Agradecemos Drs. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare e Tovi Lehman para a leitura crítica dos manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa Intramural da Divisão de Pesquisa intramuros, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, dos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Programa Nacional de Pesquisa 973 Básico da China, # 2007CB513103. Agradecemos a NIAID intramural editor Brenda Rae Marshall para a assistência.

Técnicas de assepsia devem ser aplicados a todos os materiais que serão administrados em animais para evitar a introdução inadvertida de agentes infecciosos exógenos em camundongos que podem confundir os resultados experimentais. 1. Infecção de ratos de laboratório com sangue Parasitas estágio Malária <ol><li> À temperatura ambiente, descongelar dois frascos contendo o sangue congelado parasitas da malária etapa a ser atravessada. Neste exemplo, duas cepas de roedores parasita da malária Plasmodium utilizados são yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii. </li><li> Fit uma seringa com uma agulha de calibre 22-30 (G) e elaborar 400 mL de estéril, de grau farmacêutico PBS (pH 7,4). </li><li> Usando a mesma seringa, elaborar 100 L de sangue descongelados infectados; inverter a seringa para cima e para baixo até que o conteúdo é homogeneamente misturados. (Opcional: uma pipeta pode ser usado para transferir PBS e sangue infectado em um tubo de coleta antes de transferir para uma seringa para injeção). </li><li> Injetar 200 mL contendo solução de parasita diretamente no peritônio de um mouse. Quando terminar, descarte a seringa em um recipiente para objectos cortantes. (Veja também materiais complementares para manutenção de ratos de laboratório). Em geral, o tamanho padrão do inóculo é entre 100-500 mL, dependendo dos níveis de infecção parasitária nos materiais originais congelados. </li><li> Injetar a duas cepas do parasita a ser atravessado em dois camundongos cada. Camundongos se tornará positivo microscopicamente 3 a 5 dias após as injeções. Parasitemias, quando chegar entre 1-5%, continue para a próxima etapa. </li></ol> 2. Infecção Clone misto de Ratos <ol><li> Antes da infecção clone mista, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico de esfregaços de sangue corados Giemsa fino (Fig. 3), e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades) . </li><li> Calcular o volume de um soro fisiológico (1,5% w / v citrato trissódico, 0,85% w / v de cloreto de sódio) e do sangue do mouse necessários para produzir uma mistura de inóculo, utilizando a parasitemia e vermelho sangue medições de densidade de células obtidas anteriormente. </li><li> Ajuste a solução de parasita para uma concentração final de um milhão de glóbulos vermelhos infectados por 100μl. </li><li> Combine o sangue infectado de dois doadores na proporção de 1:1 para obter um inóculo misto clone. Quando os dois clones parentais diferem em taxa de crescimento, ajustar as proporções de um. Mais rápido crescimento dos pais para um clone de crescimento mais lento dos pais para 1:2 ou 1:5 </li><li> Injectar 100 mL da amostra misturada em peritônio de cada rato para ser infectado. (Ver também passo 3,9 para determinar o número de ratos a ser injetado) </li><li> Usando este método, infectar dois ratos, cada um com as cepas única parental. As infecções de um único clone vai permitir a determinação da transmissão de sucesso das duas estirpes parentais. </li></ol> 3. Os mosquitos alimentação <ol><li> Prepare três gaiolas contendo 300-500 adultos (machos e fêmeas) Anopheles stephensi mosquitos cada, idade pós-emergência 5-7 dias a partir de pupas. Os recipientes são cobertos com panos seguro por um plástico ou tampa de metal. Duas gaiolas são para se alimentando de clones parental; a gaiola terceiro é para a preparação de um cruzamento genético. </li><li> Começando quatro dias após a infecção mista-clone, prepare Giemsa-manchada manchas cauda fina de sangue dos camundongos infectados. </li><li> Examine os esfregaços sob um microscópio de varredura por pelo menos 50 campos microscópicos, aumento de 1000x e determinar se gametócitos masculinos e femininos estão presentes. </li><li> Gametócitos masculinos e femininos são reconhecíveis, devido à presença de grandes grânulos vacúolo e grandes (Fig. 3). Gametócitos masculinos e femininos têm citoplasma rosa e azul, respectivamente. Se gametócitos estão presentes, siga passo 3.6. </li><li> Se gametócitos estão ausentes, manter acompanhamento diário até que eles apareçam. Se gametócitos estão presentes, continue o passo seguinte. </li><li> Injetar 50 mL de anestésico cocktail de drogas contendo 33 mg / mL de ketamina e 3 mg / mL de xilazina no peritônio de um rato para anestesiar cada rato infectado (por 20 gramas de peso corporal do rato). Última dose de quetamina e xilazina é 82,5 e 7,5 mg / Kg, respectivamente. </li><li> Coloque os ratos viradas para baixo no topo de uma gaiola contendo mosquitos adultos Anopheles stephensi que foram privadas de abastecimento de açúcar por 24 horas e permitir que os mosquitos se alimentam por 30 minutos sem interrupção. </li><li> Manter os mosquitos em um insetário sob condições padrão (temperatura é mantida entre 24-26 ° C; também ver Métodos complementares para a manutenção do laboratório de mosquitos). </li><li> Use um mouse infectados para cada 5-10 mosquitos fêmeas. Eutanásia os ratos imediatamente por deslocamento cervical após a alimentação, enquanto os ratos estão ainda sob anestesia. </li></ol> 4. Midg Mosquito dissecaruts e oocistos Contagem <ol><li> Nove dias após a alimentação, os mosquitos serão examinados para oocistos no intestino médio do inseto. A presença de oocistos na mosquitos que se alimentam de um único clone camundongos infectados indica que gametócitos das duas estirpes parentais são infecciosos. </li><li> Para dissecar um intestino médio do mosquito, use um aspirador ligado a um pequeno recipiente para coletar 5-10 mosquitos infectados da jaula. </li><li> Usando gás CO 2, anestesiar os mosquitos e transferi-los para uma placa de Petri de vidro em gelo. Separar e descartar mosquitos machos. As antenas dos machos são visivelmente bushier em comparação com as fêmeas. </li><li> Preencher duas seringas com PBS e encaixá-los com 26 gauge de meia polegada (G ½) agulhas. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro. </li><li> Transferência 5-10 anestesiados mosquitos fêmeas para a gota de PBS e colocar o slide em um microscópio de dissecação. </li><li> Usando a mesma agulha, remova cada mosquito asas e pernas e, em seguida, mantendo o inseto no abdômen, tórax posterior e, puxe o corpo sem até que o intestino médio, um corpo de saco branco, é liberado. Destacar o intestino médio e descartar o resto do corpo. </li><li> Adicionar PBS mais no intestino médio se os slides estão secos. O intestino médio vão se degenerar se deixe secar. Coloque uma lamínula sobre o intestino médio. </li><li> Examinar o intestino médio em microscópio de luz com uma ampliação de 100x. Contar o número de oocistos em cada intestino médio (Fig. 3). Oocistos são reconhecidas como de espessura de parede estruturas circulares que se encontram na superfície externa dos intestinos. </li><li> Quando terminar, jogue de seringas, agulhas, e deslize em uma lata de farelos. </li><li> Se oocistos são ausentes no intestino médio, alimentar os mosquitos com camundongos infectados com o maior número de gametócitos e dar um tempo mais longo de alimentação. Temperatura é fundamental para esta etapa. Certifique-se que a temperatura é de 24 a 26 ° C. </li></ol> 5. Coleta de esporozoítos de mosquitos por centrifugação <ol><li> Prepare tubos de coleta esporozoíto da seguinte forma: corte a tampa de um tubo de centrífuga de 0,5 mL limpo e faça um furo (0,1-0,2 mm de diâmetro) na parte inferior do tubo usando uma agulha G flamed 19. </li><li> Preencha 1 / 3 do tubo com lã de vidro. Insira o tubo de filtro para um tubo de coleta de 1,5 mL (um tubo é suficiente para colheita de esporozoítos ~ 100 mosquitos) </li><li> No dia da alimentação pós-17, coletar mosquitos (Etapa 4) das gaiolas em um pequeno frasco com um aspirador. </li><li> Uso do gás CO 2 para anestesiar os mosquitos. </li><li> Separar as fêmeas dos mosquitos do sexo masculino. Transferir os mosquitos anestesiados feminino do recipiente para uma placa de Petri de vidro em gelo. </li><li> Prepare duas seringas com agulhas 26 G ½ cheio de PBS. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro. </li><li> Transferir os mosquitos em uma lâmina de microscópio. Retire a cabeça dos mosquitos, as asas, pernas e abdômen com um microscópio de dissecação. </li><li> Usando uma pinça de ponta fina transferir o tórax em 0,5 mL de PBS em um homogeneizador de 1,5 mL (pilão). Armazenar o tórax no gelo (esporozoíto permanece infectante por 2-3 h). </li><li> Homogeneizar o tórax no gelo para liberar esporozoítos das glândulas salivares (ver Figura 3), e transferir os lisados ​​(homogeneizados) para dentro do tubo preenchido com lã de vidro (Passo 5,1-5,2), utilizando uma pipeta de vidro. </li><li> Centrifugar por 10 a 20 segundos a 1000 rpm em temperatura ambiente. </li><li> Recolher o fluxo através de (a suspensão esporozoíto purificada) usando uma seringa com uma agulha G 22-30. (Opcional: queda de 10-50 mL do fluxo através de uma lâmina de microscópio, coloque uma tampa de deslizamento e visualizar os esporozoítos viver sob um microscópio de luz padrão, 400X ampliação, ver também Fig. 3) </li><li> Injetar 0,1-0,5 mL ip da suspensão esporozoíto em camundongos (até 200.000 parasitas podem ser colhidas a partir de um único mosquito, ver ref 12). Em um caso bem sucedido, o animal infectado 72 horas após a injeção. </li></ol> 6. Progeny clonagem usando diluição Limitada <ol><li> Setenta e duas horas após as injeções esporozoíto, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico após Giemsa coloração de sangue fino e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades). </li><li> Escolha um rato mostrando uma parasitemia 0,1 a 1% e cujos glóbulos vermelhos infectados contêm parasitas maioria simples como um doador para o procedimento de clonagem. Repita o passo 6,1 dia seguinte, se os ratos são microscopicamente negativo. Se os animais não estão infectados dentro de 14 dias, repita o Passo 2 a 5 e determinar a presença de esporozoítos no passo 5.11). </li><li> Diluir o sangue colhido da cauda em uma solução fria 1:01 de solução Ringer bezerro soro e mamíferos de (2,7 mM de cloreto de potássio, cloreto de cálcio 1,8 mM, 154 mM cloreto de sódio), de modo a atingir um conconcentração de 0,6 a 1 glóbulo vermelho infectado por 100 mL, e armazenar o inóculo no gelo. Desta forma, a maioria do mouse indivíduo deve receber um ou zero parasitas. </li><li> Por via intravenosa, injectar 100 mL de sangue infectado diluído em cada um dos 5-10 ratos. </li><li> Cinco a sete dias depois, a tela do camundongos para a presença de parasitas no sangue estágio examinando Giemsa-manchada esfregaços de sangue fina. Em um experimento bem sucedido, 20-50% dos camundongos infectados e mostrará parasitemia de 0,1-5,0% no dia após a infecção 8. </li></ol> 7. Caracterização da Progeny usando Marcadores Genéticos <ol><li> Coletar 20-40 mL de sangue da cauda do rato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contém 0,2 mL de solução de citrato refrigerados salina fisiológica, brevemente vortex e centrifugar por 3 min a 3000 rpm em temperatura ambiente para agregar as células do sangue. Extrair DNA imediatamente ou manter o pellet a -80 ° C. </li><li> Prepare DNA do parasita usando qualquer padrão de métodos de extração de DNA. Para o isolamento rápido de DNA, usar um modelo de alta Pure PCR preparação kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Progênie recombinante são identificados após genotipagem utilizando microssatélites (MS) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em cromossomos diferentes que podem diferenciar as duas estirpes parentais da cruz genética. Um método simplificado utilizando primers fluorescentes único marcado para MS genotipagem de P. yoelii pode ser utilizado (ver ref 8,9). </li></ol> 8. Criopreservação de parasitas da malária do sangue estágio <ol><li> Coletar 0,5-1 mL de sangue infectado por punção cardíaca a partir de um rato anestesiado com parasitemia de 5-20% em 50-10 mL refrigeradas solução salina fisiológica. </li><li> Centrifugar por 5 min a 2000 rpm em temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicione gota a gota, o volume 2x de Glycerolyte solução 57 (Fenwal Laboratories) para pelotas de sangue e misture bem. </li><li> Transferir a suspensão para criotubos (0,2-0,5 mL por tubo). </li><li> Armazenar o sangue criopreservados a -80 ° C (até 1 mês) ou em nitrogênio líquido. </li></ol> 9. Resultados representativos: Em uma experiência bem sucedida, 5-10% das linhas clonadas serão progênie recombinante independente. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A representação esquemática do ciclo de vida e eventos de recombinação genética durante um cruzamento genético. Eventos de recombinação genética ocorrem durante a fase inicial de desenvolvimento do mosquito. Após a fecundação de &quot;haplóide&quot; gametas masculinos e femininos de diferentes origens genéticas no intestino médio do mosquito, &quot;diplóide&quot; zigotos são formadas. O zigoto constitui a fase diplóide apenas do ciclo de vida do parasita; meiose segue dentro de 12 horas de fecundação, e todas as fases subsequentes do mosquito e mamíferos permanecem haplóides. Os zigotos resultantes desenvolver em ookinetes e oocistos. Crescimento e divisão mitótica de cada oocisto produz milhares de esporozoítos, que são liberados na hemoceal mosquitos. Os esporozoítos que migram para as glândulas salivares estão em posição de ser transmitido a um hospedeiro mamífero, onde o desenvolvimento do fígado e estágios de glóbulos vermelhos ocorre. Durante o curso dos ciclos de células vermelhas do sangue, alguns parasitas podem se diferenciar em madura gametócitos masculinos e femininos. O ciclo de vida do parasita se completa quando esses gametócitos são captados por um outro mosquito de transmissão, perpetuando. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Herança de genes nucleares em parasitas da malária e produção de progênie recombinante. Recombinação genética pode ser gerado através de rearranjo cromossômico ou por eventos crossover. Progênie homozigota produzido por autofecundação entre gametas de um mesmo clone parental 1 ou 2 (A e D), respectivamente. B) progênie heterozigóticas produzido por fertilização cruzada entre os gâmetas de dois diferentes clones dos pais, núcleos recombinante (ovais azuis) sendo formado por rearranjo cromossômico sozinho. C) progênie heterozigóticas produzido a partir de fertilização cruzada entre os gametas dos dois clones pai diferente, núcleos recombinante (ovais vermelho) sendo formada por crossovers entre as cromátides não-irmãs dos cromossomos homólogos. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Morfologia do parasita da malária Plasmodium roedores yoelii. A) fase de anel, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoítos, E) gametócitos macho imaturo, F) gametócitos maduros do sexo masculino, G) gametócitos femininos imaturos, H) gametócitos maduros do sexo feminino, I) do intestino médio com oocistos no post dia 10 alimentação (oocistos maduros indicado por setas; aumento de 200x), J) mosquito glândulas salivares (100x), K) esporozoítos (400x de ampliação).

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Demonstramos as técnicas para a produção de um cruzamento genético no roedor da malária Plasmodium yoelii, que também é aplicável à produção de cruzamentos genéticos em malárias outros roedores. Infecções de camundongos com único clones parentais são normalmente realizados para determinar a transmissão bem sucedida dos parasitas dos pais para garantir que os pais são competentes em produzir gametas funcionais antes de realizar uma cruz. Transmissão bem-sucedida a...

MATERIAL SUPLEMENTAR: <ul><li> Manutenção de ratos de laboratório </li><li> Manutenção do laboratório de mosquitos </li><li> Exame microscópico de esfregaços de sangue corados com fina Giemsa </li><li> Medição da densidade dos glóbulos vermelhos </li></ul> Manutenção de ratos de laboratório Fêmeas de linhagem puras de laboratório camundongo BALB / c, com idades entre 5 a 8 semanas de idade, são usados ​​no estudo. Os ratos são alojados em um padrão sólido de policarbonato gaiola inferior com fio de bar-tampa, equipada com alimentador e uma garrafa de água. Os ratos são mantidos a uma temperatura constante (25 ± 1 ° C) em 12:12 horas luz: ciclo escuro. Ratos são permitidos para se alimentar de 2018S Teklad global Harlan 19% de proteína da dieta de roedores extrudados (esterilizável; de Harlan-Teklad) e é fornecido com acidificados ad libitum de água potável. Experiências com animais são realizadas em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Comissão Animal Care e Uso do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas sob o protocolo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Manutenção do laboratório de mosquitos Os mosquitos são de uma colônia de laboratório de raça de Anopheles stephensi. Os adultos são mantidos em gaiolas de nylon mantido em uma temperatura e sala com controle de umidade (23 a 25 ° C por Plasmodium chabaudi yoelii e Plasmodium, e 19 a 21 ° C para o Plasmodium berghei, 80-95% de umidade; em 12:12 horas de luz: ciclo escuro). Mosquitos adultos são alimentadas com glicose a 10% e 2,00% ácido para-aminobenzóico (PABA) solução de água suplementada. Para obter alta qualidade adultos, 500 larvas são cultivadas em uma condição de baixa densidade em 1 L de água destilada em uma de 1.000 cm 3 prato aberto fornecido com aproximadamente 1 mg de bicarbonato de sódio. Após a eclosão, as larvas são dadas TetraMin pó (PETCO) até que eles desenvolvem para a fase pupa e são transferidos para as gaiolas mosquito adulto para emergentes. Exame microscópico de esfregaços de sangue corados com fina Giemsa Usando a tesoura limpa cortando a ponta (1,0 mm) da cauda do rato infectado. Coloque uma gota (0,5-1,0 mL) de sangue da cauda para uma lâmina de espécime limpo. Mouse irá parar o sangramento em 1-2 min. Coloque um slide spreader limpa no topo da gota de sangue, mantendo-a em um ângulo de 45 ° em relação à lâmina da amostra, e permitir que o sangue a absorver a toda a largura do difusor. Segure a lâmina da amostra e avançar o slide spreader rapidamente e sem problemas para produzir um esfregaço fino. Deixe o filme de sangue seco, e, em seguida, mergulhe os slides em metanol absoluto. Permitir que o slide para o ar seco mais uma vez antes cobrindo-o com Giemsa (10% Giemsa corante em água destilada). Depois de incubar os filmes finos de sangue por 10-15 min em temperatura ambiente, cuidadosamente lavar as lâminas com água da torneira e deixe secar. Examine o número de glóbulos vermelhos infectados (iRBC; veja a Figura 3 para a morfologia da RBC infectados) sob um microscópio de luz com óleo de imersão em aumento de 1000x (com lente de 100x objetiva) e parasitemia calcular (o número de iRBC por 100 RBC contados). Diferentes cepas de parasitas da malária variam em taxa de crescimento e patogenicidade. Monitoramento de parasitemias estágio de sangue pode ser realizada 24 horas após as injeções, dependendo da dose do sangue parasitas da malária palco. Por exemplo, os ratos serão microscopicamente positiva 24 hrs, quando injetados com 10 7 infectados intraperitonealmente RBC ou RBC 10 6 infectados por via intravenosa. Medição da densidade dos glóbulos vermelhos Como os níveis de parasitemias, glóbulos vermelhos densidade (RBC) em camundongos infectados varia ao longo do curso da infecção. Densidade RBC deve ser medido dentro de 1-2 horas antes do início da infecção simples e mista-clone e os experimentos de clonagem. Existem dois métodos para a medição da densidade do RBC: a contagem manual usando hemocitômetro de Neubauer e uma contagem automática usando um Cellometer (Nexcelom Bioscience). Em ambos os métodos, retirar 1 mL de sangue da cauda do rato através de um capilar de vidro (VWR) e diluir em 10 mL de PBS e misture bem. Para usar um hemocitômetro de Neubauer, carga de 20 mL da suspensão para o hemocitômetro. Coloque o hemocitômetro em um microscópio de luz com lente objetiva de 10x. O hemacitómetro contém uma grade dividida em 9 quadrados grandes, e 4 quadrados grandes no canto são divididos em 16 pequenos quadrados. Contar o número total de células em cada um dos 16 pequenos quadrados nas quatro esquinas. Para evitar a contagem preconceito ou contagem de células que se sobrepõem uma linha de grade, a contagem de uma célula como &quot;in&quot; se sobrepõe as linhas superiores ou para a direita e &quot;out&quot; se sobrepõe as linhas de baixo ou da esquerda. Estimar o número de células por uma pequena praça e dividir por 0,00625 (o volume de um pequeno quadrado é de 6,25 nL). Isso gera o número de células por microlitro (&amp;mu; L). A partir destes dados, calcular a densidade das células vermelhas do sangue finais multiplicando com 10.000 (fator de diluição). Lavar a lamínula e câmara de contagem com água destilada e etanol 70%; ar seco. Alternativamente, carga de 20 mL da suspensão sobre uma lâmina de câmara Cellometer contagem. Inserir o slide em uma câmara de corrediça Cellometer (o leitor). Inicie o software Cellometer, selecione a opção &quot;glóbulos vermelhos&quot; opção, e digite um fator de diluição de 10.000. Registre a densidade RBC.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variação na resposta a drogas antimaláricas e na patogenicidade do parasita da malária é de importância biológica e médica. Mapas de ligação tem levado à identificação de genes de sucesso ou loci subjacentes vários traços em parasitas da malária em roedores e seres humanos 1-3 4-6. O parasita da malária Plasmodium yoelii é uma das espécies de malária muitos isolados de roedores silvestres Africano e foi adaptado para crescer em laboratórios. Esta espécie se reproduz muitas das características biológicas dos parasitas da malária humana; marcadores genéticos, tais como microssatélites e amplificado comprimento de fragmentos polimorfismo (AFLP) marcadores também têm sido desenvolvidos para o parasita 7-9. Assim, estudos genéticos em parasitas da malária em roedores podem ser realizadas para complementar a pesquisa sobre o Plasmodium falciparum. Aqui, nós demonstrar as técnicas para a produção de um cruzamento genético em P. yoelii que foram pela primeira vez foi pioneira pelos drs. David Walliker, Richard Carter, e colegas da Universidade de Edimburgo 10. Cruzamentos genéticos em P. yoelii e outros parasitas da malária em roedores são conduzidas por infectando camundongos Mus musculus com um inóculo contendo gametócitos de dois clones geneticamente distintos que diferem em fenótipos de interesse e permitindo que mosquitos se alimentam de camundongos infectados quatro dias após a infecção. A presença de gametócitos masculinos e femininos no sangue do rato é microscopicamente confirmada antes da alimentação. Dentro de 48 horas após a alimentação, no intestino médio do mosquito, os gametócitos haplóides diferenciam em gametas masculinos e femininos, fertilize, e formar um zigoto diplóide (Fig. 1). Durante o desenvolvimento de um zigoto em um ookinete, meiose parece ocorrer 11. Se o zigoto é obtido através de fertilização cruzada entre os gametas dos dois parasitas geneticamente distintos, o intercâmbio genético (recombinação cromossômica e cross-overs entre as cromátides não irmãs de um par de cromossomos homólogos;. Fig. 2) pode ocorrer, resultando em recombinação de material genético de loci homólogos. Cada zigoto sofre sucessivas divisões dois nuclear, levando a quatro núcleos haplóides. Um ookinete desenvolve em um oocisto. Uma vez que os oocistos amadurece, milhares de esporozoítos (a descendência da cruz) são formados e libertados em hemoceal mosquito. Esporozoítos são colhidas das glândulas salivares e injetado em um novo hospedeiro murino, onde o desenvolvimento fase pré-eritrocítica e eritrocitárias ocorre. Formas eritrocitárias são clonados e classificados em relação aos personagens distinguir os genitores antes de mapas de ligação genética. Controle de infecções individuais clones parentais são realizadas da mesma forma como a produção de um cruzamento genético.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos de<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; E é aplicável a outros parasitas da malária em roedores.

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K visualizações.  National Institutes of Health. Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos de Plasmodium yoelii E é aplicável a outros parasitas da malária em roedores.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantificação de crescimento intracelular dentro de macrófagos é um rápido e confiável método para avaliar a virulência de Leishmania parasitas

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...