Agradecemos a um fundo interno da Universidade de Oklahoma (para BZ) e uma bolsa da NSF (IOS-1025556, para BZ e RAB) para apoiar TRF, RAB, XP, AAO, MLW, CAS, e esta pesquisa. Uma subvenção de NIH (NS060878 RO1, para BZ) parcialmente financiado RAB. RAB reconhece um NRSA NIH (T32 NS07292) treinamento subvenção concedida a Brandeis University, e uma subvenção de NIH (RO1 GM21473) concedido a Jeffrey Hall, Brandeis, para apoiar as fases iniciais deste estudo. Agradecemos a Jeffrey Hall para seus encorajamentos contínua para este projeto. Agradecemos ao Dr. Kristin Scott por nos fornecer a banheira P&gt; Gal80 tensão&gt;.

1. Drosophila cepas <ol><li> Gal4 driver: GMR-Gal4, que expressa Gal4 em células fotorreceptoras. </li><li> UAS linhas UAS-MJD78Q (ou UAS-polyQ), que causa degeneração neural em Gal4 células que expressam. UAS-GFP, que expressa GFP em Gal4 células que expressam. </li><li> Linhas de FLP ey-FLP, que expressa FLP em fotorreceptores e em subconjuntos de regiões do cérebro. ET-FLPx2 linhas, que são enhancer trap-linhas contendo duas cópias da FLP (FLP-IRES-FLP). Temos gerado ~ 1000 ET-FLP linhas (Bohm et al., 2010), cuja expressão padrões ainda estão para ser caracterizado. Aqui, descrevemos a caracterização do padrão de expressão de ET-selecionar FLPx2 na larva e adulto voar sistema nervoso central (SNC). </li><li> Repórter FLP yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP (Pignoni &amp; Zipursky, 1997), que relata o padrão de expressão de ET-FLPx2 através de actina P&gt; Gal4; UAS-GFP sobre FLP mediada por excisão de recombinational&gt; CD2. </li><li> Dois complementares Gal80 conversora de ferramentas Banheira P&gt; Gal80&gt; (Gordon &amp; Scott, 2009), a construção de flip-out, que constitutivamente expressa Gal80 em todos os tecidos dirigido por um promotor de tubulina forte. Após a FLP mediada recombinação,&gt; Gal80 está virado para fora e Gal80 expressão é terminada apenas em ET-FLPx2 expressando tecidos. Banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Bohm et al., 2010), o flip-em construção, que não expressa Gal80 em condições normais. Gal80 expressão é ativada pelo promotor tubulina apenas em ET-FLPx2 expressar-tecidos em que FLP enlouquece parar&gt; e vira em Gal80. </li><li> Moscas para testar a atividade FLP no olho composto GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Bohm et al, 2010.), Que degeneram e os olhos despigmentados. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ é desligado após Gal80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al, 2010) tub P&gt; Gal80&gt;, que tem olhos normais. Em FLP-expressando células fotorreceptoras, expressão polyQ está ligado seguintes Gal80 flip-out. </li></ol> 2. Reagentes Tampão fosfato (PBS, 1X), pH 7.4. Paraformaldeído a 4% (PFA), diluído em PBS de 16% PFA, EM grau (Cat # 15710, Ciências Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS contendo 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Estudos Hibridoma Bank, da Universidade de Iowa), manchas todos os neurônios em Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Estudos Hibridoma Bank, University of Iowa) manchas células gliais em Drosophila. Alexa frango 594 contra anticorpo secundário do mouse (Invitrogen) 3. Mapeamento do padrão de expressão de linhas enhancer-trap FLPx2 (* passos críticos) <ol><li> Coletar fêmeas virgens do yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; linha UAS-GFP e cruzar com os homens de cada ET-FLPx2 linhas. O primeiro serve como um repórter GFP para a expressão tecido de ET-FLP. </li><li> * Dissecar vagando 3 º instar as larvas F1, manter o sistema nervoso central (isto é, o cérebro eo cordão nervoso ventral, VNC) e da parede do corpo, correção para uma hora em PFA 4% sobre o gelo, lave 3X com PBS gelado seguido por lava 3X com PBT. Dissecação <ol><li> Remover vagando 3 º instar as larvas F1 e coloque-os em um prato limpo Sylgard (35 mm x 10 mm placa de petri preenchida com 2 gramas de Sylgard - misturado de acordo para a fabricação de instruções). <ol><li> Remover restos de comida com pincel </li></ol></li><li> Encha o prato com gelado 1XPBS e colocar no gelo para anestesiar as larvas </li><li> Segure os ganchos na boca de uma larva com uma pinça e pegar a cutícula perto do espiráculo estendendo anterior com outro par de fórceps e descascar a cutícula para o fim posterior. O SNC será anexado a ganchos na boca, juntamente com as glândulas salivares, intestino e discos imaginais. </li><li> Retire o excesso de tecido e discos imaginal em torno do CNS. </li><li> Transferência do SNC em um PBS-cheia 3 pirex bem. <ol><li> A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido. </li></ol></li><li> Correção para uma hora em 200 mL de PFA 4% sobre o gelo. <ol><li> Garantir que o CNS é completamente submersas na PFA. <ol><li> Se o SNC flutua, isso normalmente sugere que o CNS não é devidamente limpo a partir do tecido circundante. </li></ol></li></ol></li><li> Lavar 3X com PBS gelado seguido por lavagens 3X com PBT. </li></ol></li><li> * Dissecar o SNC de moscas F1 adulto. <ol><li> Anestesiar as moscas com CO 2 ou colocar as moscas contido dentro de um frasco vazio no gelo por 10 minutos. </li><li> Adulto lugar voa em um prato de vidro de 95% EtOH repletas de gelo por 30 seg. </li><li> Transferência de moscas em um prato de vidro cheio 1XPBS no gelo. <ol><li> Lavar 3X com gelado 1X PBS para remover EtOH residual </li></ol></li><li> Coloque uma mosca em uma Sylga 35 milímetrosrd prato cheio de PBS 1X gelada </li><li> Coloque o lado ventral para cima e coloque uma caneta pequeno inseto (pinos minutiens 0,1 mm) no meio do abdômen. <ol><li> Usando um par de fórceps segure a base das pernas e retire as pernas com um par de fórceps. </li></ol></li><li> Remover a cutícula cabeça <ol><li> Enquanto agarrando a tromba com um par de fórceps, coloque outra por baixo do olho e descascar a cutícula para a linha dorsal da cabeça voar. </li><li> Agarre o outro olho e remover a cutícula restantes do outro lado. </li><li> Utilizando uma pinça afiada e / ou agulha de tungstênio afiada, remover o tecido traqueal que envolvem o cérebro <ol><li> Limpeza inadequada da traquéia vai resultar em forte auto-fluorescência, obstruindo expressão GFP, e permitir que o cérebro a flutuar durante a fixação </li></ol></li></ol></li><li> Dissecação VNC <ol><li> Remover a cutícula torácica <ol><li> A partir do final posterior do tórax, coloque duas pinças em cada lado do preepisternum 3 º (isto é, agarrando a base das pernas). </li><li> Separar delicadamente a cutícula longe da linha média ventral, repita isso até chegar na base do pescoço. </li><li> Puxe as duas metades da cutícula torácica expondo o VNC </li></ol></li><li> Em seguida remova o abdômen do tórax. Enquanto estiver usando uma pinça para segurar o tórax, na base da segunda mão, use um outro par de pinças para agarrar o abdômen perto do primeiro esternito abdominal e puxe o abdômen fora. </li><li> Para remover o VNC do tecido circundante torácica. Manter a área umeral com um par de fórceps e com outro par de fórceps lágrima suave longe da maioria da carcaça torácica. </li><li> Neste ponto, deve haver um anel de tecido conjuntivo em torno do conjuntivo cervical (pescoço). Utilizando duas pinças de rasgar o anel de distância. </li><li> Remova qualquer excesso de tecido torácica em torno do VNC </li></ol></li><li> Transferência do cérebro e da VNC a 9 bem-pirex contendo 1X PBS sobre o gelo <ol><li> A siliconada P200 ponteira pode ser usada para evitar a secagem do tecido </li></ol></li></ol></li><li> * Fix do SNC adulto por 1 hora em PFA 4% sobre o gelo e lave 3X com PBS gelado e 3X com PBT. </li><li> Incubar a preparação do SNC adulto ou do SNC larval e parede do corpo a 4 ° C durante a noite com anticorpos para ambos os neurônios (anti-Elav, 1:10) ou glia (anti-Repo. 1:10). Lave a preparação de 5X com PBT. </li><li> Incube com a preparação de adultos ou larvas com Alexa frango 594 contra rato anticorpo secundário (1:100) em temperatura ambiente durante 2 horas, e lavar a preparação com PBS. </li><li> Monte o CNS larval ou adultos em um slide. Para preservar a forma natural do SNC, use um anel de plástico em forma de O (Label claro reforço, Avery Dennison, Produtos Office, Brea, CA) no slide como um mini-ponte para suspender a lamínula. </li><li> Examinar a preparação para os padrões de boas práticas agrícolas e Elav (ou Repo) expressão sob um microscópio fluorescente. </li></ol> 4. A aplicação de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas na repressão Gal4 em fotorreceptores <ol><li> Gal80 lançando para fora através de banheira P&gt; Gal80&gt; (Figura 5A). <ol><li> Coletar os machos da GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; Gal80 line&gt;. Note-se que os olhos compostos são normais nestas moscas. </li><li> Acasalar com ey FLP-virgens. </li><li> Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos. </li></ol></li><li> Flipping Gal80 em via banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (Figura 5B). <ol><li> Coletar GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 machos e examinar o fenótipo dos olhos. Observe a degenerar e olhos despigmentados nestas moscas em comparação com cepas do tipo selvagem (Canton-S) </li><li> Acasalar com ey FLP-virgens; </li><li> Coletar as moscas F1 e examinar o fenótipo dos olhos. </li></ol></li><li> Selecione ET-FLPx2 linhas com expressão em células fotorreceptoras </li></ol> Passos 4.1 e 4.2 pode ser repetido usando ET-FLPx2 linhas que expressam FLP em um subconjunto de células fotorreceptoras. Em alternativa, seja a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; Gal80 moscas ou a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; Gal80&gt; moscas podem ser cruzados para indivíduo ET-FLPx2 linhas para triagem de linhas que expressam FLP em células fotorreceptoras. Valiosa ET-FLPx2 linhas são aqueles que só FLP expressa em um subconjunto ou células fotorreceptoras único (Figura 6). 5. Resultados representativos O padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 específico pode ser facilmente analisado e documentado na F1 larvas ou adultos moscas derivada do cruzamento entre yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP virgens e ET-FLPx2 do sexo masculino (Figura 1) . Normalmente, três a cinco repetições dos animais F1 são dissecados e examinados para determinar a reprodutibilidade do padrão de expressão FLP (Bohm et al., 2010). <strong&gt; A Figura 2 mostra o padrão de expressão de FLP em ET-173A FLPx2 line no SNC larval e adulto. O padrão de FLP pode ser ainda analisados ​​usando um marcador neuronal ou glial (Figura 3 e 4). Os resultados mostrados na Figura 7 ilustram a eficácia da Gal80 flip-e flip-out sistemas na repressão interseccional de Gal4 recombinação FLP mediada seguinte. A banheira P&gt; parar&gt; Gal80 construção não parece ter qualquer expressão de leaky Gal80 (baseado na degeneração uniforme e despigmentação de fotorreceptores), e ainda é 100% eficaz em lançar Gal80 com a ajuda de eyFLP para reprimir GMR- Gal4 e restaurar o olho às aparências normal (Fig. 7A). Pelo contrário, banheira P&gt; Gal80&gt; totalmente reprime GMR-Gal4 antes da introdução de eyFLP. Seguintes Gal80 flip-out, GMR-Gal4 drives expressão UAS-polyQ, levando à degeneração e olhos despigmentados (Fig. 7B). Neste exemplo, usamos um FLP photorecetor pan-mapear &quot;circuitos&quot; do fotoreceptor, mas não examinar as conseqüências comportamentais. Usando abordagens semelhantes com comportamentalmente relevantes Gal4 linhas, mapeamos parte do circuito-Gal4 CCAP regulam expansão asa nas moscas adultas (Bohm et al., 2010). Acreditamos que o método FINGR será valioso em ajudar a nossa compreensão da base neuronal de comportamento. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. . Examinar o padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 O padrão de expressão FLP (ovais azuis) de uma linha de ET-FLPx2 pode ser determinada pela passagem de uma ET-FLPx2 do sexo masculino (superior esquerdo) com um actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS- GFP virgem (canto superior direito). Onipresente Actina P&gt; expressão Gal4 na fêmea parental é prejudicada pela inserção do (triângulos cinza) FRT seqüência CD2 flanqueado. Na progênie F1, FLP será imposto a seqüência CD2, permitindo Actina P&gt; Gal4 dirigir UAS-GFP expressão. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Padrão de expressão de uma linha de ET-FLPx2 na larvas e adultos do sistema nervoso central. Estas imagens retratam o SNC (cérebro e medula nervosa ventral, VNC) dissecada da prole produzida a partir de acasalamento yw, actina P&gt; CD2&gt; Gal4; UAS-GFP pais para o ET-FLPx2 173A linha. Ao recombinar a&gt; CD2 cassete&gt;, FLP ativa actina expressão P&gt; GAL4 (a expressão conseqüente da UAS-GFP). Assim, o padrão de GFP relatórios FLP células que expressam. Um painel mostra o padrão de expressão larval FLP enquanto painel B mostra o padrão de expressão de adultos em linha 173A. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Caracterização de tipos de células que expressam flippase em ET-FLPx2 Line # 688A. A, A imagem composta de uma fixa de 3 ª F1 larva instar corados com anti-REPO de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # 688A e uma linha hierárquica Flippase GFP. BD, A alta ampliação view (Zeiss Plano Apochromat-63x de petróleo) retirados da extremidade posterior de um VNC a partir de uma 3 ª larvas. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Caracterização de tipos de células dentro do corpo cogumelo de ET-FLPx2 Line # 150. AC, Uma imagem de alta ampliação (63x imersão em óleo) do corpo de um cogumelo 3 F1 fixo larva instar corados com anti-REPO. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ilustração de Gal80 Estratégias Flip-no e Flip-out. A. Na estratégia de flip-out, tubulina promotor-driven Gal80 (Tub P&gt; Gal80&gt;) é constitutivamente ativo, resultando na repressão da GMR-Gal4 e um fenótipo do tipo selvagem olhos (olho vermelho). Esta repressão é removida pela introdução de FLP (púrpura), que vai virar Gal80 out (do meio, vermelho) e permitir GMR-Gal4 dirigir-UAS polyQ expressão. Isso resulta em degeneração das células fotorreceptoras (ilustrado por pontos brancos no olho). B. No inverso da estratégia anterior, tubulina promotor-driven Gal80 expressão é interrompido por FRT (cinza triângulo) ladeado codon &quot;stop&quot;. Na ausência de Gal80, GMR-Gal4 liga-se a UAS-polyQ causando degeneração neuronal em fotorreceptores (ilustrado por pontos brancos no olho). Ao cruzar a GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; GAL80 machos com fêmeas virgens, que expressam FLP nas células fotorreceptoras, FLP (púrpura) vai catalisar a recombinação nos locais FRT, excisão do &quot;stop&quot; códon (médio, vermelho), permitindo assim Gal80 expressão e repressão da GMR-Gal4. Este reserva-se o neurodegeneração em células fotorreceptoras (ilustrado pela falta de white pontos no olho). <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 por meio ET-FLPx2 Line # 688A progênie F1 de um cruzamento entre ET-FLPx2 linha # virgem 688A a GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP&gt; GAL80 masculino. A falta de pigmento no meio do olho representa omatídeos expressão FLP em linha # 688A. Nesta área Gal80 supressão da GMR-Gal4 ficou aliviada permitindo que o Gal4 dirigir-UAS polyQ. <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. A aplicação do método FINGR em lançar Gal80 dentro ou para fora para cruzar Gal4 em fotorreceptores. A. A banheira P&gt; parar&gt; Gal80 sistema de flip-nos restringe GAL4 expressão de uma forma FLP-dependente. Em GMR-Gal4, UAS-polyQ; banheira P&gt; parar&gt; GAL80 moscas, células fotorreceptoras são degenerados e despigmentadas (fly esquerda). Após a introdução da eyFLP, Gal80 é expressa em células fotorreceptoras, resultando em repressão cheio de GMR-Gal4, que por sua vez desliga o polyQ expressão e produz moscas com olhos normais (voar para a direita). B. A banheira P&gt; Gal80&gt; Flip -out sistema funciona de maneira oposta como a banheira P&gt; parar&gt; Gal80 flip-no sistema. Banheira P&gt; Gal80&gt; constitutivamente reprime GAL4 e suprime a expressão de polyQ (esquerda voar, com os olhos normal). Após a introdução da eyFLP, Gal80 está virado para fora a partir de células fotorreceptoras, aliviando a supressão da GMR-Gal4 e ligar o polyQ expressão. Isto leva a degenerar e voa com os olhos despigmentados (voar para a direita).

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	<li>Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+mosaic+approach+for+neural+circuit+mapping+in+Drosophila.">A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+group+genes+are+required+for+neural+stem+cell+survival+in+postembryonic+neurogenesis+of+Drosophila.">Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila.</a> Development. 134, 1091-1099 (2007).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. , 34-341 (2002).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302, 1765-1768 (2003).</li><li>Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+tissue+specific+transgene+expression+system+using+inducible+GAL4.">A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P[Switch],+a+system+for+spatial+and+temporal+control+of+gene+expression+in+Drosophila+melanogaster.">P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O sistema Gal4/UAS tem sido amplamente utilizada com sucesso por Drosophilists para vários estudos biológicos (Brand &amp; Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Até à data, a comunidade mosca tem gerado milhares de promotor-driven e enhancer-trap Gal4 linhas. Uma das principais contribuições do método FINGR é que ele é compatível com o sistema Gal4/UAS, tornando possível expandir significativamente o poder de Gal4 em Drosophila estudos. Uma aplicação importante do método é FINGR circuitos neurais subjacentes afinar comportamento através Gal4/Gal80 cruzamento. Esses comportamentos podem incluir, mas não estão limitados a, aprendizado e memória, namoro, sono e ritmo circadiano. O método FINGR também pode ser usado para mapear os neurônios críticos que são propensas a neurodegeneração na modelagem humana doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ALS), e doenças de Parkinson. Da mesma forma, focos de neurônios ou circuitos neurais crucial para mediar a cocaína, álcool e dependência de outra substância poderia ser mapeados usando o método FINGR. Note-se que Gal4s condicional (Osterwalder et al, 2001;.. Roman et al, 2001) poderia ser usado com o método FINGR, a fim de obter o controle temporal de circuitos neurais e comportamentos. Modificação do Gal80 conversora de ferramentas usando uma Gal80 sensíveis à temperatura (ts Gal80, McGuire et al., 2003) pode produzir banheira P&gt; parar&gt; Gal80 ts ou banheira P&gt; Gal80 ts&gt;, acrescentando ainda mais flexibilidade temporal na manipulação de circuito. Além do sistema nervoso, o método FINGR é igualmente aplicável a restrição Gal4 expressão em subconjuntos de células se é a asa ou a perna. As linhas de ET-FLPx2 será um recurso valioso para todos os biólogos interessados ​​em Drosophila FRT / FLP análise baseada clonal (Xu &amp; Rubin, 1993), incluindo MARCM (Lee &amp; Luo, 1999). Espera-se também que algumas linhas de ET-FLPx2 pode substituir heatshock FLP-para a produção de clones reprodutível e de repetidas análises morfológicas e comportamentais. Como linhas Gal4 enhancer-armadilha, a maioria dos ET-FLPx2 linhas não são susceptíveis de ser expresso especificamente nas células do seu interesse. A maioria das linhas vai expressar FLP nas células de interesse e em outras células ou tecidos também. No entanto, a falta de &quot;especificidade do tecido de ambas as Gal4 e ET-FLPx2 não vai ser uma grande preocupação para o método FINGR enquanto a sua região de sobreposição é desejável para uma experiência particular. FINGR é projetado para ligar dois &#39;grandes&#39; sistemas em um refinado. Os métodos ilustrados nestes protocolos são bastante padrão e deve ser reprodutível. Os principais passos de advertência que exigem atenção de alguém são a seleção e uso do fixador. Fixadores que não PFA devem ser evitados, porque eles vão saciar sinal de boas práticas agrícolas. Temos também observou que o prato dissecção não deve ser usado para fixação com PFA para evitar a possibilidade de que a expressão FLP não será confiável relatado por GFP.

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

O método binário Gal4 / UAS é poderoso para o gene e manipulação de circuitos neurais em Drosophila. Para a maioria dos estudos neurobiológicos, no entanto, raramente é Gal4 expressão tecido-específica o suficiente para permitir a correlação precisa do circuito com leituras comportamentais. Para superar este obstáculo, que recentemente desenvolveu o método FINGR para alcançar um mais restritivo Gal4 expressão no tecido de interesse. O método FINGR tem três componentes: 1) o sistema Gal4/UAS tradicionais; 2) um conjunto de FLP / FRT mediada Gal80 ferramentas de conversão, e 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 é usado para definir o circuito primário neural de interesse. Comparação do Gal4 com um UAS-efetoras, tais como UAS-MJD78Q ou UAS-Shi ts, regula a atividade neuronal, que por sua vez é manifestada por alterações no comportamento da mosca. Com um adicional de UAS-repórter, como UAS-GFP, o circuito neural envolvido no comportamento específico pode ser mapeada simultaneamente para análise morfológica. Para Gal4 linhas com a expressão ampla, Gal4 expressão pode ser restringida por meio de dois complementares Gal80 conversora de ferramentas: banheira P&gt; Gal80&gt; (&quot;flip out&quot;) e banheira P&gt; parar&gt; Gal80 (&#39;flip em&#39;). Finalmente, os investigadores podem transformar Gal80 ligado ou desligado, respectivamente, com a ajuda de tecidos específicos ET-FLP. No flip-in modo, Gal80 vai reprimir Gal4 expressão onde Gal4 e ET-FLP se cruzam. No modo de flip-out, Gal80 irá aliviar Gal4 repressão nas células em que se sobrepõem Gal4 e FLP. Ambas as abordagens permitem à restrição do número de células no circuito Gal4-definido, mas em um padrão inverso. O método FINGR é compatível com a vasta coleção de Gal4 linhas na comunidade voar e altamente versátil para a análise clonal tradicionais e para o mapeamento do circuito neural. Neste protocolo, demonstramos o mapeamento dos padrões de expressão FLP em selecionar ET-FLPx2 linhas ea eficácia do método FINGR em células fotorreceptoras. O princípio do método FINGR também deve ser aplicável a outros organismos modelo genético em que Gal4/UAS, Gal80 e FLP / FRT são usados.

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

Nós descrevemos um Flippase induzida interseccional Gal80/Gal4 repressão método (FINGR), permitindo que o tecido específico FLP para determinar Gal80 padrões de expressão. Onde quer que Gal4 e sobreposição FLP, Gal4 expressão é ligado (Gal80 virado para fora) ou desligado (Gal80 capotou in). O método FINGR é versátil para análise clonal e mapeamento do circuito neural.

Mapeamento e Aplicação de Enhancer-trap Expressão Flippase em larval e Adultos Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K visualizações.  University of Oklahoma - Norman. Nós descrevemos um Flippase induzida interseccional Gal80/Gal4 repressão método (FINGR), permitindo que o tecido específico FLP para determinar Gal80 padrões de expressão. Onde quer que Gal4 e sobreposição FLP, Gal4 expressão é ligado (Gal80 virado para fora) ou desligado (Gal80 capotou in). O método FINGR é versátil para análise clonal e mapeamento do circuito neural.