Gostaríamos de agradecer a Laura Schippers para escrever as primeiras versões do protocolo de carga celular e Marcus de Goffau e Guille Zampar por atingir morfologias mitocondriais.

1. Produção e Elaboração de um Wafer molde de silicone Chips microfluídicos são criados a partir de um molde de wafer de silício produzidos por litografia macia. Essas pastilhas podem ser reutilizadas muitas vezes para produzir chips microfluidicos. É aconselhável que a produção de um respectivo bolacha é realizada por um grupo especializado em microfluidos 6. A bolacha é feito num processo de duas etapas de fotolitografia usando duas camadas diferentes de material fotosensitivo negativo, SU-8 7. A camada inferior é usada para gerar a área de captura da célula (SU-8 2002; altura de 3-4 mm), enquanto que os canais são feitas com a camada superior (SU-8, 2010, altura 10 mm). Uma impressão de o processo de produção da bolacha pode ser encontrado em Huang et al 8. Os desenhos das fichas microfluidicos podem ser obtidos a partir dos autores, bem como aconselhamento sobre como obter uma respectiva bolacha. <ol><li> Uma vez que o wafer é obtido, corte um pedaço de Tough-Tag intÕ tiras finas de cerca de 0,5 milímetros por 3 mm com um bisturi e colocá-las cuidadosamente sobre a bolacha ligeiramente por cima da estrutura de canal entre os canais de entrada de ar e a matriz microPad (Figura 2A). Isto irá resultar na formação de um grande canal adicional em cada chip, o qual não irá ser utilizado apenas durante o carregamento da célula, mas também é importante para o funcionamento estável do dispositivo de microfluidos. </li><li> Cobrir a placa de Petri de vidro com uma camada dupla de papel alumínio e colocar a hóstia na placa de Petri. A folha de alumínio irá impedir PDMS de correr entre a pastilha e a placa de Petri. Se PDMS faz fluência entre a bolacha e o prato de Petri de vidro, a bolacha será fixado permanentemente na caixa de Petri. Embora a bolacha é ainda útil, não será possível a substituição da placa de Petri de vidro, se rompe e o PDMS necessita ser cortada posteriormente. </li></ol> 2. Produção de chips microfluídicos <ol><li> Coloque um plástico vaziocopo na balança e tarar a balança. Despeje 40 g PDMS de base para o copo de plástico (para vidro de 12 cm de diâmetro placa de Petri). Adicionar o agente de cura de PDMS com uma pipeta descartável em relação a W / W de 01:10, isto é, cerca de 4 ml. </li><li> Misture o PDMS e agente de cura cuidadosamente durante alguns minutos. Isto pode ser feito com a pipeta de plástico descartável, que foi usada para pipetar o agente de cura. É importante que a mistura é bem misturada antes da sua utilização na parte superior da bolacha. Pobre mistura fará com que parte do PDMS não polimerizar. </li><li> Deite o PDMS no topo da bolacha na placa de Petri de vidro. </li><li> A mistura de PDMS com o agente de cura vai originar a formação de espuma na mistura de PDMS. Estas bolhas precisam de ser removidos antes que o PDMS polimeriza. O PDMS pode ser desgaseificado depois vertendo-a no topo da bolacha, colocando a placa de Petri num exsicador ligado a uma bomba de vácuo. Com esta configuração, que leva cerca de 30 minutos para remover todas as bolhas a partir da mistura. </li><li> Polimerizar ªPDMS e colocando a placa de Petri com a bolacha no topo de uma chapa quente a 120 ° C durante 1 hora e, em seguida, a 65 ° C durante mais uma hora. </li><li> Remover a película de alumínio em conjunto com a bolacha e polimerizada PDMS da placa de Petri de vidro. Retire a folha de alumínio e a camada residual de fina polimerizada PDMS da parte traseira da bolacha. A camada de PDMS no topo da bolacha pode então ser separado da bolacha, levantando-a cuidadosamente. </li><li> Coloque a camada de PDMS de cabeça para baixo (com os canais voltados para cima) no banco e cortar os únicos designs de chips impressos no PDMS cuidadosamente com um bisturi. Tentar reter cerca de 3 mm de PDMS em torno das bordas dos canais para melhorar a fixação do chip para o vidro de cobertura mais tarde. </li><li> Faça furos no PDMS nas extremidades do canal de entrada, saída e lateral (Figura 2A), empurrando um esboço Luer 20 Medidor de todo o caminho através do PDMS de forma reta. </li></ol> Certifique-se de que o chip PDMSainda está deitado de cabeça para baixo no banco, enquanto perfuração dos furos. Isto impede que o PDMS colem ao interior do canal, o que poderia causar o bloqueio do canal. <ol start="9"><li> Depois de perfurar cada buraco, retire a coluna de PDMS na ponta Luer com uma pinça antes de puxar a ponta novamente. A coluna PDMS poderiam ficar para trás e bloquear o buraco apenas um soco. </li><li> Limpar as superfícies do chip de partículas de poeira e de PDMS residual colocando uma fita adesiva sobre ela e removendo imediatamente a fita de novo. Da mesma forma limpar a tampa de vidro para que o chip vai ser anexado. </li><li> Coloque o chip limpo e tampa de vidro abaixo da lâmpada UV da bancada UV-Ozônio Cleaner. Os lados que precisam ser ligadas entre si deve enfrentar a lâmpada. </li><li> Expor o PDMS e cobrir de vidro para a luz UV durante 6-8 min e imediatamente depois colocar o chip na tampa de vidro, colocando as superfícies expostas em cima uns dos outros. </li><li> Bata levemente em torno dos lados do chippara promover a fixação do PDMS para o vidro de cobertura e para remover quaisquer bolhas de ar. Não toque no topo da estrutura do canal, pois isso pode fazer com que os micropads se apegar à tampa de vidro também. </li><li> Coloque a configuração microfluídico recentemente feito numa placa quente a 100 ° C durante 60 min. Teste da força da ligação entre a cobertura de vidro e chip PDMS pela tentativa de levantar as bordas do chip de PDMS ligeiramente. Quando o bloco de PDMS não pode ser levantado da superfície do vidro, a ligação é bem sucedido e o chip está pronto para uso. </li></ol> 3. Preparando o Chip para celular Loading A falha de um dispositivo de microfluidos pode potencialmente provocar uma fuga do meio no microscópio. Para evitar isso, é assessor utilizar um suporte de metal e / ou vedar os lados do chip em que o PDMS encontra o vidro com a unha polonês ou cola epóxi. Isto evita a fuga de meio, no caso do chip de PDMS não é suficientemente bem ligados à tampa de vidro. Além disso, a tubagemligações pode ser fixado em torno dos pontos de inserção de um modo semelhante, para evitar fugas de meio. Um sensor de água caseiro que desliga a bomba de seringa, em caso de vazamento pode ser usado como uma medida de segurança extra. Desenhos do suporte de metal concebida especialmente para o chip de microfluidos podem ser obtidos a partir dos autores. <ol><li> Coloque o chip de microfluídica no suporte de metal, com gel de silicone entre o vidro do chip e nas partes metálicas do suporte para criar um selo à prova d&#39;água. Parafusar as porcas delicadamente, para não quebrar o vidro. </li><li> Ligação de tubos finos (cerca de 5-15 cm de comprimento) para o canal lateral e o canal de saída do chip. O uso de pinças torna mais fácil inserir os tubos nos orifícios perfurados. </li><li> Encher uma seringa de 50 ml de Luer-Lok com meio de cultura, remover o ar da seringa e ligar sequencialmente a um filtro de seringa, um topo de Luer 20 calibres, um tubo grosso de curto (cerca de 2 cm de comprimento) e com um tubo fino. Certifique-se de que a banheira finae é longo o suficiente para cobrir a distância entre a bomba de seringa e a platina do microscópio. </li><li> Colocar a seringa na bomba de seringa, o avanço rápido da bomba até que o tubo fino é completamente cheia com o fluido. </li><li> Empurrar o tubo fino ligada à seringa para dentro do canal de entrada do chip e deixar que o fluxo médio através do chip a 10 ul / min (Figura 2B). Recolher o substrato, deixando o chip (por exemplo, numa placa de Petri). O meio vai correr para fora através do canal lateral devido à diferença de resistência entre o resistente-Tag feita grande canal lateral e o canal de saída. </li><li> Colocar o chip na platina do microscópio e ajustar o foco do microscópio sobre as almofadas. </li></ol> O uso de objetivos de imersão em óleo é preferível que os objectivos de imersão em água porque o óleo não vai secar ao longo do tempo-curso do experimento. Dependendo do microscópio poderia haver problemas relacionados com a retenção de fOCO durante as horas iniciais do experimento. Por isso, é aconselhável deixar o chip de uma a duas horas no palco microscópio para que ele possa se acalmar antes de células de carga e do início do experimento. 4. Carregamento de células de levedura na Microfluidic Chip <ol><li> Ligação a 5 ml Luer seringa para um esboço Luer Calibre 20 e um tubo de espessura (cerca de 3 cm). </li><li> Tomar uma amostra da cultura de células a ser carregado para o chip. </li></ol> A contagem de células preferido para a carga é de 1-5 x 10 6 culas por ml. As culturas com as contagens mais elevadas de células precisa de ser diluído antes do carregamento. Quando a cultura de células em meio YPD, a eficiência de carregamento de células pode ser melhorada muitas vezes se as células são lavadas primeiro com e ressuspensas em meio mínimo contendo uma percentagem de glucose semelhante antes do carregamento. Durante o funcionamento do chip, meio YPD novamente pode ser usado com segurança. <ol start="3"><li> Carregar cerca de 1 ml de suspensão de células em the seringa e remover todo o ar da seringa. </li><li> Diminuição da taxa de fluxo da bomba de seringa a 0,5 ul / min. O baixo fluxo contínuo e reforçado pela bomba de seringa durante a carga (no passo 4.5) vai empurrar as células não-inscritos para fora através do canal lateral (Figura 2C). </li><li> Ligação a seringa que contém a suspensão de célula para o tubo do canal de saída. Carregar as células pressionando o êmbolo da seringa gentilmente. Observe as células que entram e liquidação debaixo das micropads via ocular ou via tela do computador. </li><li> Manter a pressão sobre o êmbolo até que as células suficientes resolver debaixo das almofadas. A carga máxima é 1-3 células por pad. Como as células se contentar debaixo das almofadas de forma aleatória, é bastante comum que algumas pastilhas não contêm células e outras almofadas são completamente preenchida com células. </li><li> Desligue a seringa usada para o carregamento da célula eo tubo grosso ligado a ela do tubo fino do canal de saída, lave o ch ladoAnnel para um par de minutos a taxas de fluxo mais elevadas (10 ul / min) para remover as bolhas de ar e / ou células que ainda não saiu do chip (Figura 2B). Se as células não são removidos do canal lateral, elas podem começar a crescer no canal lateral e interferir com a experiência mais tarde. </li><li> Coloque o fluxo da bomba de seringa, de volta para baixo para 0,5 ul / min e fechar o canal lateral para fora, ligando-o a um tubo de espessura (cerca de 5 cm de comprimento), que contém um tampão de cateter, na sua extremidade (figura 2D). </li><li> Aumenta o fluxo a uma taxa de fluxo final 1-5 ul / min. As taxas de fluxo podem variar dependendo do meio e a estirpe de levedura. </li><li> Iniciar um filme com as configurações de microscópio e câmera adequada para o objetivo do experimento. Certifique-se de que a velocidade da platina do microscópio está configurado para uma velocidade tão baixa que o óleo pode seguir. Para a determinação do tempo de vida replicativo, as células da imagem a cada 10 min. Para proteger as células a partir das quantidades diminutas de luz UV emitida pela halogéneolâmpada, que é utilizado durante a aquisição de DIC, é aconselhável colocar um filtro UV adicional no caminho da luz. Ao usar a microscopia de fluorescência, é preferido que as células da imagem com menor frequência (por exemplo, a cada 20 minutos), para evitar os efeitos fototóxicos. O ensaio é concluído quando todas as células carregadas no início da experiência são mortos, o que em condições normais de demora até 5 dias. Recomenda-se verificar regularmente o foco das imagens durante o experimento e, se necessário ajustá-lo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. 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B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método de microfluídica aqui descrito é uma nova ferramenta importante na pesquisa do envelhecimento, uma vez que permite a geração simples e automatizado de dados expectativa de vida replicativo fermento em combinação com imagens de alta resolução contínua. Estes atributos são importantes melhoramentos em relação às possibilidades experimentais do método de dissecação clássico, ainda existem algumas limitações do método, que devem ser tidos em conta. Note-se que o tem...

Brotação de levedura é um organismo modelo importante para o envelhecimento investigação 1. Até recentemente, o estudo de envelhecimento replicativo em células de levedura era um processo laborioso que requer um método de esvaziamento, em que cada botão era removido manualmente a partir da célula mãe 2,3. Para resolver este problema, que recentemente apresentou um novo configuração microfluídicos capaz de rastrear células mãe individuais ao longo de toda sua vida útil 4. Em nosso chip de microfluídica, células de levedura são presos sob micropads suaves à base de elastómeros (ver Figura 1). Um fluxo contínuo de meio de lava filha células recém-formadas e fornece as células com nutrientes frescos. Numa única experiência, até 50 células-mãe pode ser monitorizado de uma maneira completamente automatizada em todo o seu tempo de vida replicativo. Devido às excelentes propriedades ópticas do chip de microfluidos, é possível monitorizar simultaneamente diferentes aspectos da biologia das células de levedura (por exemplo, </em&gt; usando proteínas fluorescentes). Comparado com o método clássico de dissecção, a configuração de microfluidos proporciona vantagens substanciais. Ela garante um ambiente definido e constante durante todo o experimento de envelhecimento. Não requer nenhum equipamento especializado caro e pode ser executado em qualquer microscópio equipado com foco automático e capacidade de lapso de tempo, bem como de controle de temperatura para o cultivo celular. A produção e operação dos chips microfluidicos podem ser aprendidas dentro de poucos dias. Além disso, as células podem ser carregadas directamente a partir de uma cultura em crescimento exponencial, uma vantagem sobre um outro método de microfluidos recentemente publicado em 5, que requer a biotinilação das células-mãe. Combinado com uma imagem de alta resolução, o método aqui descrito pode ser usado para medir as alterações graduais na morfologia celular, expressão de proteína de levedura e localização durante o envelhecimento de uma forma sem precedentes. A capacidade paramonitoramento de longo prazo de células individuais também oferece possibilidades únicas para estudos do ciclo celular de levedura. um Este método foi recentemente optimizado para remover a biotinilação do protocolo de 16, que foi publicada durante este manuscrito foi em avaliação.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

Nós demonstramos a utilização de uma configuração de microfluidos simples, no qual as células de levedura de brotamento individuais podem ser rastreados em todo o seu tempo de vida. O chip de microfluídica explora a diferença de tamanho entre as células mãe e filha usando uma matriz de micropads. Após a carga, as células são presos debaixo destas micropads, porque a distância entre o microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (3-4 mm). Após o procedimento de carregamento, meio de cultura é continuamente perfundido através do chip, o que não só cria um ambiente constante e definida ao longo de toda a experiência, mas também elimina as células filhas emergentes, que não são retidas por baixo das almofadas, devido ao seu menor tamanho. A configuração retém células mãe tão eficientemente que numa única experiência de até 50 células individuais podem ser monitorizados de um modo totalmente automático, durante 5 dias, ou, se necessário, mais longo. Além disso, as propriedades ópticas excelentes do chip permitir altaResolução de imagem de células durante todo o processo de envelhecimento.

Neste protocolo, as células são carregadas para o chip de microfluidos directamente da cultura de meio-exponencial. Para determinar se a distribuição da idade das células aprisionadas no chip microfluídico é semelhante à da cultura antes do carregamento, as células foram coradas com aglutinina de trigo conjugada com FITC (WGA-FITC) para visualizar cicatrizes bud. Como pode ser visto na Figura 3, o aprisionamento de células sob as micropads do chip de microfluidos não é enviesada para as cél...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K visualizações.  University of Groningen. Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.

Vídeo: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

De alta resolução padronização usando dois modos de Jet Electrohydrodynamic: queda na demanda e campo próximo eletrofiação

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

PDawn-Ag43 modelado usando de deposição de biofilme em alta resolução

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...