Gostaria de agradecer o Departamento de Pesquisa e Pós-Graduação para fornecer fundos para apoiar minha pesquisa e do Departamento de Medicina Comparativa de sua vigilância e assistência. Gostaria também de reconhecer o Departamento de Fisiologia, pelo seu apoio e orientação, bem como a estudantes e técnicos no meu laboratório por sua ajuda. Por último, gostaria de agradecer a meu mentor pós-doutoramento, Dr. Charles E. Murry, pela oportunidade de treinamento durante os quais eu aprendi a microcirurgia mouse.

<ol><li> Instrumentos cirúrgicos estéreis (Tabela 1) e 3 aplicadores &quot;ponta de algodão são colocados em uma underpad estéril. O esterilizador talão (Germinator 500) está ligado. </li><li> Camundongos (idade:&gt; 6 semanas; peso:&gt; 18g) são anestesiados com uma injeção ip de 20μl / g de BW tribromoetanol (250mg/kg; duração - cerca de 40 minutos). </li><li> Quando os ratos não respondem aos pés pitada, um lubrificante estéril (Lágrimas renovada) é aplicada para os olhos para protegê-los da dessecação e do lado esquerdo do peito é revestido com creme depilatório (por exemplo, Nair) para remover pêlos da pele. </li><li> O creme depilatório é lavado com água corrente quente e betadine / álcool swabbing é usado para desinfectar a área cirúrgica. </li><li> O mouse é colocado sobre uma almofada deltaphase quente isotérmica que é fixado a uma tabela de plexiglass. Cada membro é imobilizado com fita e uma linha grossa é colocada horizontalmente sob os dentes de cima para segurar a mandíbula superior no lugar. </li><li> A tabela é posicionada na vertical e uma luz de fibra ótica é brilhava diretamente sobre a região do pescoço para iluminação transesofágico. Isto exige a colocação precisa de tal forma que a abertura da garganta é visto como um orifício bem iluminado, permitindo assim que a traquéia para ser visualizado para facilitar a inserção do tubo de PE. </li><li> O tubo é então conectado ao ventilador (ligado a um 95% O 2 / 5% CO 2) para administrar ventilação com pressão positiva constante (TOPO ventilador; taxa de 125 respirações / min; pressão de pico inspiratório 10-12 cmH 2 O; nota * : As configurações variam de acordo com a tensão e gênero 1-3). Uma vez que a ventilação é confirmado pelos movimentos do tórax síncrona, a conexão é fixada ao bloco com fita para evitar a extubação durante a cirurgia. </li><li> Utilizando uma pinça dentada para puxar a pele para cima e longe do peito, uma lâmina de bisturi n º 10 estéril unida a um punho # 3 bisturi é usado para fazer uma incisão 1,5 centímetros na pele paralelamente ao esterno. </li><li> Microtesoura Vanna curvas são utilizadas para cortar os músculos peitorais e faça um pequeno furo no músculo intercostal. </li><li> Reta, microtesoura blunt são usados ​​para cortar três costelas. </li><li> Um espéculo oftalmológico pediátrico 9 milímetros é usada para retrair a caixa torácica. </li><li> Usando a pinça curva, puxar o pericárdio longe do coração e usar a pinça dentada gentilmente rasgá-lo aberto. </li><li> Usando o porta-agulha Castroviejo, um ponto seis milímetros cônico tópicos 08/03 a agulha de sutura 8-0 polietileno debaixo da descendente anterior esquerda da artéria coronária (ao longo do eixo do coração) perpendicular a ele. <ol><li> Para uma ligadura temporária que pode ser removido para a reperfusão cronometrados, um pedaço de 0,5 estéril de um centímetro PE90 é colocado sobre o coração em paralelo à artéria coronária. A sutura, que tem sido previamente enrolado sob a artéria coronária, é então ligado à tubulação. No momento em que está para ser lançado, a ligadura está solto. Isto pode ser repetido conforme desejado eo tempo de oclusão / reoclusão podem ser modificados 4. Dependendo da duração do protocolo e do tipo de anestesia utilizada, a suplementação pode ser necessária. </li><li> Para uma oclusão permanente, a ligadura atado sob a artéria coronária é simplesmente amarrado. Branqueamento e discinesia são aparentes e no final longo da sutura é cortado 10/05. </li><li> Para injeção intramiocárdica (s), uma seringa Hamilton estéril com uma agulha estéril calibre 30 chanfrada é introduzido na base do coração acima da área de lesão no lado direito da ligadura. A agulha é então avançado para a área de lesão e retiradas ligeiramente de modo que o bisel pode ser visto aproximadamente na zona de fronteira. Um pouco da solução na seringa (2-3μl) é injetado no coração e na agulha é mantida no lugar. A seringa é retirado outro 1-3mm eo restante da solução é injetada. A seringa é mantido no lugar até que a bolha que é formado pela solução se dissipa. A agulha é então removido. Se houver algum sangramento, um aplicador com ponta de algodão é suavemente pressionado no local de inserção da agulha até que o sangramento pare 5-7. </li></ol></li><li> Uma vez que as manipulações do miocárdio são completos, os afastadores de costela são removidos ea cavidade torácica é fechada com suturas de colchão usando 2-3 6-0 surgipro. </li><li> Dois-três suturas de colchão são feitas então para fechar os músculos peitorais, 1-3 gotas de 0,25% 01:10 marcaína em salina estéril (mouse 0.1ml/25g) é aplicada ao músculo e depois 2-3 suturas de colchão são feitas para fechar a pele. </li><li> O mouse é removido do ventilador. Uma vez que a respiração rítmica, rápida e superficial é verificada, o mouse pode ser extubado. </li><li> 0,5 ml solução salina estéril morna é injetado no espaço subcutâneo dorsal eo mouse é colocado sobre uma almofada de aquecimento em uma gaiola até que ele recupere a mobilidade (mínimo de 1 hora). </li><li> Para experimentos de sobrevivência, os ratos são colocados de volta em suas gaiolas e voltou para o viveiro até o momento do sacrifício. Durante os primeiros dois dias, o alimento é umedecidocolocado no chão da gaiola para facilitar a alimentação (para que eles não têm que chegar até o que pode causar dor) e buprenorfina deve ser administrada a cada 6-12h. Cuidados pós-operatórios também inclui monitoramento diário para a primeira semana para verificar a mobilidade adequada, higiene e hábitos alimentares. </li><li> Os instrumentos cirúrgicos são limpos com etanol e inserido no talão de esterilização antes da próxima cirurgia. </li><li> No momento do sacrifício, os ratos são anestesiados com pentobarbital sódico (65mg/ml; 55-65 mg / kg). Quando um plano adequado de anestesia é alcançado, a cavidade torácica é aberta. </li><li> Enquanto o coração ainda está batendo, uma seringa com uma agulha de calibre 23, contendo cloreto de potássio a frio (KCl, 30 mm) ou 2,3-butanedione monoxime (BDM; 10mM) é usado para perfurar a região posterior basal do ventrículo ea solução é lentamente injetado na câmara até que o coração está preso em diástole. </li><li> Uma vez que o coração é removido, uma seringa contendo PBS é usado para lavar retrogradamente perfundir o coração para remover todo o sangue que resta. Aguda para estudos, no final do período de reperfusão, o LAD é re-ligado no ponto original de oclusão. Uma solução contendo 1% de azul de Evan é injetado na aorta. Uma vez que o coração é extraído, é cortado transversalmente em 3 secções de igual espessura, incubados em 1% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio e fotografada para análise morfométrica 11. Para estudos crônica, o coração é então imerso em fixador, então processadas e incluídas de acordo com procedimentos de rotina. Lâminas podem ser coradas histologicamente e fotografada para análise morfométrica (usando Scion, NIH Image J, ou Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> Resultados representativos: Quando feito corretamente, a taxa de sobrevivência em camundongos (masculino: idade 8-10 semanas, 22-28g; feminino: idade 10-12 semanas, 20-26g) são: mais de 90% no infarto agudo de isquemia / reperfusão isquêmica e experimentos pré-condicionamento, sobre 85% em estudos de ligação permanente da artéria, e aproximadamente 80% para injectáveis ​​intramiocárdico. Como a lesão precoce é mais facilmente visível por alterações metabólicas e não estruturais, a determinação do tamanho do infarto em isquemia / reperfusão e isquemia experimentos pré-condicionamento é realizado através da infusão de 1% de corante Evan é azul para a aorta que perfundir o coração que não é fornecido pela LAD ( Figura 1A). Uma vez que o coração é removido e cortados transversalmente ao meio, o tecido é incubado em solução a 1% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio para medir o tamanho do infarto (Figura 1B). As áreas são medidos usando Scion ou NIH software de imagem que pode ser calibrado com um micrômetro fotografada com a mesma ampliação. Esses números são usados ​​para calcular a área em risco / ventrículo esquerdo e infarto do tamanho / área de risco 11. Diferenças tensão pode resultar em variações no peso corporal eo tamanho do coração e por isso deve ser tomado cuidado para normalizar essas medidas ao peso do coração, peso corporal, ou comprimento da tíbia para fins comparativos. Resultados da artéria permanente ligadura em bruto mudanças estruturais, tais como necrose, parede desbaste, e dilatação das câmaras. Comparação dos efeitos do tratamento e / ou tempo do tamanho do infarto e necrose em relação ao ventrículo esquerdo, área da câmara, parede septal do ventrículo esquerdo e espessura da parede livre no modelo de oclusão definitiva (Figura 2A) também pode ser medida usando Scion ou NIH imagem software. Colágeno com coloração picrosirius red / fast verde (Figura 2B) pode ser usado para medir a fibrose difusas que se correlaciona com os índices funcionais de 8-10 enrijecimento da parede. A imagem na Figura 3 representa a distribuição da solução 6ul (azul de Evan) injetado na zona de fronteira do coração após ligadura da artéria permanente. Note que ele prossegue na direção da lesão, bem como para a base e também transmuralmente. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Evan A. &#39;s Azul injetado na aorta antes da excisão. Esta imagem mostra as regiões perfundidas do coração (manchado) e da área obstruída (sem manchas). Evan B.&#39; s azul e coloração TTC após lesão de isquemia / reperfusão aguda. Esta é uma imagem representativa (20x) mostrando a distribuição de corante azul, que manchou o unoccluded regiões, bem como TTC coloração de tecido metabolicamente viáveis ​​(vermelho). Áreas de necrose não mancham e assim eles permanecem pálidos (esboçado). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. hematoxilina e eosina. Esta é uma imagem representativa (20x) de coloração H &amp; E de um coração de rato cortados transversalmente através da região do infarto de 4 dias pós-infarto do miocárdio (20x). A * denota necrose tecidual, setas apontam para tecido de granulação, RV = ventrículo direito e LV = ventrículo esquerdo. B. Picrosirius vermelho e verde rápido mancha. Esta é umaimagem representativa (20x) de picrosirius red / coloração verde rápida de uma secção transversal de coração de rato com 4 semanas pós-infarto do miocárdio. O citoplasma verde manchas e fibras de colágeno são vermelhos. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Evan de distribuição de corante azul mancha após injeção intramiocárdica 6ul. Esta é uma imagem representativa mostra a distribuição global e transmural de corante azul de Evan todo o coração após a injeção intramiocárdica 6ul na zona fronteiriça imediatamente após a ligadura da artéria coronária (12x).

Este protocolo foi aprovado por animais e está em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use na East Carolina University.

Doença cardíaca coronária continua a ser um epidemiologicamente e fiscalmente problema de saúde pública. Pesquisa básica considerável ainda é necessária para compreender os mecanismos pelos quais lesão e remodelação proceder e como terapêutica em potencial podem modular estes processos se eles estão a ser desenvolvida para uso clínico. Roedores são mais comumente usados ​​e da ampla gama de camundongos geneticamente modificados disponíveis torna essa espécie um modelo mais atraente. Embora existam diferenças entre ratos e outras espécies, há muitas vantagens em um modelo murino. Uso de um escopo simples dissecação ou lupa e condições bem iluminado permitir a vasculatura para ser facilmente visto (para anatomia detalhada da vasculatura, ver Salto-Tellez et al., 2004 13). Para reduzir o risco de mortalidade pós-operatória, é muito importante para evitar a ruptura navios de grande porte desde que o volume total de sangue de um rato 25g é inferior a 2 ml 14. No caso de sangramento excessivo ocorre, a aplicação de pressão suave ou cauterização identificar pode ser usado para parar o sangramento. Este procedimento também pode ser modificado em uma variedade de maneiras. Por exemplo, ratos podem ser anestesiados com isoflurano, ketamina / xilazina ou sódio pentobarbital e seleção apropriada é determinada pela duração do protocolo de 15-18. O reflexo toe pitada é o índice mais utilizado da profundidade da anestesia. Além disso, para melhorar a probabilidade de sobrevivência a longo prazo, alguns investigadores usam medicamentos antiarrítmicos como a lidocaína para reduzir a incidência de arritmias letais 19,20 no entanto, deve-se levar em conta que esta foi recentemente demonstrado ter propriedades anti-apoptótica em uma aguda modelo 21. Além disso, para reduzir a dor pós-operatória, analgésicos, como a buprenorfina pode ser administrada nas primeiras 48 horas após a cirurgia 3,16,17,22,23. Para manter a temperatura corporal durante a cirurgia (especialmente para os protocolos mais), uma sonda retal em série com uma almofada de aquecimento é muitas vezes usado no lugar do pad isotérmica. Para isquemia / reperfusão e / ou isquêmicos pré ou pós-condicionamento: a duração da oclusão (s) e reperfusão (s) podem ser alterados, por oclusão permanente, o tamanho do infarto pode ser modificado por ajustar a localização da ligadura; e para injectáveis ​​intramiocárdica (células por exemplo, proteínas), pode haver locais de injeção e 03/01 o volume por injeção pode ser de até 15 24 mL. Se as células estão a ser injetado, o calibre da agulha utilizada (geralmente 26-30) 5,25,26 deve ser escolhido com base no tamanho das células de modo que o diâmetro interno da agulha é grande o suficiente para evitar sheering. Para evitar confunde devido a processos inflamatório desencadeado pela cirurgia, alguns pesquisadores têm relatado usando um laço que é manipulado ex vivo para ocluir e reperfundi os corações em um rato tórax fechado a qualquer momento após a cirurgia 27-29. Mais recentemente, Gao et al. 30 demonstraram que a oclusão temporária e permanente pode ser realizada sem a necessidade de ventilação e de alguns laboratórios começaram a usar ultra-som para realizar fechado no peito intramiocárdico injeções 25,31. Desde o primeiro estudo a demonstrar a viabilidade da ligadura da artéria coronária em ratos foi publicado pela Johns e Olson em 1954 32, muitos outros adotaram este modelo e modificou-a para estudar vários aspectos da lesão miocárdica ea remodelação 3,33-45. A natureza de ratos em termos de tamanho, a capacidade reprodutiva, e as despesas comparativamente menos para a compra e manutenção tornam esta espécie uma ferramenta atraente para uma ampla gama de estudos fisiológicos e fisiopatológicos. Como a miniaturização da tecnologia para imagens em avanços vivo 46-49, bem como meios para executar e analisar genômica e proteômica em grande escala, a seleção da droga, a eficácia de terapias baseadas em células e / ou proteínas, bem como biomateriais 50-64, combinado com a gama crescente de manipulações genéticas oferecidas pelo onipresente ou tecidos específicos camundongos transgênicos ou mutante / knockout, o modelo murino de infarto do miocárdio, sem dúvida, continuará a ser uma ferramenta valiosa na avaliação de lesão cardíaca aguda e remodelação a longo prazo. Portanto, há um valor inquestionável em ser capaz de realizar esses experimentos de forma confiável e reprodutível.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Long Vanna Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-159</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; straight, 1x2 teeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel handle #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-64</td>
<td>#10 sterile blade</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps &#x2013; half curved serrated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>160-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>George Tiemann</td>
<td>105-410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Castroviejo Needle Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-1828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cook Eye Speculum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>18-63</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgipro II 8-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>VP-900-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolene 6-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Suture Express</td>
<td>8776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Germinator 500 Bead Sterilizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellpoint Scientific</td>
<td>65369-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deltaphase isothermal pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Braintree Scientific</td>
<td>39DP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe - 25&mu;l</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge beveled needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7803-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ventilator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kent Scientific</td>
<td>TOPO</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

51.7K visualizações.  East Carolina University. Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.

Vídeo: Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Medicina

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It is characterized by fluid retention, shortness of breath, and fatigue, in particular on exertion. Heart failure is a growing public health problem, the leading cause of hospitalization, and a major cause of mortality. Ischemic heart disease is the main cause of heart failure.
Ventricular remodelling refers to changes in structure, size, and shape of the left ventricle. This architectural remodelling of the left ventricle is induced by injury (e.g., myocardial infarction), by pressure overload (e.g., systemic arterial hypertension or aortic stenosis), or by volume overload. Since ventricular remodelling affects wall stress, it has a profound impact on cardiac function and on the development of heart failure. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is used to investigate ventricular remodelling and cardiac function post-myocardial infarction. This model is fundamentally different in terms of objectives and pathophysiological relevance compared to the model of transient ligation of the left anterior descending coronary artery. In this latter model of ischemia/reperfusion injury, the initial extent of the infarct may be modulated by factors that affect myocardial salvage following reperfusion. In contrast, the infarct area at 24 hr after permanent ligation of the left anterior descending coronary artery is fixed. Cardiac function in this model will be affected by 1) the process of infarct expansion, infarct healing, and scar formation; and 2) the concomitant development of left ventricular dilatation, cardiac hypertrophy, and ventricular remodelling.
Besides the model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery, the technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented in detail.

Heart failure is the leading cause of hospitalization and a major cause of mortality. A model of permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice is applied to investigate ventricular remodelling and cardiac dysfunction post-myocardial infarction. The technique of invasive hemodynamic measurements in mice is presented.

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by reduced blood supply to the heart, resulting in the loss of oxygen to and the ensuing necrosis of the heart muscle. The MI model has gained popularity for its use as a short-term ischemia-reperfusion model and a long-term permanent ligation model. Below, we describe a reliable method for the permanent ligation of the LAD. With mouse genetic engineering technology becoming more advanced, and with an increasing availability of quality murine surgical instruments, the mouse has become a popular model for MI surgeries. Our surgical model incorporates the use of an easily reversible anesthetic for the rapid recovery of the mouse; a minimally invasive endotracheal intubation without involving a tracheotomy; and a thoracentesis through the original thoracotomy site without creating an additional incision in the chest, as is done in some other methods, to effectively remove excess blood and air from the chest cavity. This method is comparatively less invasive than other methods, which dramatically reduces surgical and post-surgical complications and mortality and improves reproducibility.

Murine Left Anterior Descending LAD Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction

We provide a reliable method for left anterior descending artery (LAD) ligation in a mouse model. This method is comparatively less invasive than other methods, involving endotracheal intubation, a left-sided thoracotomy approach, and thoracentesis. This method can be used as a model for both acute and chronic myocardial infarction (MI).

Murino Descendente Anterior Esquerda (LAD) ligação da artéria coronária: um modelo melhorado e simplificado para Infarto do Miocárdio

Ischemic heart disease (IHD), or acute coronary syndrome (ACS), is one of the leading causes of death in the United States. IHD is characterized by ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...