O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para análise genética funcional em Anopheles gambiae através de modificação genética da expressão genética de forma controlada espesso. O sistema binário permite flexibilidade em abordagens experimentais para caracterização fenotípica da expressão transgênica, mesmo que os custos severos de aptidão sejam induzidos. Este sistema pode ser usado para caracterização fenotípica de genes potencialmente envolvidos na resistência a inseticidas, transmissão de patógenos ou aqueles que têm usos em métodos de controle genético.
Fraser Coleman, um técnico de pesquisa, ajudará a demonstrar este procedimento Comece coletando pupas usando uma tubulação pasteur de plástico de três mililitros com a extremidade cortada em um prato plano claro adequado para uso com um microscópio estéreo. Remova cuidadosamente a maior parte da água ao redor da pupa. Ligue a lâmpada fluorescente e deixe aquecer.
Considere os padrões espáteis de cor de uma expressão e razão de diferentes fenótipos que são esperados ao triagem para marcador fluorescente. Selecione o filtro necessário no estereóscópio de fluorescência e verifique se há um feixe de luz colorido visível que é direcionado para o centro da placa de palco. Sob luz branca, centralize a pupa no campo de visão e os leve ao foco.
Ligue a luz branca e use o foco fino para colocar a área da pupae carregando o fenótipo de interesse com um padrão fluorescente visível em foco. Use um pincel de detalhamento fino para girar suavemente a pupae e mover as pás anais para que a genitália externa possa ser identificada. Pupae separada baseada em genitália externa distinta.
Os machos têm um tubo longo que extrude do segmento dorsal final aproximadamente metade do comprimento das pás anais. A genitália externa da pupa fêmea é consideravelmente mais curta e bifurcada. Separe o pupae sexed em grupos de 10 ou menos em tubos claros de 20 mililitros com água, e sele os tubos com uma bola de algodão.
Aspire o número desejado de adultos do sexo masculino e feminino dos tubos em uma gaiola ou balde pequeno, tomando cuidado para não danificar os adultos durante esta transferência. Mantenha a cruz por cinco a sete dias antes da alimentação sanguínea. No dia seguinte, os ovos podem ser coletados para estudar o desenvolvimento de embriões.
Monte a câmara de oviposition e introduza cuidadosamente 10 a 15 fêmeas alimentadas com sangue nela. Cubra a câmara de oviposição e deixe por 20 minutos. Retire cuidadosamente o tubo de polipropileno de 50 mililitros da panela de oviposição, certificando-se de não liberar os mosquitos.
Cubra a panela e permita que os ovos amadurecam até o estágio de desenvolvimento de interesse. Pegue ovos da panela usando um pincel de detalhamento fino e coloque-os na água em um bloco de vidro escavado de 40 milímetros. Remova cuidadosamente a água do bloco de vidro com uma micropipette e cubra ovos em 500 microliters da FAA.
Oscilar suavemente no agitador orbital à temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágue completamente os ovos 15 vezes com água destilada para remover todos os traços da solução FAA. Usando um suplemento de micropipette de 1000 microliter e, em seguida, remova um mililitro de água destilada de cada vez tomando cuidado para não danificar os ovos ao fazê-lo.
Cubra os ovos fixos com um mililitro de solução Trpis e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Os ovos começarão a desenvolver manchas pálidas após cinco minutos de incubação, eventualmente atingindo uma cor branca leitosa uma vez limpa. Enxágüe os ovos completamente 15 vezes com água destilada para remover todos os traços da solução Trpis.
A expressão de marcadores fluorescentes impulsionados pelo promotor 3xP3 é observada nos olhos e gânglios ventral de Anopheles gambiae pupae. O uso de diferentes marcadores fluorescentes coloridos permite a seleção e triagem de indivíduos modificados que carregam diferentes componentes GAL4 e UAS. Ao trabalhar com um sistema BIpartite GAL4-UAS, é necessário cruzar machos e fêmeas de diferentes cepas para adquirir prole carregando os componentes GAL4 e UAS.
A morfologia diferencial observada no genital externo masculino e feminino da pupaé é utilizada para o sexo. Um exemplo de pupae não identificável é destacado aqui. A remoção de toda a água da pupae, como é mostrado à direita, aumenta a dificuldade de sexing à medida que as pás anais obscurecem a visualização da genitália.
O sistema bipartite GAL4-UAS permite a modificação da expressão genética de forma espesso controlada. Isso pode ser visualizado cruzando o oenocito e o onipresente GAL4 quatro expressando linhas de motorista com a linha de resposta UAS-mCherry. Um benefício fundamental do uso de um sistema GAL4-UAS bipartido é a facilidade de estudar fenótipos letais mesmo na fase embrionária.
Para isso, é necessário visualizar a morfologia interna dos embriões. As características morfológicas normais observadas em diferentes estágios de desenvolvimento embrionário aos 12, 24 e 36 horas pós-colocação podem ser vistas após a conclusão do protocolo de compensação de embriões. É vital durante todo esse procedimento que pupas e ovos não possam dessecar.
Por isso, é importante trabalhar rapidamente na remoção de líquidos. O método GAL4-UAS permitiu caracterizar funcionalmente genes envolvidos na resistência a inseticidas e aqueles com usos potenciais em métodos de controle de acionamento genético.
