我々は、オクラホマ大学（BZまで）とTRF、RAB、XP、AAO、MLW、CAS、およびこの研究をサポートするためのNSF（IOS - 1025556、BZとRABまで）からの助成金からの内部資金に感謝。 NIHの助成金（RO1 NS060878、BZに）部分的にサポートされているRAB。 RABは、本研究の初期段階を支援するためのブランダイス大学に授与NIH NRSA（T32 NS07292）訓練助成金、およびブランダイスでジェフリーホールに授与NIHの助成金を（RO1 GM21473）、認めている。我々はこのプロジェクトのための彼の継続的な激励のためにジェフリーホールに感謝。我々は、浴槽P&gt; Gal80&gt;株と私たちを提供するための博士クリスティンスコットに感謝。

（1） ショウジョウバエ系統 <ol><li> GAL4ドライバー： 視細胞でGal4のを表現するGMR - GAL4、。 </li><li> UAS行 Gal4の発現細胞の神経変性を引き起こすUAS - MJD78Q（またはUAS - polyQ）、。 Gal4の発現細胞でGFPを発現するUAS - GFP、。 </li><li> FLP行 光受容体と脳領域のサブセットでFLPを発現しEY - FLP、。 FLPの2つのコピー（FLP - IRES - FLP）を含むエンハンサートラップ系統であるET - FLPx2ライン、。我々は、その発現パターンは特徴付けされていない項目〜1,000 ET - FLPの行を（ボームら、2010）、生成されている。ここで、我々は、幼虫と大人のフライ中枢神経系（CNS）における選択ET - FLPx2の発現パターンの特性を説明します。 </li><li> FLPレポーター YW、アクチンP&gt; CD2&gt; Gal4の、UAS - GFP（Pignoni＆Zipursky、1997）、アクチンPを介してET - FLPx2の発現パターンを報告する&gt; Gal4の、UAS - GFP&gt; CD2のFLPを介した組換え切除時に。 </li><li>二つの相補Gal80、変換ツール 浴槽P&gt; Gal80&gt;（ゴードン＆スコット、2009）、構成的に強力なチューブリンのプロモーターによって駆動される全ての組織でGal80を表現フリップアウト構造、。 FLPを介した組換え時には、&gt; Gal80はグレーに反転され、Gal80式は、ET - FLPx2発現組織で終端されています。 浴槽P&gt;停止&gt; Gal80（ボームら、2010）、通常の条件下でGal80を表現していない構造、内蔵フリップ。 Gal80式は、FLPが&gt;停止を引き抜こうとGal80で反転したET - FLPx2発現組織でチューブリンプロモーターで有効になっています。 </li><li>複眼でFLPの活性を試験するためのハエ GMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽P&gt;&gt;縮退しているGal80（ボームら、2010）、およびdepigmented目を止める。 FLP発現視細胞では、polyQの発現はGal80フリップで次のオフになっています。 GMR - GAL4、UAS - polyQ、正常な目をしている浴槽P&gt; Gal80&gt;（ボームら、2010）、。にFLP発現視細胞を、polyQの発現は、Gal80をフリップアウトは、次のオンになっています。 </li></ol> 2。試薬リン酸緩衝生理食塩水（PBS、1X）、pHは7.4。 16％からPBSで希釈した4％パラホルムアルデヒド（PFA）、PFA、EMグレード（カタログ番号15710、電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア州） PBT、0.1％トリトン- X 100（Sigma）を含む1XPBS 抗Elav（モノクローナル抗体、9F8A9、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）、汚れショウジョウバエのすべてのニューロン。 抗レポ（モノクローナル抗体8D12、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）ショウジョウバエの染色グリア細胞。 マウス二次抗体（Invitrogen社）に対して、アレクサ594チキン 3。エンハンサートラップFLPx2線（*重要なステップ）の発現パターンのマ​​ッピング<ol><li> YWから処女の女性は、アクチンP&gt; CD2&gt; Gal4の収集、UAS - GFPのラインを、個々のET - FLPx2行の男性に渡ります。前者は、ET - FLPの組織発現のためのGFPレポーターとして機能します。 </li><li> *第3齢幼虫のF1幼虫を彷徨解剖、氷冷PBSで3倍の洗浄、氷上で4％PFAで1時間固定、CNS（すなわち、脳と腹側神経索、VNC）と体壁の保持が続くPBTと3X洗浄。 解剖 <ol><li>放浪の第3齢F1幼虫を取り出して、きれいなSylgard皿（Sylgardの2グラムで満たされた35ミリメートルx 10 mmのペトリ皿-混合の指示を製造するのに応じて）に入れます。 <ol><li>絵筆で食べ物のかすを取り除く</li></ol></li><li>幼虫を麻酔するために氷の上に氷冷1XPBSと場所で皿を埋める</li><li>ピンセットで幼虫の口のフックを押しながら、鉗子の別のペアとし、後端に向かって表皮の皮延長前部気門の近くにキューティクルをつかむ。 CNSは、口の唾液腺、腸、および成虫ディスクと一緒にフックに添付されます。 </li><li>過剰な組織と中枢神経系を取り巻く成虫ディスクを取り外します。 </li><li> PBSで満たされた3もパイレックスの皿にCNSを移す。 <ol><li>シリコーンP200ピペットチップは、組織の乾燥を避けるために使用することができます。 </li></ol></li><li>氷上で4％PFA液200μlで1時間を修正しました。 <ol><li> CNSが完全にPFAで水没されていることを確認します。 <ol><li> CNSが浮く場合、これは通常、中枢神経系が適切に周囲の組織からクリーンアップされないことを示唆している。 </li></ol></li></ol></li><li> PBTと3X洗浄に続いて氷冷PBSで3倍洗浄する。 </li></ol></li><li> *大人F1ハエの中枢神経系を解剖。 <ol><li> CO 2でハエを麻酔または10分間氷上で空の瓶の内部に含まれているハエを置きます。 </li><li>場所の成人は30秒間、氷の95％EtOHを充填ガラス皿に飛ぶ。 </li><li>氷の上にガラス皿を埋め1XPBSに大人のハエを移す。 <ol><li>残留エタノールを除去するために氷冷した1 × PBSで3倍洗う</li></ol></li><li> 35ミリメートルSylgaにフライを置き氷冷した1 × PBSで満たされたRD皿</li><li>上に向けて腹側を置き、腹部から小さな虫のペン（minutiensピン0.1mm）を途中に挿入する。 <ol><li>ピンセットを使用すると、足の基盤を保持し、鉗子の別のペアで脚を取り外します。 </li></ol></li><li>頭の表皮を削除します。 <ol><li>鉗子の一組で長い鼻をつかんでいる間、眼の下やフライの頭部の背側正中に向かって表皮の皮の別を置きます。 </li><li>他の目をつかみ、反対側の残りのキューティクルを削除します。 </li><li>鋭い鉗子及び/または尖ったタングステン針を使用して、脳を取り巻く気管組織を取り除く<ol><li>気管の不適切なクリーニングは、GFPの発現を妨害し、自家蛍光の強いにつながる、と脳が修復中にフロートすることができます</li></ol></li></ol></li><li> VNCの解剖<ol><li>胸部キューティクルを削除します。 <ol><li>第3 preepisternumの両側の2つの鉗子（すなわち、後脚のベースをつかんで）場所、胸部の後端から始まる。 </li><li>ゆっくりと、離れて腹側正中線からキューティクルを区切るには首の付け根に到達するまでこれを繰り返す。 </li><li>静かにVNCを公開胸部キューティクルの両半分を広げ</li></ol></li><li>次の胸部から腹部を削除します。番目のレグベースで胸部を保持するためにピンセットを使用しながら、第一腹部腹板の近くに腹部をつかむために鉗子の別のペアを使用し、腹部をやってのける。 </li><li>周囲の胸部組織からVNCを削除する。ピンセットを持つと胸部枝肉の部分を離れて引き裂く穏やかな鉗子の別のペアと上腕骨の面積を持ちます。 </li><li>この時点で子宮頸部の結合（首）を周囲の結合組織のリングがあるはずです。 two鉗子を使用すると、離れてリングを引き裂く。 </li><li> VNCを囲む余分な胸部組織を削除します。 </li></ol></li><li>氷上で1 × PBSを含む9もパイレックスの皿に脳やVNCを転送する<ol><li>シリコーンP200ピペットチップは、組織の乾燥を避けるために使用することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> *氷上で4％PFAで1時間大人CNSを修正し、PBTとの氷冷PBSで3倍と3倍洗う。 </li><li> 4で成体中枢神経系の準備や幼虫中枢神経系と体壁をインキュベート° Cのどちらかの神経細胞（抗Elav、1:10）やグリア（anti-Repo. 1:10）に対する抗体と一晩。 PBTで5倍の準備を洗ってください。 </li><li> 2時間室温でマウス二次抗体（1:100）に対してアレクサ594鶏肉と大人や幼虫の準備でインキュベートし、PBSで準備を洗う。 </li><li>スライド上の幼虫、大人のCNSをマウントします。 CNSの自然な形状を維持するために、カバースリップを一時停止するミニブリッジとしてスライドでO字型のプラスチックリング（クリア補強ラベル、エイブリィデニソン、オフィス製品、ブレア、カリフォルニア州）を使用します。 </li><li>蛍光顕微鏡下でGFPとElav（またはレポ）発現パターンのための準備を調べます。 </li></ol> 4。光受容体の抑圧Gal4の内の2つの補完的なGal80コンバートツールの応用<ol><li>浴槽を経由してPを Gal80を反 ​​転&gt; Gal80&gt;（ 図5A）。 <ol><li>浴槽P&gt; Gal80&gt;ライン、GMR - GAL4、UAS - polyQから男性を集める。複眼は、これらのハエに正常であることに注意してください。 </li><li> EY - FLPの処女とメイト。 </li><li> F1ハエを収集し、目の表現型を調べる。 </li></ol></li><li>を経由して浴槽にGal80を反 ​​転P&gt;&gt; Gal80（ 図5B）を停止。 <ol><li> GMR - GAL4、UAS - polyQを収集し、浴槽Pは &gt;&gt; Gal80男性のハエを停止し、目の表現型を調べる。野生型株（カントン- S）に比べて退化し、これらのハエでdepigmented目の点に注意してください。 </li><li> EY - FLPの処女とメイト。 </li><li> F1ハエを収集し、目の表現型を調べる。 </li></ol></li><li>視細胞における発現とET - FLPx2行を選択します</li></ol>ステップ4.1と4.2は、視細胞のサブセットに発現するFLPそのET - FLPx2線を用いて繰り返すことができます。また、いずれのGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽P&gt;停止&gt; Gal80ハエまたはGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽P&gt; Gal80&gt;ハエは、その急行線の画面に、個々のET - FLPx2線に交差することができます。視細胞におけるFLP。貴重なET - FLPx2行はサブセットまたは、単一の光受容細胞（ 図6）でのみ発現するのFLPのことです。 5。代表的な結果特定のET - FLPx2ラインの発現パターンは容易に検討し、YW、アクチンP間のクロスから派生したF1幼虫、大人のハエに記載することができます&gt; CD2&gt; Gal4の、UAS - GFPの処女とET - FLPx2男性（ 図1） 。通常は3〜5は、F1動物の複製FLPの発現パターン（ボームら、2010）の再現性を決定するために解剖して調べられます。 <st栄&gt;図2は、幼虫と成体中枢神経系におけるET - FLPx2ライン173AにおいてFLPの発現パターンを示しています。 FLPパターンは、さらに神経細胞やグリアマーカー（ 図3＆4）を用いて解析することができます。 図7に示した結果は、Gal80フリップでの有効性を示し、Gal4の以下のFLPを介した組換えの共通部分の抑制にシステムをアウトフリップ。浴槽は、P&gt;停止&gt; Gal80構造はGal80（光受容体の均一な変性と色素脱失に基づく）のいずれかの漏出表現を持つように表示されず、まだそれはGMRを抑制するeyFLPの助けを借りてでGal80を反 ​​転の効果100％保証されています。 GAL4と通常の外観（ 図7A）に目を戻す。逆に、浴槽Pは &gt; Gal80&gt;完全に前eyFLPの導入にGMR - Gal4のを抑制する。縮退とdepigmented目（ 図7B）につながるUAS - polyQの発現Gal80フリップアウトに続いて、GMR - Gal4のドライブ、。この例では、我々は、感光体&quot;回路&quot;をマップするために汎photorecetorのFLPを使用したが、行動の結果を調べていませんでした。行動関連Gal4の行で同様のアプローチを用いて、我々は成人ハエの翅の拡大（ボームら、2010）規制CCAP - Gal4の回路の一部をマッピング。我々はFINGRメソッドが行動の神経基盤の理解を助けるには価値があると考えている。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 ET - FLPx2ラインの発現パターンを検討 FLPの発現パターン（青い楕円）は、ET - FLPx2ラインがアクチンP&gt; CD2&gt; Gal4のとET - FLPx2オス（左上）交差によって決定することができるから、。UASをGFP処女（右上）。ユビキタスアクチンP親の雌で&gt; Gal4の発現は、FRT（グレーの三角形）に挟まれたCD2の配列の挿入によって妨げられている。 F1子孫で、FLPには消費税CD2のシーケンスを、UAS - GFPの発現を駆動するアクチンP&gt; Gal4の許可なります。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。幼生と成体中枢神経系におけるET - FLPx2ラインの発現パターン 。これらのイメージは、YW、アクチンP&gt; CD2&gt; Gal4のとの交配から生産子孫から解剖CNS（脳と腹側神経索、VNC）を描く、UAS - GFPの親ET - FLPx2 173Aラインに。 &gt; CD2&gt;カセットを再結合することによって、FLPはアクチンP&gt; GAL4発現（UAS - GFPの結果として発現）を活性化。したがって、GFPのパターンは、FLP発現細胞を報告します。パネルBはライン173Aにおいて成人発現パターンを示すのに対し、パネルは、幼虫のFLPの発現パターンを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 ET - FLPx2ライン＃688Aでフリッパーゼを発現する細胞の種類の特性評価。、ET - FLPx2ライン＃688AとGFPフリッパーゼの報告ライン間のクロスから抗REPOで染色固定F1第3齢幼虫の合成画像。第3齢幼虫からVNCの後端から取られたBD、高倍率（ツァイスプラン-アポクロマート63xオイル）ビュー。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。 ET - FLPx2ライン＃150のキノコ体の中の細胞型の特性評価。AC、抗REPOで染色固定F1 3齢幼虫からキノコ体の高倍率の画像（63x油浸）。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。 Gal80フリップのとフリップアウト戦略のイラスト。フリップアウト戦略でA.、チューブリンプロモーター駆動Gal80（バスタブP&gt; Gal80&gt;）GMR - GAL4の弾圧と野生型の眼の表現型（赤眼）で、その結果、構成的に活性である。この弾圧は、Gal80を反転（中央、赤）とUAS - polyQの発現を駆動するGMR - Gal4のを可能にするFLP（紫）の導入、によって除去される。光受容体細胞変性のこの結果（目の白い点で示される）。B。以前の戦略の逆数で、チューブリンプロモーター駆動Gal80式が&quot;ストップ&quot;コドンに挟まれたFRT（グレーの三角形）によって中断される。 Gal80がない場合には、GMR - Gal4のは、光受容体の神経変性を（目の白い点で示される）原因とUAS - polyQに結合する。視細胞でFLPを表現処女雌と浴槽Pは &gt;停止&gt; GAL80男性、FLP（紫）は、&quot;ストップ&quot;コドン（真ん中を切り出す、FRT部位で組換えを触媒する、GMR - GAL4、UAS - polyQを交配することによってしたがって、Gal80表現とGMR - GAL4の弾圧を可能に赤）、。これが（wの欠如によって示される視細胞に神経変性を留保目のハイトドット）。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。 。tubP&gt; GAL80男性、ET - FLPx2ライン＃688A ET - FLPx2ライン＃688A処女との間のクロスからGMR - GAL4、UAS - polyQのF1子孫を使用してアウトGal80をフリッピングでFINGR法の適用 。目のommatidiumの複数形の中央にある色素の欠如は、ライン＃688AでFLP式を表します。このエリアではGMR - GAL4のGal80抑制がGal4のは、UAS - polyQを駆動できるようにホッとした。 <img src="/files/ftp_upload/2649/2649fig7.jpg" alt="図7"/> 図7。光受容体におけるGal4の交差するまたは縮小Gal80をフリッピングでFINGR法の適用。 A.浴槽P&gt;停止&gt; Gal80システムフリップには、FLP -依存的にGAL4の発現を制限する。でGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽P&gt;停止&gt; GAL80ハエ、視細胞（左フライ）縮退とdepigmentedされています。 eyFLPの導入後、Gal80は順番に式のpolyQをオフにし、通常の眼（右フライ）でハエを生成するGMR - Gal4の、の完全な抑圧の結果、光受容細胞に発現している。B.浴槽P&gt; Gal80&gt;フリップは、アウトシステムは、浴槽と反対のやり方で動作するP&gt;停止&gt; Gal80フリップのシステム。浴槽Pは &gt; Gal80は&gt;恒常的にGAL4を抑制し、polyQの発現を（左フライ、正常な眼を持つ）を抑制。 eyFLPの導入後、Gal80はGMR - GAL4の抑制を緩和し、表現のpolyQをオンにし、視細胞から反転されます。これは縮退とdepigmented目（右のフライ）とハエにつながります。

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利害の衝突は宣言されません。

Gal4/UASシステムが広くされ、正常様々な生物学的研究のためのDrosophilists（;ダフィー、2002ブランド＆Perrimon、1993）で使用されています。日付に、ハエのコミュニティは、プロモーター主導とエンハンサートラップGal4の何千行が生成されています。 FINGR法の大きな強みは、それが可能と大幅にショウジョウバエの研究でGAL4の力を拡大すること、Gal4/UASのシステムと互換性があることです。 FINGRの方法の一つの重要なアプリケーションは、Gal4/Gal80交差点通過行動の根底にある微調整する神経回路にすることです。これらの動作が含まれる可能性がありますが、学習と記憶、求愛、睡眠、および概日リズムが、これらに限定されない。 FINGRメソッドはまた、アルツハイマー病などのヒトの神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、およびパーキンソン病のモデリングにおける神経変性を受けやすい重要なニューロンをマップするために使用することができます。同様に、コカイン、アルコール、および他の物質の中毒を仲介するための重要な神経細胞や神経回路の病巣は、FINGRメソッドを使用してマッピングされる可能性があります。神経回路と行動の時間的な制御を得るためにFINGRメソッドで使用することができる、それは条件付きGal4sが（。。ローマンら、2001オスターヴァルダーら、2001）ことに留意すべきである。温度に敏感なGal80（Gal80 TS、マクガイアら、2003）を使用して、Gal80、変換ツールの変更は、生成することができます浴槽P&gt;停止&gt; Gal80 TSまたは浴槽P&gt; Gal80 TS&gt;、回路の操作で、さらに時間的な柔軟性を追加する。神経系を越えて、FINGRメソッドは、翼や足であるかどうか細胞のサブセットでGal4の発現を制限することも同様に適用できる。 ET - FLPx2線はMARCM（リー＆羅、1999）を含むFRT / FLPベースのクローン解析（徐＆ルービン、1993）、に興味があるすべてのショウジョウバエの生物学者にとって貴重なリソースとなります。また、一部のET - FLPx2ラインが再現可能なクローンを生成するため、繰り返し形態学的および行動解析のためのヒートショック- FLPを交換することが期待される。エンハンサートラップGal4の行と同じように、ほとんどのET - FLPx2ラインは自分の興味のある細胞で特異的に発現されることはほとんどありません。ほとんどの行は、目的の細胞と同様に他の細胞や組織のFLPを発現するであろう。しかし、Gal4のとET - FLPx2両方の&quot;組織特異性&quot;の欠如は、長い間彼らの重複領域が特定の実験のための望ましいとしてFINGR方式のための主要な関心事にはなりません。 FINGRは、洗練された一つに二つの&quot;広範な&quot;システムを変えるように設計されています。 これらのプロトコルで示された方法は、かなり標準的であると再現可能でなければなりません。自分の注意を要する主な注意事項の手順では、固定液の選択と使用法です。彼らはGFPのシグナルを消光するため、PFA以外の固定液は避けてください。我々はまた、解剖皿がFLPの発現が確実にGFPによって報告されなくなる可能性を避けるために、PFAで固定のために使用すべきではないことに注意した。

mapping and application of enhancer-trap flippase expression in larval and adult drosophila cns

Gal4の/ UASバイナリ法では、 ショウジョウバエの遺伝子と神経回路の操作のための強力です。ほとんどの神経生物学研究のために、しかし、Gal4の発現はほとんど行動リードアウトと回路の正確な相関関係を可能にするために十分な組織特異的ではありません。この大きなハードルを克服するために、我々は最近、関心の組織でより制限Gal4の発現を達成するためにFINGR方法を開発した。 FLP / FRTを介するGal80変換するツールの2）のセット;伝統的なGal4/UASシステム1）と3）エンハンサートラップFLP（ET - FLP）：FINGRメソッドは、3つのコンポーネントがあります。 Gal4のは、関心の主要な神経回路を定義するために使用されます。このようなUAS - MJD78QまたはUAS市TSとして、UAS -エフェクターとGal4のペアリング、順番にハエの行動の変化によって明示される神経活動を調節する。このようなUAS - GFPなどの追加UAS -レポーターで、特定の動作に関わる神経回路を同時に形態素解析のためにマッピングすることができます。浴槽P&gt; Gal80&gt;（&#39;外フリップ&#39;）と浴槽P&gt;停止&gt; Gal80（&#39;に反転&quot;）：広範な発現とGal4の行については、Gal4の発現は、二つの相補Gal80 -変換ツールを使うことで制限できます。最後に、捜査官が組織特異的ET - FLPの助けを借りて、それぞれ、Gal80をオンまたはオフにすることができます。 Gal4のとET - FLPが交差する場所にフリップのモードでは、Gal80はGal4の発現を抑制します。フリップアウトモードでは、Gal80はGal4のとFLP重複している細胞でGal4の抑圧を軽減します。どちらのアプローチは、GAL4 -定義された回路内のセル数の制限を有効にし、その逆パターンで。 FINGRメソッドは、Gal4のハエのコミュニティ内の行と伝統的なクローン分析のためにと神経回路のマッピングのための、汎用性の高い膨大なコレクションと互換性があります。このプロトコルでは、我々は選択ET - FLPx2線と視細胞におけるFINGR法の有効性のFLP発現パターンのマ​​ッピングを示しています。 FINGR法の原理はまた、Gal80 Gal4/UAS内の他の遺伝的モデル生物にも適用できるものです、とFLP / FRTが使用されます。

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

我々は、Gal80発現パターンを決定するために組織特異的なFLPを可能にする、フリッパーゼ誘発性横切るGal80/Gal4弾圧（F​​INGR）メソッドを説明します。どこGal4のとFLPのオーバーラップは、Gal4の発現がオンになっています（Gal80アウト反転）またはオフ（Gal80がに反転）。 FINGRメソッドは、クローンの解析と神経回路のマッピングのための汎用性があります。

エンハンサートラップフリッパーゼの幼虫における発現と成人のマッピングとその応用ショウジョウバエ CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

mapping-application-enhancer-trap-flippase-expression-larval-adult

Nanyang Technological University

Research

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Neuroscience

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

16.4K ビュー.  University of Oklahoma - Norman. 我々は、Gal80発現パターンを決定するために組織特異的なFLPを可能にする、フリッパーゼ誘発性横切るGal80/Gal4弾圧（F​​INGR）メソッドを説明します。どこGal4のとFLPのオーバーラップは、Gal4の発現がオンになっています（Gal80アウト反転）またはオフ（Gal80がに反転）。 FINGRメソッドは、クローンの解析と神経回路のマッピングのための汎用性があります...

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Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

神経科学

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

ハイフィールドのfMRIを使って大人の猫における聴覚皮質の機能イメージング

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

の高品質のデジタルビデオを買収<em&gt;ショウジョウバエ</em横から見た&gt;幼虫と大人の行動

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

大人のための味の好みアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...