Atualmente temos uma compreensão limitada da biologia da infecção hepática por plasmódio. Esse protocolo nos ajudou a gerar muitas linhagens transgênicas que ajudaram a responder algumas questões críticas sobre a biologia do organismo. Uma compreensão fundamental do parasita e de sua biologia é necessária para desenvolver novas ferramentas e abordagens para combater a infecção da malária.
O método de transgênese que estamos descrevendo aqui nos ajudou a decifrar algumas chaves e complexas da biologia do organismo, bem como do hospedeiro. Quem demonstrará esse procedimento será Carson Bowers, meu gerente de laboratório. Depois de gerar camundongos infectados por P.Bergehei e eutanasiá-los, colete dois mililitros de sangue de dois camundongos infectados em cinco mililitros de solução de Elsevier em um ambiente estéril.
Centrifugar o sangue a 450 G durante oito minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio RPMI completo. Centrifugar novamente a suspensão celular e ressuspender o pellet em 25 mililitros de meio RPMI completo.
Transferir a suspensão celular para um balão de cultura T75 com tampa filtrante e incubar com agitação suave para manter as células em suspensão. Ao final da incubação, coletar 500 microlitros da amostra. Centrifugar e ressuspender o pellet em 10 microlitros de meio RPMI completo.
Em seguida, prepare um esfregaço de sangue fino. Manchar o esfregaço de sangue com coloração de Giemsa e determinar a frequência de esquizontos. Para uma eficiência de transfecção ideal, 60 a 70% dos parasitas devem estar no estágio esquizonto.
Prepare um tampão de centrifugação de gradiente reconstituindo 13 mililitros de meio estoque de gradiente de densidade em um tubo de centrifugação de 50 mililitros. Transfira 25 mililitros de hemocultura para um tubo de centrifugação fresco de 50 mililitros. Em seguida, coloque cuidadosamente 20 mililitros de tampão de centrifugação de gradiente no fundo do tubo de centrifugação, usando uma pipeta de vidro estreita para criar uma coluna de gradiente e garantir uma divisão clara entre o buffer e a mídia.
Centrifugar o tampão e o meio preparados durante 20 minutos a 450 G sem pausa à temperatura ambiente. Usando uma pipeta de pastagem, remova cuidadosamente a camada de esquizonto na interface do meio de cultura e o tampão de centrifugação gradiente. Coloque-o em um novo tubo de centrifugação de 50 mililitros.
Ressuspenda os esquizontos isolados em meio RPMI completo e aumente o volume total para 40 mililitros. Após centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspenda o esquizonto em 10 mililitros de meio RPMI completo. Em seguida, transfira um mililitro desta solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada transfecção e pastilha as células infectadas por centrifugação a 16.000 G por cinco segundos.
Em seguida, combinar 100 microlitros do tampão de eletroporação à temperatura ambiente com cinco microgramas de DNA plasmidial alvo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Depois de centrifugar as células infectadas, remova o sobrenadante e ressuspenda cuidadosamente as células na solução preparada de nucleoefector mais DNA plasmidial. Em seguida, transfira a suspensão para eletroporação, cubetas e transfect usando um programa nucleofector adequado.
Em seguida, adicione 100 microlitros de mídia RPMI completa à cubeta. Transfira toda a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e coloque-a no gelo. Verificar os níveis de parasitemia nos camundongos inoculados com o esquizonto transfectado diariamente a partir de dois dias após a inoculação.
Uma vez confirmada a infecção, iniciar a seleção medicamentosa administrando-a por via oral e bebendo água oferecida ad libitum. Monitorar a parasitemia usando esfregaços sanguíneos a partir de seis dias após o início do tratamento com pirometamina. Quando a parasitemia atinge pelo menos 1%, transfira os parasitas para camundongos B6 ingênuos para criar estoques de parasitas em estágio sanguíneo.
Quando a parasitemia atinge 2% a 5%, gere estoques e criopreze-os. Um dia antes da infecção do mosquito, separe as fêmeas de mosquitos colocando uma luva cheia de água aquecida a 37 graus Celsius em cima da gaiola contendo mosquitos machos e fêmeas. Use um aspirador de insetos para remover as fêmeas de mosquitos atraídas pela fonte de calor e transferi-las para uma gaiola menor para infecção.
No dia da alimentação e infecção do mosquito, determinar a parasitemia nos camundongos B6 infectados. Parasitemia entre 2% a 5% é ideal para a infecção do mosquito. Após a verificação da parasitemia, transferir a infecção para as fêmeas de mosquitos colocando os camundongos anestesiados sobre as fêmeas de mosquitos enjauladas sob decúbito esternal.
Espalhe manualmente as patas dianteiras e traseiras para fornecer a maior área de superfície para a alimentação do mosquito. Deixe os camundongos infectados em cada gaiola por 15 minutos, verificando a cada cinco minutos para garantir que os camundongos não estejam acordados. Assim que a alimentação estiver completa e os camundongos forem eutanasiados, descarte-os com segurança seguindo as orientações da instituição.
Para verificar o sucesso da infecção dentro dos mosquitos, isole o intestino médio dos mosquitos removendo o segmento abdominal terminal com fórceps 10 dias após a infecção. Em seguida, veja o intestino médio sob luz polarizada para detectar a presença de oocistos. Aos 18 dias pós-infecção, dissecar cinco a 10 mosquitos para avaliar o número de esporozoítos presentes.
Para isolar e contar os esporozoítos, remova cuidadosamente a cabeça do mosquito enquanto aplica pressão no tórax com pinça ou uma agulha de dissecação fina. As glândulas salivares permanecerão presas à cabeça removida. Em seguida, remova quaisquer restos adicionais de mosquito das glândulas salivares e coloque-os em um tubo de microcentrífuga contendo 400 microlitros de meios de dissecção do mosquito.
Em seguida, interrompa as glândulas salivares isoladas, passando-as através de uma seringa de agulha de calibre 30 15 a 20 vezes, Depois, coloque 10 microlitros das glândulas salivares rompidas no meio de dissecção do mosquito em um hemocitômetro e conte. Finalmente, ressuspenda as glândulas salivares na concentração desejada de meio de dissecção de mosquito ou PBS para injeção em camundongos ou criopreservação a longo prazo. Como a microscopia, são apresentadas imagens mostrando esquizont de P.berghei maduro e imaturo em hemoculturas de camundongos parasitados.
Como imagens de microscopia de uma cabeça de mosquito com as glândulas salivares ainda intactas durante a dissecção, e a glândula salivar dissecada sob aumentos inferiores e superiores são mostrados. A geração do sinal de fluorescência verde nas células PB, GFP 11 infectadas com HEPA GFP uma a 10 células do hospedeiro indicou a lise do vacúolo parasitóforo. É importante remover cuidadosamente a camada de chaisson sem interromper a interface de gradiente.
Além disso, é preciso um pouco de prática para remover de forma confiável as glândulas salivares junto com a cabeça durante o isolamento de luz dos esporos. Após o isolamento, os esporozoítos transgênicos podem ser criopreservados ou usados frescos para estudos de infecção in vivo ou in vitro.
