Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo National Institutes of Health, conceder R01 EB007594, o Departamento de Defesa Programa de Pesquisa em Câncer de Mama, proposta BCO74699P7, ea Susan G. Komen Foundation conceder 26152/98188972.

1. Assembléia Microendoscope O microendoscope de alta resolução aqui descritas (figura 1) deve ser considerada como uma configuração de base com diversas variações possíveis na montagem e aplicação. Descrevemos em detalhes aqui uma encarnação da plataforma que é projetado para ser usado com proflavina como um agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear é uma brilhante mancha com pico de absorção e emissão de comprimentos de onda de 445 nm e 515 nm, respectivamente. O uso de agentes de contraste outras exigirá que o usuário selecione excitação, emissão e filtros dicróicos de forma adequada. Vários elementos da microendoscope de alta resolução são genéricos e podem ser obtidos de vários fornecedores. Por exemplo, componentes de posicionamento optomechanical estão disponíveis a partir Thorlabs, Newport, Linos, entre outros. CCD câmeras compactas estão disponíveis em empresas, incluindo Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilidade da câmera deve ser escolhido com a consideração do brilho do fluoróforo para ser utilizado, bem como a taxa de quadros desejado. De alta potência diodos emissores de luz (LEDs) podem ser obtidas Luxeon, Cree, e Nichia entre outros. Feixes de fibra óptica estão disponíveis a partir Sumitomo, Fujikura, e Schott. Na seleção de componentes para uma aplicação específica, o usuário deve considerar as relações inerentes envolvidos em microscopia de fluorescência entre a concentração de fluoróforo, fotodegradação, a intensidade da iluminação, a sensibilidade da câmera, ganho e tempo de exposição. <ol><li> Conecte o 6 &quot;varas gaiola para o 1.5&quot; hastes da gaiola, para formar um par de 7,5 &quot;longos bastões. Screw essas varas em uma face da unidade de espelho fold. Parafuso de 0,5&quot; varas na face oposta. Deslize o cubo gaiola para as hastes da gaiola, através dos dois mais baixas através de buracos. Parafuso a 2 &quot;varas para a face lateral do cubo gaiola (Figura 1B). </li><li> Conectar a câmera a uma placa de gaiola usando um C-mount para adaptador SM1. Fixe a placa na gaiola 0,5 varas &quot;gaiola, lave com o rosto da unidade de espelho fold. </li><li> Insira o &quot;tubo&quot; lente em um tubo de três lente &quot;longa e segura a lente com um anel de retenção. A distância focal da lente devem ser tais que os núcleos do feixe de fibra ótica são recolhidos por meio de pelo menos dois pixels quando projetadas para a câmera. Gota o filtro de emissão para o tubo em cima do primeiro anel de retenção, e adicionar um outro anel para fixar o filtro no lugar. Observe a convenção orientação filtro indicado pelo fabricante do filtro. Screw o tubo de lente para o lado do gaiola cubo mais próximo à câmera CCD. Note que na figura 1c, esta lente e filtro são mostrados sem o tubo de lente 3 &quot;para maior clareza. </li><li> Conectar a câmera a um computador e ver a imagem na tela. Dirigir o conjunto da gaiola de um objeto distante e deslize o cubo gaiola ao longo dos trilhos até que uma imagem aparece em foco. Bloquear o cubo gaiola neste local. (Este é um método simples de assegurar que a lente do tubo vai formar uma imagem focada, quando combinado com a lente objetiva corrigido ao infinito). </li><li> Insira o espelho dicróico para o titular e em 45 ° lugar no cubo gaiola. </li><li> Parafuso da lente objetiva, através de um RMS para SM1 adaptador de rosca e um tubo de lente ajustável, em face do cubo gaiola em frente à porta da lente do tubo. A z-tradutor pode ser usado no lugar do tubo da lente ajustável para facilitar a focagem. Parafuso de um conector SMA em uma placa de gaiola e montar este nas hastes, aproximadamente à distância de trabalho da lente objetiva. </li><li> Montar um LED em uma placa de gaiola e deslize para a final do 2 &quot;hastes. Adicionar uma lente para um 0,5&quot; tubo de lente de tal forma que quando esse tubo é parafusado no lado do cubo gaiola, ele irá formar uma imagem do LED que enche a abertura parte de trás da lente objetiva. Esta configuração (Kohler iluminação) irá garantir que a face proximal do feixe de fibra óptica é uniformemente iluminado. Adicionar o filtro de excitação para o tubo de lente de 0,5 &quot;e fixe no lugar com um anel de retenção (figura 1c). </li><li> Anexar um conector SMA a um feixe de fibra óptica. Parafuso o pacote SMA conectorizada no receptáculo SMA montado nas hastes da gaiola. Direto da extremidade distal do feixe para uma fonte de luz de banda larga (iluminação fluorescente será suficiente) e observar a imagem da face proximal pacote na câmara CCD. Ajustar a posição da lente objetiva apertando dentro ou para fora do cubo gaiola até que a imagem feixe de fibras aparece em foco. Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis (Figura 2). </li></ol> 2. Assembléia Lens GRIN A resolução espacial do microendoscope pode ser aumentado por uma lente de micro ou montagem da lente até a ponta distal do feixe de fibras. Estas lentes estão configurado de modo que em vez de colocar a ponta pacote directamente para o tecido, a dica é fotografada na superfície do tecido com demagnification, aumentando assim a frequência de amostragem espacial imposta pela guid-luzing núcleos do feixe de fibras. O grau de demagnification corresponde ao aumento da resolução espacial, e ao mesmo tempo, a uma diminuição proporcional no campo de visão. Componentes lente gradiente de índice (GRIN) são compatíveis com fibra óptica e estão disponíveis a partir GrinTech, NSG, Schott, entre outros, e pode ser diretamente ligado a ponta distal de um feixe de fibras. <ol><li> Selecione uma lente GRIN com a ampliação desejada e distância de trabalho para sua aplicação. Garantir que o diâmetro da lente excede o do feixe de fibras que você pretende trabalhar. Recomendamos que o feixe de fibras e lente GRIN ser montado em separado de 3 eixos estágios posicionamento manual sob um microscópio de baixa potência ou estereoscópio para um alinhamento preciso antes da colagem. </li><li> Colocar uma gota de cola óptico (por exemplo Norland adesivo de cura UV) em qualquer lente ou o rosto pacote. Traga os dois componentes em contato usando o posicionadores manual. Expor a interface à luz UV para a dose recomendada pelo fabricante. </li><li> Para proteger a lente GRIN ea interface ligado, um pequeno pedaço de tubo de alumínio capilar (Small Parts Inc.) pode ser usado para envolver o conjunto. Deslize o tubo sobre a articulação e seguro em lugar com epóxi. Tubulação do calor shrink pode ser usado para terminar a montagem. </li></ol> 3. Imagem Microendoscope <ol><li> Aplicar o agente de contraste para as células ou tecido a ser trabalhada. Com proflavina (0,01% w / v em PBS), in vitro de imagem de células em cultura pode ser realizada através da incubação de curta duração (&lt;1 minuto) e lavagem completa. Imagens de amostras de tecido ex vivo ou in vivo tecidos é a aplicação tópica de possível após a tintura. Absorção de proflavina nestas condições foi encontrado para ser quase instantânea, com imagem possível dentro de alguns segundos e duradoura por vários minutos. </li><li> Coloque o pacote de fibra óptica em leve contato com a amostra a ser trabalhada. Células quando imagem na cultura ou amostras de tecido ex vivo, recomendamos a montagem da extremidade distal do feixe de fibras em um dispositivo seguro com estágios posicionamento manual em eixos XYZ para a estabilidade durante o exame. </li></ol> 4. Resultados representativos: Quando montada corretamente, o microendoscope funcionará como um microscópio de epi-fluorescência, retransmitida através de um feixe de fibra ótica coerente. Para resultados de imagem ideal, a atenção deve ser dada para garantir que três condições essenciais são atendidas: <ol><li> A face proximal do feixe de fibras deve ser fotografada para a câmera CCD, sem desfocar, a fim de conseguir a resolução completa do sistema. Figura 2a, b, c mostram uma parte de um feixe de fibras fotografada com foco pobres, defocus leve, e bom foco, respectivamente. A focagem é encontrado ajustando a posição axial da lente objetiva em relação à face pacote. </li><li> A face proximal do feixe de fibras deve ser uniformemente iluminado sobre seu diâmetro total (campo de visão). Como descrito no texto do protocolo (1,7), isso é conseguido através da configuração do sistema ótico de iluminação para iluminação Kohler. Figura 2d mostra uma imagem adquirida quando uma amostra uniforme fluorescente é iluminada nesta configuração preferida, com 2e Figura demonstrando o resultado correspondente sob iluminação crítica. Neste último caso, a estrutura do LED é fotografada para o rosto feixe de fibras, resultando no aparecimento deste padrão indesejados sobrepostos na estrutura de amostra real. </li><li> Ambas as faces proximal e distal do feixe de fibras devem ser limpos e livres de arranhões e chips. Figura 2f demonstra a presença de detritos conectado à face pacote, com danos na forma de um pequeno chip em cinco horas no perímetro de fibra. Detritos podem ser removidos do pacote de faces através da limpeza da mesma forma como convencionais ligações de fibras ópticas, com um papel de lente e isopropanol, ou ferramentas padrão de fibra óptica de limpeza. Se uma das extremidades do feixe de fibras está riscado ou quebrado, ou se o pacote de quebra ao longo de seu comprimento, o cara pode ser polida plana pelo manual padrão, ou técnicas de polimento mecânico. Recomendamos 12-15 mM lapping papel para um polonês inicial grosseira, com um polonês final sobre papel 0,5-1,0 mM. </li></ol> Figura 3a mostra imagens de 1483 células in vitro, seguindo rotulagem com a colocação proflavina e luz do feixe de fibras nuas na amostra. Figura 3b mostra a melhora na resolução espacial e redução no campo de visão fornecida por uma lente GRIN 2.5x ligados à ponta pacote. Filme 1 demonstra na imagem in vivo da almofada de gordura mamária em um modelo de mouse. Aqui, um feixe de fibras com 0,5 mm de diâmetro externo (330 mM campo de visão) foi aprovada através de uma agulha calibre 21 e avançado para o tecido. Células de gordura são claramente visíveis, com o movimento, devido ao ciclo cardíaco aparente nesta aquisição de 15frames por segundo. Figura 3c mostra imagens da mucosa oral em voluntários saudáveis ​​humanos, desta vez usando um pacote maior de fibra com 1,5 mm de diâmetro externo (1,4 mm de campo de visão). Em todos os exemplos mostrados, proflavina foi usado como um agente de contraste nuclear rotulagem fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Montagem do microendoscope de alta resolução (HRME). (A) Diagrama esquemático do sistema HRME. (B) Assembleia da estrutura de suporte principal optomechanical. (C) A adição de elementos de óptica, iluminação LED, e uma câmera CCD. (D) Fotografia do sistema HRME, embalados em um &quot;x 8&quot; 10 x 2,5 caixa &quot;. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Configurando o HRME. Exemplos de imagens com o pacote de fibra óptica no (a) foco pobres, (b) perto de bom foco, (c) o foco ideal. Em (d), um alvo uniforme fluorescente na ponta distal do feixe é imaginada sob iluminação Kohler (uniforme). (E) Um objectivo uniforme fluorescente sob iluminação com imagens crítica, com a estrutura aparente fonte sobre o objeto. (F) tecido conjuntivo frouxo e células podem ficar com o rosto feixe de fibras, que também é propensa a danos menores em sua periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagens com a HRME. (A) 1483 células in vitro, fotografada com um feixe de fibras nuas (IGN-08/30), após marcação com proflavina 0,01% (w / v). (B) A cultura de células mesmo 1483 como mostrado em (a), fotografada com um feixe de fibras com lente GRIN 2.5x anexado. (C) Imagem da mucosa oral normal humana in vivo, após aplicação tópica de proflavina 0,01% (w / v). Filme 1. Imagem a almofada de gordura mamária de um rato através da inserção de um feixe de fibras 450 mM diâmetro externo dentro do lúmen de uma agulha calibre 21 passou para o tecido. Proflavina 0,01% (w / v) foi entregue ao site de imagens através da mesma agulha antes da inserção da fibra de imagem. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP e DY não têm nada a revelar. RRK detém patentes relativas às plataformas de imagem microendoscópica.

A alta resolução técnica microendoscopy aqui descrito fornece aos pesquisadores em áreas básicas da pesquisa biomédica e clínica com um método flexível, robusto e de baixo custo para a visualização de detalhes celulares in situ. Nós descrevemos um protocolo para a montagem do sistema de imagem e demonstrou a sua utilização em cultura de células in vitro e em animais e tecidos humanos in vivo. Embora os resultados aqui apresentados imagem usada proflavina como um agente de contraste fluorescente, outros grupos têm demonstrado versões do sistema com comprimentos de onda de iluminação LED e filtros escolhida para coincidir com excitação / emissão de espectros de outros corantes 5-7. Resolução e campo de visão são inicialmente determinado pelo espaçamento core-to-core e diâmetro de imagem do feixe de fibra óptica. Temos usado pacotes com aproximadamente 4 mm de espaçamento central-core, e diâmetros de imagem de 330 mM (filme 1), 720 mM (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 mM (Figura 3c). Os feixes menores podem ser passadas através de agulhas bitola estreita e são significativamente mais flexível do que as fibras maiores. Nós e outros oito têm, em alguns casos, notou o aparecimento de emissões de autofluorescência da fibra pacote em si. Ao tentar excitar fluoróforos em comprimentos de onda ultravioleta, ou recolher as emissões na faixa vermelha do espectro, a atenção deve ser dada ao nível de autofluorescência de fibra pacote contribuindo para o sinal total medido. Enquanto a maioria do trabalho microendoscopy alta resolução relatada até o momento, tem utilizado um feixe de fibras nuas, ampliação adicional pode ser fornecida pelo uso de lentes GRIN ligados à ponta distal. Lentes GRIN oferecem uma maneira simples e econômica para aumentar a resolução espacial, embora a sua suscetibilidade a aberrações ópticas e NA limitada é bem reconhecida. Se o desempenho da lente GRIN é inadequado para uma determinada aplicação, GRIN híbrido / objectivos lente esférica 9 ou conjuntos de lentes objetivas 11/10 miniatura podem ser empregadas. O microendoscope de alta resolução aqui descrito opera essencialmente como um grande campo do microscópio epi-fluorescência, portanto não seccionamento óptico (como em microscopia confocal ou não linear) é de se esperar. Em nossa experiência, utilizando 455 nm e luz de excitação proflavina tópica como agente de contraste, a luz é coletada principalmente a partir de uma profundidade correspondente a algumas camadas de células. Este protocolo deve permitir que o leitor a montar o microendoscope de alta resolução sobre a bancada, com um tamanho compacto de 10 &quot;x 8&quot;. Se desejar, o sistema pode ser colocado em uma caixa e os componentes elétricos (LED e uma câmera) alimentado por uma bateria (Figura 1d). Muitas câmeras compactas pode ser alimentado pelo IEEE-1394 (Firewire) e portas USB do computador host.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

Muitos estudos biológicos e clínicos requerem o estudo longitudinal e análise da morfologia e função com resolução nível celular. Tradicionalmente, experiências múltiplas são executados em paralelo, com amostras individuais retirado do estudo em momentos sequenciais para avaliação por microscopia de luz. Várias técnicas foram desenvolvidas intravital, com confocal, multifotônica, e microscopia segundo harmônico todos demonstrando sua capacidade de ser usado para geração de imagens em uma situ. Com estes sistemas, no entanto, a infra-estrutura necessária é complexo e caro, envolvendo sistemas de varredura a laser e complexas fontes de luz. Aqui apresentamos um protocolo para a concepção e montagem de um microendoscope de alta resolução que pode ser construída em um dia utilizando off-the-shelf componentes para EUA em US $ 5.000. A plataforma oferece flexibilidade em termos de resolução de imagem, o campo de visão, operacional e comprimento de onda, e descrevemos como esses parâmetros podem ser facilmente modificados para atender às necessidades específicas do usuário final. Nós e os outros têm explorado o uso do microendoscope de alta resolução (HRME) em cultura de células in vitro 2-5, em 6 excisadas e tecidos de animais vivos 2,5, e em tecidos humanos in vivo 2,7. Usuários relataram o uso de diferentes agentes de contraste fluorescente, incluindo proflavina 2-4, benzoporfirina derivados anel monoacid A 5 (BPD-MA), e fluoroscein 6,7, os quais têm recebido total, ou aprovação de investigação do FDA para uso em seres humanos. De alta resolução microendoscopy, na forma descrita aqui, pode apelar para uma ampla gama de pesquisadores que trabalham nas ciências básicas e clínicas. A técnica oferece uma abordagem eficaz e econômica que complementa microscopia tradicional bancada, permitindo ao usuário realizar de alta resolução, imagem longitudinal in situ.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K visualizações.  Rice University. Em muitas situações biológicas e clínicas, é vantajoso para estudar os processos celulares como eles evoluem no seu microambiente nativa. Aqui, descrevemos a montagem e uso de um microscópio de baixo custo de fibra óptica que pode fornecer imagens em tempo real em cultura de células, estudos em animais e estudos clínicos do paciente.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bioengenharia

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Configuração otimizada e protocolo para a imagem latente magnética domínio em Situ histerese medicão

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

PDawn-Ag43 modelado usando de deposição de biofilme em alta resolução

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...