Nosso protocolo demonstra que o ECM pode promover a diferenciação adipogênica na ausência de mediadores adipogênicos clássicos e é o primeiro a demonstrar a regulação específica da doença do metabolismo celular pelo ECM. Nossa técnica fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos no metabolismo tecidual adiposo e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase tecidual. Em comparação com a cultura celular 2D padrão, nosso modelo 3D permite um exame mais robusto e dissecção de conversa cruzada entre adipócitos e ECM tecidual no contexto do diabetes tipo 2.
Recomendamos começar com amostras menores para medir o quão bem é celularizado. Tenha em mente que há variabilidade interpata em como as células crescem bem e quão bem o tecido se descelulariza. É importante observar o tecido antes e depois de cada passo para garantir que o tecido esteja se descelularizado e entender possíveis diferenças entre as amostras.
Após a obtenção de tecido adiposo visceral ou IVA da cirurgia, prepare-o para armazenamento adicionando 5-10 gramas do tecido a 15-25 mililitros de solução tampão congelante em um tubo cônico de 50 mililitros. Mergulhe completamente a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius até a descelularização. Para o isolamento pré-iadipócito, coloque dois gramas de uma amostra fresca de IVA intacto em 20 mililitros de solução tipo II de colagem, em seguida, insira uma tesoura estéril no tubo e pique completamente o tecido.
Uma vez picado a um chorume fino, incuba-o na solução de colagemnase a 37 graus Celsius em um agitador orbital por 60 minutos. Após a incubação, filtre o resultante digerido através de uma malha de nylon de 100 micrômetros em um tubo cônico fresco de 50 mililitros. O digerido deve ser um líquido amarelo-laranja com viscosidade moderada e uma pequena quantidade de fios residuais de tecido não digerido.
Centrifugar a amostra a 270 vezes g por 10 minutos, remover o supernasal e resuspensar a pelota celular em dois mililitros de solução 1X RBC com uma pipeta. Incubar a solução por um minuto a 25 graus Celsius, depois adicionar 10 mililitros de 15% FBS DMEM F12 e centrifuá-la a 270 vezes g por 10 minutos. Para preparar o ECM, congele/descongele a amostra de IVA previamente congelada a 37 graus Celsius, incubando-a em um banho de água pré-aquecido por 20 minutos com agitação manual suave periódica.
Uma vez descongelado, transfira o tecido de volta para menos 80 graus Celsius por 20 minutos e repita o processo de congelamento/degelo três vezes terminando com o descongelamento. Use fórceps estéreis para transferir a amostra do IVA para um tubo cônico fresco de 50 mililitros contendo 15-25 mililitros de solução enzimática 1 certificando-se de que a amostra está totalmente imersa. Em seguida, incuba-lo durante a noite a 37 graus Celsius enquanto treme a 130 RPM.
No dia seguinte, lave a amostra três vezes com 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem, derramando a solução após cada lavagem. Transfira a amostra para um tubo fresco de 50 mililitros com 15-25 mililitros de solução enzimática 2 e incuba-a durante a noite. Repita as lavagens com a solução de tampão de lavagem e transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de extração de solvente polar.
Incubar a amostra durante a noite enquanto treme. Após a incubação com a solução de solvente polar, é importante examinar a amostra para remoção lipídica. Se a maioria do lipídio não for removida, pode ser necessário repetir esta etapa.
Pode-se usar um tempo de incubação mais curto. Após a incubação, transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem e lave a amostra três vezes no shaker. Em seguida, lave a amostra três vezes com solução de 70% de etanol, derramando o etanol após cada lavagem.
Lave a amostra uma vez com a solução de armazenamento e use fórceps estéreis para transferir para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de armazenamento, certificando-se de imergi-la completamente. A amostra pode então ser armazenada a quatro graus Celsius por até um mês. O isopropanol e o etanol são inflamáveis e devem estar em temperatura ambiente e descartados em resíduos inflamáveis.
Qualquer resíduo humano deve ser descartado separadamente dos resíduos de risco biológico usuais. Transfira os fragmentos de ECM armazenados para poços individuais de uma placa de 24 poços com fórceps estéreis adicionando quantos fragmentos necessários para os ensaios planejados a jusante. Lave-os três vezes com 500 microlitadores de 70% de etanol em um agitador orbital, depois reidrate-os lavando-os três vezes com PBS.
Use uma tesoura estéril para cortar o ECM em fragmentos de 100 miligramas. Coloque cada fragmento em um poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa a 25 graus Celsius por 15 minutos para permitir que o excesso de PBS extrude dos fragmentos. Em seguida, remova cuidadosamente qualquer pbs restante dos poços com uma pipeta.
Semente cada fragmento com 20 microliters de suspensão celular pré-apócito, pipetando as células diretamente para o ECM. Coloque a ponta da pipeta no ECM e expulse-a suavemente para o centro da matriz certificando-se de que a suspensão da célula não transborda e acabe na parte inferior do poço. Se a suspensão da célula transbordar do ECM, remova a ponta da pipeta daquele local e insira-a em outro lugar do ECM.
Após a semeadura celular, incubar o ECM por 40 minutos a 37 graus Celsius. Encha cada poço com 500 microliters de mídia de crescimento para cobrir os fragmentos de ECM semeados. Cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 72 horas.
Após 72 horas, aspire cuidadosamente a mídia de crescimento sem perturbar o fragmento ECM. Adicione 500 microliters de mídia de diferenciação e cultura as células por 14 dias mudando a mídia a cada dois ou três dias. Verifique se há diferenciação usando microscopia leve.
As células acumularão lipídios, tornarão marrom-amarelo na cor e se tornarão mais esféricas à medida que se diferenciam. A preparação do tecido adiposo ECM, a semeadura com pré-adipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros foram monitoradas com microscopia eletrônica de varredura que revelou a descelularização do ECM e posterior recapitulação de lipídio contendo adipócitos após a ressecação e diferenciação. A imunohistoquímica específica do ECM descelularizado mostrou manutenção da micro arquitetura de colágeno, enquanto a coloração de óleo vermelho-O de construções 3D ECM-adipócitos mostrou lipídio contendo adipócitos.
Os adipócitos diferenciados no ECM foram rastreados para genes adipogênicos utilizando PCR quantitativo em tempo real que demonstrou que esses genes são regulados nas células diferenciadas em relação a preadipócitos indiferenciados cultivados em ECM. A diferença total nos níveis de transcrição é mostrada. Quatro combinações de ECM e adipócitos de sujeitos diabéticos e não diabéticos foram submetidas a fenotipagem metabólica.
A absorção de glicose prejudicada na função lipolítica foi descoberta em construções a partir de tecidos diabéticos. É importante ressaltar que o ECM não diabético resgata a absorção de glicose estimulada pela insulina e a capacidade lipolítica em adipócitos diabéticos. A contaminação dos preadipócitos isolados, do tecido descelularizado e do ECM reseeded não é incomum.
A esterilidade deve ser mantida diligentemente em todo o protocolo.
