extremidade da seringa para criar um selo. </li><li> Pressione o êmbolo lentamente. Você vai ver a passagem de óleo mineral através dos elementos de vidro do sistema de injeção e, finalmente, encher a pipeta de vidro. Empurre todo o óleo através do sistema de injeção, a fim de remover quaisquer bolhas de ar ao longo do trato. Se a seringa de enchimento é ficar sem óleo mineral, retire a agulha lentamente enquanto constantemente distribuição de óleo para evitar a formação de bolhas de ar. Encher a seringa e injetar priming novamente. </li><li> Quando todo o sistema é preenchido com óleo mineral e bolha livre, insira o êmbolo da seringa originais Hamilton 10 mL. O êmbolo até o final de seu curso, a fim de remover o óleo mineral adicional do sistema. Limpe o vidro micropipeta limpa e no final da seringa limpa com etanol a 70%. </li><li> Withdraw o êmbolo da seringa para a marca de 2 mL sobre o barril. O fim da micropipeta de vidro vai encher com ar proporcionando uma zona tampão entre o óleo mineral e do fluido desejado a ser injetado. O barril de pipeta agora pode ser preenchido por colocar o fim da micropipeta na solução desejada e retirar o êmbolo da seringa Hamilton. Não injetar mais de 4-5 mL de solução em um olho de rato adulto. </li></ol> 4. Procedimento de injeção intra-ocular: Focalizando os Retina Globalmente <ol><li> Com o animal anestesiado e fixado no quadro estereotáxico (como descrito na Seção 2), use olho Alcaine cai para topicamente anestesiar a córnea. Abrir as pálpebras com os dedos e coloque uma gota da solução anestésica na superfície da córnea. </li><li> Injeção necessárias duas pessoas: uma para inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea e manter a posição pipeta, e outro para pressionar o êmbolo da seringa que oferece a solução desejada. </li><li> Sob um microscópio cirúrgico aderência, o vidro eo acoplador micropipeta de vidro duplo RN com os dedos. Espalhe as pálpebras com os dedos de sua mão livre, formando um &quot;V&quot; forma em frente ao local da injeção. Através da aplicação de tração para as pálpebras, o olho será elevado fora da órbita, expondo a superfície posterior atrás do limbo. Criando um &quot;V&quot; shape com os dedos em frente ao local da injeção, um berço é formado para o olho proporcionando estabilidade ao injetar. </li><li> Introduza cuidadosamente a ponta da micropipeta de vidro através da conjuntiva, em uma área desprovida de vasos sanguíneos, e através da esclera, em um ângulo para baixo. Você deve sentir um &quot;pop&quot; pequeno quando a pipeta penetra na esclera. Inserir a pipeta em um ângulo ligeiramente para baixo reduz a chance de bater a lente ao inserir a agulha. </li><li> A pessoa que segura a seringa deve agora injetar o 4 mL de solução pressionando o êmbolo até à marca de 2 mL da seringa. A injecção deve demorar cerca de 1-2 segundos no total. Injetar em um ritmo muito lento&gt; 3 segundos reduz a propagação inicial da solução através da câmara vítrea. Você será capaz de ver a solução injetada rubor através da câmara vítrea sob o microscópio, assim, verificar o sucesso do procedimento. </li><li> Segure a micropipeta constante por aproximadamente 5 segundos e depois retirar-se, na mesma direção que a agulha foi inserida. A conjuntiva flap vai para trás sobre a pequena abertura, ajudando a selar a perfuração escleral. </li><li> Cubra a superfície da córnea com pomada oftálmica nos olhos (lágrimas Naturale PM), a fim de evitar o ressecamento da córnea durante a recuperação, e devolver o animal para uma gaiola de recuperação. </li><li> Pós-cirúrgico analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia. </li></ol> 5. Segmentação seletivamente células ganglionares da retina do Stump Nervo Óptico <ol><li> Aplicação de marcadores, drogas, plasmídeos, siRNAs ou vetores virais para coto do nervo óptico, após axotomia, diretamente alvos células ganglionares da retina através de transporte retrógrado. Isto é realizado pela primeira execução de uma transecção do nervo óptico de acordo com o &quot;Protocolo Transecção Nervo Óptico&quot; 22. </li><li> Existem dois métodos principais para realizar este procedimento: usando gelfoam, ou injeção direta no nervo óptico. </li><li> O método é semelhante ao gelfoam retrógrada rastreamento, porém ao entregar tratamentos experimentais no nervo óptico que é desejável rótulo de pré-as células ganglionares da retina através da injeção de traçadores retrógrados no colículo superiores 1 semana antes da axotomia. Isto é importante para a célula de rastreamento, porque, em alguns casos traçadores neuronais podem interferir com o transporte retrógrado de substâncias experimentais ou vice-versa. </li><li> Imediatamente após o nervo ótico for cortado, um pequeno pedaço de gelfoam embebido na solução experimental é colocado sobre o coto do nervo seccionado óptica. O conteúdo orbital são então retornou ao seu local anterior. Quando o olho é retornado para uma posição neutra, é necessário o uso de fórceps para empurrar o pedaço de gelfoam para dentro da órbita, garantindo que ela permaneça sobre a extremidade do nervo óptico. </li><li> A técnica de injeção é mais eficaz para a entrega de substâncias que devem ter acesso para o citoplasma do axônio, a fim de ser transportado retrogradamente pelo fluxo axoplasmic. Isto inclui siRNAs e plasmídeos, e em alguns casos vetores virais. A seringa Hamilton 50-10 mL é usada para injetar a solução desejada para o nervo óptico seccionado. </li><li> Aderência lateral do nervo óptico com fina ponta Dumont fórceps. Insira a ponta da agulha no nervo óptico, em paralelo com o nervo, até que o bisel não é mais visível. A agulha inserida será envolto por todos os lados do nervo. A agulha com bisel curto é desejável. </li><li> Uma vez que o needle é inserido no nervo, aperte delicadamente nas laterais do nervo com a pinça de ponta fina e injetar um quarto da solução enquanto gira a seringa um quarto de volta no sentido horário ou anti-horário. </li><li> Continue repetindo o passo 5,7 até ter completado uma rotação completa da agulha e injetou todo o conteúdo da seringa. Para melhores resultados injetar um total de 10 mL de solução utilizando uma seringa Hamilton herméticos 10 mL. </li><li> Retire a ponta da seringa do nervo. Deixar o excesso de líquido injetado que tem refluído do nervo dentro da órbita, pois isso forma uma piscina adicional para absorção pelas extremidades dos axônios. </li><li> Retorna o conteúdo orbital para sua posição original, fechar a ferida, e permitir que o animal se recuperar. </li><li> Pós-cirúrgico analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia. </li></ol> 6. Resultados representativos: Injeções intra-oculares-alvo todas as células da retina globalmente, e funcionam bem para as substâncias de entrega para RGCs feridos desde células ganglionares estão localizados na camada mais interna neuronal da retina, ao lado da câmara vítrea. RGCs também pode ser directamente visados ​​mediante a entrega de substâncias para o coto do nervo seccionado óptica. RGCs Fluorogold retrogradamente marcados podem ser direcionados usando peptídeos, drogas, vetores, plasmídeos ou siRNAs do tronco do nervo, como ilustrado na Figura 1. Figura 1A-C demonstra a localização de um peptídeo Cy3 rotulados na somata de RGCs que foram pré-rotulados pela injeção Fluorogold para o colículo superior. Cy3 peptídeos marcados foram injetados no nervo óptico imediatamente após axotomia, ea retina foi fotografada viva, a fim de evitar que os peptídeos de lixiviação do tecido durante a fixação. Figura 1D-F demonstra a localização de Cy3 siRNAs rotulados e traçador retrógrado Fluorogold em RGCs axotomized. Cy3 siRNAs marcados foram injetados no coto do nervo óptico imediatamente após axotomia, ea retina foi fotografada viva. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografias de epifluorescência de RGCs em retinas flatmounted menos 1 dia após a axotomia e injeção de qualquer peptídeos rotulados ou siRNAs no coto do nervo óptico. (A) rotulagem Fluorogold retrógrado em RGCs axotomized postaxotomy em 1 dia (B) Cy3 fluorescência em RGCs seguintes transporte retrógrado de peptídeos marcados, um dia após a axotomia e injeção de peptídeo no nervo óptico. (C) sobreposição de (A) e (B) demonstrando a localização seletiva de Cy3 peptídeos rotulados de RGCs Fluorogold rotulados. (DF) Os corpos celulares dos Fluorogold RGCs rotulada (D) também estão cheias de Cy3 siRNAs rotulada (E) injetado no coto do nervo óptico 24 horas antes, como mostra a sobreposição (F). Barra de escala em AC é 50 mm. Barra de escala no DF é de 20 mM.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Transecção do nervo óptico é um modelo altamente reprodutível de apoptose adulto CNS neurônio. As manipulações experimentais demonstraram neste manuscrito permitir o estudo dos mecanismos da apoptose RGC após a lesão. Injeções intra-oculares são úteis para o direcionamento global da retina. Este procedimento requer alguma prática, pois é fundamental para não ferir a lente com a ponta da pipeta de vidro. Danos lente foi mostrado para causar a liberação de fatores de crescim...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Vetores virais, plasmídeos ou curto RNAs de interferência (siRNAs) também pode ser entregue à câmara vítrea, a fim de infectar ou transfecção as células da retina 12/05. O tropismo elevado de vírus adeno-associado (AAV) vetores é benéfico para RGCs alvo, com uma taxa de infecção de aproximadamente 90% de células perto do local da injeção 6, 7, 13-15. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas aplicando siRNAs, plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico 16-19 ou vetores injetar seu alvo o colículo superior 10. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal feridos sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela para manipulações experimentais contra processos envolvidos na apoptose. Manipulações que visam directamente o RGCs do tronco do nervo óptico transeccionados são realizadas no momento da axotomia, imediatamente após o corte do nervo. Em contraste, quando as substâncias são entregues via uma rota intra-ocular, que pode ser injetado antes da cirurgia ou durante os primeiros três dias após a cirurgia, que precede o início da apoptose em RGCs axotomized. No presente artigo, demonstramos vários métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K visualizações.  University of Toronto. Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Vídeo: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Neurociência

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.