우리는 TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS,이 연구를 지원하는 NSF에서 오클라호마 대학 (BZ)을하고 그랜트 (IOS - 1025556, BZ 및 RAB에)에서 내부 자금 감사드립니다. NIH 그랜트 (BZ에 RO1 NS060878가) 부분 RAB를 지원. RAB는이 연구의 초기 단계를 지원하는 브랜다 이스 대학에 수여 NIH NRSA (T32 NS07292) 교육 부여, 그리고 브랜다 이스에서 제프리 홀에게 수여 NIH 그랜트 (RO1 GM21473), 인정한다. 우리는이 프로젝트에 대한 그의 지속적인 encouragements에 대한 제프리 홀 주셔서 감사합니다. 우리는 욕조 P&gt; Gal80&gt; 변형으로 우리를 제공할 박사 크리스틴 스콧 감사합니다.

1. Drosophila 종자 <ol><li> Gal4 드라이버 : photoreceptor 세포의 Gal4을 표현 GMR - Gal4. </li><li> UAS 라인 Gal4 - 표현 세포에서 신경 변성의 원인이 UAS - MJD78Q (또는 UAS - polyQ). Gal4 - 표현 세포에 GFP를 표현 UAS - GFP. </li><li> FLP 라인 photoreceptors과 뇌 영역의 하위 집합에서 FLP을 표현 어이 - FLP. FLP의 두 사본 (FLP - IRES - FLP)를 포함하는 확장기 - 트랩 라인 아르 동부 표준시 - FLPx2 라인. 우리는 누구의 표현 패턴이 특징으로 아직 아르 ~ 1000 동부 표준시 - FLP 행 (봄 외., 2010), 생성했습니다. 여기, 우리는 애벌레와 어른 비행 중추 신경계 (CNS)에서 선택한 동부 표준시 - FLPx2의 표현 패턴의 특성을 설명합니다. </li><li> FLP 기자 yw, 굴지 P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997)를 통해 동부 표준시 - FLPx2의 표현 패턴을보고 굴지 P&gt; Gal4;&gt; CD2의 FLP - 중재 recombinational 절단시 UAS - GFP. </li><li> 두 보완 Gal80 - 변환 도구 터브 P&gt; Gal80&gt; (고든 &amp; 스콧 2009 년), constitutively 강력한 tubulin 프로 모터에 의해 구동 모든 조직에서 Gal80을 표현 플립 아웃 구축. FLP - 중재 재조합시&gt; Gal80가 정신이 나갔죠하고 Gal80 표현은에 종료 동부 표준시 - FLPx2 - 표현 티슈합니다. 터브 P&gt;&gt; Gal80 (봄 외., 2010), 그만 정상적인 조건 하에서 Gal80을 표현하지 않는 구조, 기능 플립. Gal80 표현에만있는 tubulin 프로 모터에 의해 설정되어 동부 표준시 - FLPx2 - 표현 FLP가&gt; 중지를 팅겨주는군요 및 Gal80에서 화나게하는 조직합니다. </li><li> 화합물 눈을 FLP 활동을 테스트하기 위해 날아 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt;&gt; 타락한 있습니다 Gal80 (봄 외, 2010). 그리고 depigmented 눈을를 중지합니다. 에서 FLP - 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립에 따라 해제되어 있습니다. GMR - Gal4, UAS - polyQ; (. 봄 외, 2010) 욕조 P&gt; Gal80&gt; 정상적인 눈을 있습니다. 에서 FLP - 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립 아웃 다음에 설정되어 있습니다. </li></ol> 2. 시약 인산 버퍼 호수 (PBS, 1X), 산도 7.4. PFA, EM 등급 (CAT # 15710, 전자 현미경 과학, 하트, PA) 16 %에서 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde (PFA) 0.1 % 트리톤 X - 100 (시그마)를 포함 PBT, 1XPBS 안티 Elav (mAb, 9F8A9; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교), 얼룩 Drosophila의 모든 뉴런. 안티 Repo (mAb 8D12; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교)은 Drosophila의 얼룩 glial 세포를. 마우스 이차 항체에 대한 알렉사 594 치킨 (Invitrogen) 3. 향상제 - 트랩 FLPx2 라인의 표현 패턴을 (* 중요한 단계) 매핑 <ol><li> , yw에서 처녀의 여자를 수집 굴지 P&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP 라인 및 개별 동부 표준시 - FLPx2 라인의 남성을 교차. 전자 동부 표준시 - FLP의 조직 표현 GFP 기자로서의 역할을합니다. </li><li> * 3 차 instar F1의 애벌레를 방황하고 해부하다, 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 세척, 얼음 4퍼센트 PFA 1 시간 동안 수정, CNS (즉, 뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 및 신체 벽을 유지하여 다음 PBT와 배 씻는다. 해부 <ol><li> 제 3 instar F1의 애벌레를 방황하고 제거하고 깨끗한 Sylgard 요리 (35mm Sylgard의 2g 가득 X 10mm 페트리 접시 - 혼합 지침에 따라 제조)로 그들을 놓으십시오. <ol><li> 페인트와 음식 부스러기를 제거 </li></ol></li><li> 애벌레를 마취하기 전에 얼음을 얼음처럼 차가운 1XPBS과 장소로 접시를 채우기 </li><li> 포셉 한 쌍의있는 유충의 입 갈고리를 잡고 포셉 또 한 쌍의와 연장 앞쪽에 공기 구멍 근처 및 사후 끝 부분 표피 껍질 표피를 잡아. CNS는 침샘, 직감하고, imaginal 디스크와 함께 후크 입안에 첨부됩니다. </li><li> 초과 조직과 CNS를 둘러싼 imaginal 디스크를 제거합니다. </li><li> PBS - 채워진 3 잘 pyrex 접시에 CNS를 전송합니다. <ol><li> siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 얼음 4퍼센트 PFA 200 μl 1 시간 동안 수정. <ol><li> CNS 완전히 PFA에 빠져들 있는지 확인하십시오. <ol><li> CNS가 수레 경우, 일반적으로 CNS가 제대로 주변 조직에서 청소 아니라는 것을 제안합니다. </li></ol></li></ol></li><li> PBT와 배 세척 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오. </li></ol></li><li> * 성인 F1의 파리의 CNS를 해부하다. <ol><li> CO 2와 함께 파리를 마취 또는 10 분 동안 얼음에 빈 유리병 안에 들어있는 파리를 놓으십시오. </li><li> 플레이스 성인 30 초위한 얼음에 95 % EtOH - 가득한 유리 그릇에 난다. </li><li> 얼음 유리 접시를 가득 1XPBS에 성인 파리를 전송합니다. <ol><li> 잔류 EtOH를 제거하는 차가운 1X PBS로 3 배 와시 </li></ol></li><li> 35mm Sylga에 파리 플레이스차 요리는 얼음처럼 차가운 1X PBS로 가득 </li><li> 최대 직면하고있는 복부 측면을 놓고 복부를 통해 (minutiens 핀 0.1 mm) 미드웨이를 작은 곤충 펜을를 삽입합니다. <ol><li> 포셉 한 켤레를 사용하면 다리의 기반을 잡고 포셉 또 한 쌍의와 다리를 제거합니다. </li></ol></li><li> 머리 표피를 제거 <ol><li> 포셉 한 쌍의와 코를 잡았지만, 눈 아래와 파리 머리의 등 부분의 중간 라인으로 표피 껍질 다른 장소. </li><li> 다른 시선을 잡고 반대쪽에 남아있는 표피를 제거합니다. </li><li> 날카로운 집게 및 / 또는 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 머리를 주변 tracheal 조직을 제거 <ol><li> 기관의 부적 절한 청소 GFP 발현을 방해하고, 자동 형광 강한의 결과, 그리고 두뇌 고치는 동안 부동하실 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> VNC의 해부 <ol><li> 흉부 표피를 제거 <ol><li> 제 3의 preepisternum 양쪽 두 개의 집게 (즉, 뒷다리의 기반을 잡아)은 장소, 흉부의 사후 끝에 시작. </li><li> 부드럽게, 멀리 복부 정중선 라인에서 표피를 분리하면 목 기지에 도달할 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 부드럽게 VNC를 노출 흉부 표피의 두 반쪽을 확산 </li></ol></li><li> 다음 흉부에서 복부를 제거합니다. 두 번째 다리 기지에서 흉부를 잡아 포셉 한 켤레를 사용하는 동안, 제 1 회 복부 sternite 근처의 복부를 움켜 포셉의 다른 쌍을 사용하여 복부를 당겨. </li><li> 주변 흉부 조직에서 VNC를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 포셉 한 쌍의과 멀리 포셉 부드러운 눈물 흉부 시체의 대부분의 다른 쌍의과 상박 골의 영역을 잡아. </li><li> 이 시점에서 자궁 결합 (목) 주변 결합 조직의 고리가 있어야합니다. 이 집게를 사용하면 분리 반지를 눈물. </li><li> VNC를 둘러싼 초과 가슴 조직을 제거 </li></ol></li><li> 얼음 1X PBS를 포함하는 9 - 잘 Pyrex 요리에 두뇌와 VNC를 전송 <ol><li> siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다 </li></ol></li></ol></li><li> * 얼음 4% PFA 1 시간 동안 성인 CNS를 고정하고 PBT와 얼음처럼 차가운 PBS와 배로 배 세척. </li><li> 4 성인 CNS 준비 또는 애벌레 CNS와 신체 벽을 품어 ° C 중 뉴런 (안티 - Elav, 1시 10분) 또는 glia (anti-Repo. 1시 10분)에 항체와 하룻밤. PBT와 5 배 준비를 씻으십시오. </li><li> 2 시간을 위해 실내 온도에서 마우스 보조 항체 (1:100)에 대한 알렉사 594 닭고기와 성인이나 애벌레 준비 부화하고, PBS로 준비를 씻으십시오. </li><li> 슬라이드에있는 애벌레 또는 성인 CNS를 탑재합니다. CNS의 자연 형태를 유지하려면, 커버 슬립을 중단하는 미니 다리로 슬라이드에 O - 모양의 플라스틱 반지를 (일반 강화 라벨, 에이버리 데니슨, Office 제품, 브레아, CA)을 사용합니다. </li><li> 형광 현미경으로 GFP 및 Elav (또는 Repo) 표현을 패턴에 대한 준비를 검사합니다. </li></ol> 4. photoreceptors의 탄압 Gal4 두 개의 상호 보완적인 Gal80 - 변환 도구의 응용 <ol><li> 욕조를 통해 P를 Gal80를 틀지&gt; Gal80&gt; (그림 5A). <ol><li> 욕조 P&gt; Gal80&gt; 라인, GMR - Gal4, UAS - polyQ에서 수컷를 수집합니다. 복합 눈이 파리에서 정상 있습니다. </li><li> 어이 - FLP의 처녀와 친구. </li><li> F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. </li></ol></li><li> 를 통해 욕조에 Gal80도 틀지 P&gt;&gt; Gal80 (그림 5B)를 중지합니다. <ol><li> GMR - Gal4, UAS - polyQ를 수집, 욕조 P는&gt;&gt; Gal80 남성 파리를 중지하고 안과 표현형을 확인합니다. 타락한 참고 이러한 파리의 depigmented 눈이 야생 유형 종자 (캔턴 - S)에 비해 </li><li> 어이 - FLP의 처녀와 메이트; </li><li> F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. </li></ol></li><li> 선택 동부 표준시 - FLPx2 photoreceptor 세포의 표현과 함께 라인 </li></ol> 단계 4.1 및 4.2는 동부 표준시 - FLPx2 라인을 사용하여 반복 수 photoreceptor 세포의 일부에서 표현 FLP 것을. 또는, 두 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 파리 또는 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P&gt; Gal80&gt; 파리는 선 스크린 개별 동부 표준시 - FLPx2 라인을 넘어 수 표현 photoreceptor 세포에서 FLP. 가치 동부 표준시 - FLPx2 라인은 그 것을 집합 또는 단일 photoreceptor 세포 (그림 6)에서만 익스프레스 FLP. 5. 대표 결과 특정 동부 표준시 - FLPx2 라인의 표현 패턴은 쉽게 검사하고 yw, 굴지 P 사이의 십자가에서 파생된 F1 유충이나 파리 성충에 설명되어 있습니다&gt; CD2&gt; Gal4, UAS - GFP의 처녀 및 ET - FLPx2 남성 (그림 1) . 일반적으로 3-5는 해부와 FLP 표현 패턴 (봄 외., 2010)의 재현성을 결정하기 위해 검사하는 F1 동물의 복제합니다. <st롱&gt; 그림 2는 애벌레와 어른 CNS에서 동부 표준시 - FLPx2 라인 173A에서 FLP의 표현 패턴을 보여줍니다. FLP 패턴은 더욱의 연결 또는 glial 마커 (그림 3 및 4)을 사용하여 분석하실 수 있습니다. 그림 7에 표시된 결과는 Gal80 플립 기능의 효과를 설명하고 Gal4 다음 FLP - 중재 재조합의 교차 억압 시스템을 아웃 플립. 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 구조는 Gal80의 새는 표현 (photoreceptors의 균일한 변성과 depigmentation 기준) 가지고 표시되지 않으며 아직은 주체할에 eyFLP의 도움으로 Gal80도 틀지 100 % 효과가 GMR을 Gal4 및 정상 모습 (그림의 7A)로 시선을 복원합니다. 반대로, 욕조 P는&gt; Gal80가&gt; 완전히 이전 eyFLP의 도입에 GMR - Gal4을 represses. GMR - Gal4 드라이브 UAS - polyQ 표현은 depigmented 눈 (그림의 7B) 타락한 및 선도, Gal80를 플립 아웃 다음. 이 예제에서, 우리는 photoreceptor &#39;회로&#39;를지도로 판 - photorecetor의 FLP를 사용하지만 행동 결과를 검사하지 않았다. behaviorally 관련 Gal4 라인과 유사한 방법을 사용하여, 우리는 파리 성충의 날개 확장 (봄 외., 2010) 규제 CCAP - Gal4 회로의 일부를 매핑. 우리는 FINGR 방법은 행동의 연결을 바탕으로 우리의 이해를 돕고에 도움이 될 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. . 동부 표준시 - FLPx2 라인의 표현 패턴을 검토 동부 표준시 - FLPx2 라인에서 FLP 표현 패턴하기 (파란 타원) 동부 표준시 - FLPx2 남성 (상단 왼쪽) 굴지 P&gt; CD2로&gt; Gal4를 건너에 의해 결정 수 있으며, UAS - GFP 처녀 (오른쪽 위). 유비 쿼터스 굴지 P 부모의 여성에서&gt; Gal4 표현은 FRT (회색 삼각형)의 어귀 CD2 시퀀스의 삽입에 의해 방해합니다. F1 자손에서 FLP는 엑사이스 CD2 순서를&gt; Gal4는 UAS - GFP 발현을 드라이브에 굴지 P을 허용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 애벌레와 어른이 중추 신경계에 동부 표준시 - FLPx2 라인 표현 패턴. 이러한 이미지는 짝짓기 yw, 굴지 P에서 생산되는 자식의 해부 CNS를 (뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 묘사&gt; CD2&gt; Gal4, 동부 표준시 - 173A FLPx2 라인 UAS - GFP 부모. &gt; CD2&gt; 카세트를 recombining하여 FLP는 굴지 P&gt; GAL4 표현 (UAS - GFP의 결과의 표현)가 활성화됩니다. 따라서 GFP 패턴 FLP - 표현 세포를보고합니다. 패널 B는 라인 173A의 성인 표현식 패턴을 보여주는 반면, 패널은 애벌레 FLP 표현 패턴을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 동부 표준시 - FLPx2 라인 # 688A에 flippase을 표현 세포 유형의 특성화. A, 동부 표준시 - FLPx2 라인 # 688A와 GFP Flippase보고 라인 사이에 십자가에서 안티 REPO 물들일 고정 F1 제 3 instar의 유충의 합성 이미지. 3 차 instar의 유충에서 VNC의 뒷부분 끝에서 가져온 BD, 높은 배율 (자이스 혈구 계획 - 고차 색지움 63x 오일) 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 동부 표준시 - FLPx2 라인의 버섯 신체 내의 세포 유형의 특성화 # 150. AC, 안티 REPO 물들일 고정 F1 세번째 instar의 유충에서 버섯 신체의 높은 배율 이미지 (63x 기름 침지). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. Gal80 플립 -와 플립 아웃 전략의 삽화. 플립 아웃 전략 A., tubulin 모터 구동 Gal80 (터브 P&gt; Gal80&gt;) GMR - Gal4의 억압과 야생 타입 눈 표현형 (레드 아이)의 결과, constitutively 활성화됩니다. 이 억압은 Gal80 아웃 (중, 빨간색) 플립 및 GMR - Gal4가 UAS - polyQ 표현을 운전하실 수 있습니다 FLP (보라색)의 도입에 의해 제거됩니다. photoreceptor 세포 변성이 결과를 (눈에 흰색 점의 그림). B. 이전 전략의 상호에서 tubulin 모터 구동 Gal80 표현은 &quot;중지&quot;코돈 어귀 FRT (회색 삼각형)으로 중단됩니다. Gal80의 부재에서 GMR - Gal4은 photoreceptors로의 연결을 퇴보를 (눈에 흰색 점의 그림)의 원인 UAS - polyQ에 바인딩합니다. GMR - Gal4, UAS - polyQ 횡단하여, 욕조 P&gt;를 photoreceptor 세포에서 FLP을 표현 처녀 암컷, FLP (보라색)과&gt; GAL80 남성은 &quot;그만하세요&quot;코돈 (중간을 절개, FRT 사이트에서 재조합을 catalyze 중단됩니다, 적색), 따라서 Gal80 표현과 GMR - Gal4의 억압에 대한 수 있도록합니다. 이것은 (W의 부족에 의해 그림 photoreceptor 세포의 neurodegeneration을 보유눈에 하이트 점). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 동부 표준시 - FLPx2 라인에게 # 688A를 사용하여 밖으로 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램 동부 표준시 - FLPx2 라인 사이의 교차 GMR - Gal4, UAS - polyQ에 # 688A 처녀에서 F1 자손;. tubP&gt; GAL80 남성. 눈 ommatidia의 한가운데에 색소의 부족 라인 # 688A에서 FLP 표현을 나타냅니다. 이 분야에서 GMR - Gal4의 Gal80 진압은 Gal4가 UAS - polyQ 운전 있도록 안심했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="그림 7"/> 그림 7. photoreceptors에서 Gal4을 교차에 또는 밖 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램입니다. A. 욕조 P&gt;&gt; Gal80 플립의 시스템 FLP 종속적인 방식으로 GAL4 표현을 제한 중지합니다. 년 GMR - Gal4, UAS - polyQ, 욕조 P가&gt; 중지&gt; GAL80 파리, photoreceptor 세포가 퇴화하고 depigmented 아르 (왼쪽 날아). eyFLP의 도입에 따라, Gal80가 차례로 표현 polyQ를 끄고는 다음과 같이 정상적인 눈을 가진 파리 (오른쪽 플라이)를 생산 GMR - Gal4의 모든 억압의 결과로, photoreceptor 세포에 표현된다. B. 욕조 P&gt; Gal80&gt; 플립은 아웃 시스템이 욕조로 반대 방식으로 작동 P&gt; 중지&gt; Gal80 플립 - 인 시스템입니다. 터브 P는&gt; Gal80은&gt; constitutively GAL4을 represses하고 polyQ의 표현 (일반 눈으로, 파리 왼쪽) 표시되지 않습니다. eyFLP의 도입에 따라, Gal80는 GMR - Gal4의 억제을 덜어하고 표현 polyQ 켜기, photoreceptor 세포에서 밖으로 뒤집혀 있습니다. 이것은 퇴화하고 depigmented 눈 (오른쪽 플라이)와 파리가 발생합니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Gal4/UAS 시스템은 널리 성공적으로 다양한 생물 학적 연구 Drosophilists (; 뒤피, 2002 년 브랜드 &amp; Perrimon, 1993)에 의해 사용되고 있습니다. 날짜하려면, 파리 사회는 모터 구동 및 확장기 - 트랩 Gal4 라인의 수천을 생성했다. FINGR 방법의 가장 큰 장점은 그것이 가능 상당히 Drosophila 연구 Gal4의 파워를 확장하고, Gal4/UAS 시스템과 호환된다는 점입니다. FINGR 방법 중 하나는 중요한 응용 프로그램 Gal4/Gal80 교차로를 통해 동작을 기본 조정할 신경 회로입니다. 이러한 행동은 포함할 수 있지만 학습 및 메모리, 구애, 수면, 그리고 circadian 리듬에 제한되지 않습니다. FINGR 방법은 또한 알츠하이머와 같은 neurodegenerative 질병 인간, 루게릭병 (ALS), 그리고 파킨슨병의 질병을 모델링 neurodegeneration하는 경향이있는 중요한 신경을지도하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 중재 코카인, 알코올 및 기타 물질 중독에 중요한 신경이나 신경 회로의 foci는 FINGR 방법을 사용하여 매핑 수 있습니다. 신경 회로 및 동작의 시간적 통제하기 위해 FINGR 메서드와 함께 사용할 수 있으며, 이것은 조건부 Gal4s가 (.. 로마 외, 2001 Osterwalder 외, 2001)을 언급해야합니다. 온도에 민감한 Gal80 (Gal80 TS, 맥과이어 외., 2003)을 사용하여 Gal80 - 변환 도구의 수정 생산할 수 욕조 P&gt; 중지&gt; Gal80 TS 또는 욕조 P&gt; Gal80 TS&gt; 회로 조작에서 추가 관자놀이 flexibilities을 추가. 신경계 외에도 FINGR 방법은 날개 또는 다리인지 여부 세포의 하위 집합에 Gal4 표현을 제한하기 위해 동일하게 적용됩니다. 동부 표준시 - FLPx2 라인 MARCM (리 &amp; 루오, 1999)를 포함하여 FRT / FLP 기반 clonal 분석 (쑤 &amp; 루빈, 1993)에 관심이 모든 Drosophila의 생물학을위한 귀중한 자원 것입니다. 또한 일부 동부 표준시 - FLPx2 라인 재현성 클론을 생산 및 반복 형태학의 및 행동 분석을위한 heatshock - FLP를 대체할 수있는 것으로 예상된다. 향상제 - 트랩 Gal4 라인과 마찬가지로, 대부분의 동부 표준시 - FLPx2 라인 하나의 관심의 세포에 구체적으로 표현하지 않을 수 있습니다. 대부분의 라인은 관심의 세포에 잘 다른 세포 또는 조직에서 FLP을 표현합니다. 그러나, Gal4 및 ET - FLPx2 모두의 &#39;조직 특이성&#39;의 부족은 오랫동안 자신의 겹치는 영역이 특정 실험을 위해 바람직으로 FINGR 방법에 대한 주요 관심사되지 않습니다. FINGR는 세련된 하나에이 &#39;확장&#39;시스템을 설정하도록 설계되었습니다. 이러한 프로토콜에 설명된 방법은 오히려 표준이며 재현성해야합니다. 자기의주의를 필요로하는 주요 경계의 단계는 정착액의 선택 및 사용하고 있습니다. 그들은 GFP 신호를 끄지 때문에 PFA 이외 Fixatives은 피해야한다. 우리는 또한 해부 접시는 FLP 표현이 안정적으로 GFP에 의해보고되지 않습니다 가능성을 피하기 위해 PFA와 고정을 위해 사용해서는 안된다는 지적했습니다.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Gal4 / UAS 바이너리 방식은 Drosophila의 유전자와 신경 회로 조작을위한 강력한입니다. 대부분의 신경 생물학 연구하지만, Gal4 표현은 거의 행동 설치 했어요와 회로의 정확한 상관 관계에 대한 충분한 조직을 특정하지 않습니다. 이 주요 장애물을 극복하기 위해, 우리는 최근 관심의 조직에 더 제한 Gal4 표현을 달성하기 FINGR 방법을 개발했습니다. FLP / FRT - 중재 Gal80 변환 도구 2) 세트,, 전통 Gal4/UAS 제도 1) 3) 확장기 트랩 FLP (동부 표준시 - FLP) : FINGR 방법은 세 가지 요소가 있습니다. Gal4은 관심의 주요 신경 회로를 정의하는 데 사용됩니다. 와 Gal4을 벗긴 껍질 UAS - 효과기 등 UAS - MJD78Q 또는 UAS시 TS로 비행 동작의 변경으로 나타나신 차례에의 연결을 활동을 규제. 추가로 같은 UAS - GFP, 특정 동작에 관련된 신경 회로와 같은 UAS - 기자는 동시에 형태학의 분석을 위해 매핑 수 있습니다. 욕조 P&gt; Gal80&gt; ( &#39;아웃 플립&#39;)와 욕조 P&gt;&gt; Gal80 ( &#39;플립 안에&#39;) 중지. 광범위한 표현과 Gal4 라인의 경우, Gal4 표현 두 보완 Gal80 - 변환 도구를 사용하여 제한할 수 있습니다 마지막으로, 조사는 조직에 특정한 동부 표준시 - FLP의 도움으로, 각각 Gal80을 켜거나 끌 수 있습니다. 에서 플립 모드, Gal80가 Gal4 및 ET - FLP가 교차하는 곳에 Gal4 표현을 주체할 수 있습니다. 플립 아웃 모드에서는, Gal80 안에 Gal4와 FLP 중복 세포에 Gal4 탄압을 완화합니다. 두 접근 방법은 Gal4 정의 회로에서 세포의 수를 제한을 사용하지만, 반대 패턴 인치 FINGR 방법은 Gal4 플라이 사회에서 라인과 전통 clonal 분석과 신경 회로 매핑에 대한 높은 다용도의 광대한 수집과 호환됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 선택 동부 표준시 - FLPx2 라인과 photoreceptor 세포에서 FINGR 방법의 효과에 FLP 표현 패턴 매핑을 보여줍니다. FINGR 방법의 원리는 또한 Gal4/UAS, Gal80 및 FLP / FRT를 사용하는 다른 유전자 모델 생물에 적용해야합니다.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

우리는 조직에 특정한 FLP는 Gal80 표현식 패턴을 결정 수 있도록 Flippase 유도된 교차 Gal80/Gal4 억압 (FINGR) 메서드를 설명합니다. 어디서나 Gal4 및 FLP의 중복은 Gal4 표현은 켜져 있습니다 (Gal80가 정신이 나갔죠) 또는 해제 (Gal80가 뒤집혀). FINGR 방법은 clonal 분석과 신경 회로 매핑을위한 다목적 있습니다.

매핑 및 애벌레와 성인의 확장기 - 트랩 Flippase의 표현의 응용 Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K 조회수.  University of Oklahoma - Norman. 우리는 조직에 특정한 FLP는 Gal80 표현식 패턴을 결정 수 있도록 Flippase 유도된 교차 Gal80/Gal4 억압 (FINGR) 메서드를 설명합니다. 어디서나 Gal4 및 FLP의 중복은 Gal4 표현은 켜져 있습니다 (Gal80가 정신이 나갔죠) 또는 해제 (Gal80가 뒤집혀). FINGR 방법은 clonal 분석과 신경 회로 매핑을위한 다목적 있습니다.

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

연구

신경과학

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

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Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

의 고품질의 디지털 비디오 취득<em&gt; 초파리</em&gt; 측면 관점에서 애벌레 및 성인 동작

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...