Gostaríamos de agradecer ao grupo todo Maurer da Universidade de Washington, cujo conhecimento coletivo fez possível este protocolo. Financiamento para este trabalho é fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde Mental (1R01MH085495).

1. Preparação do Mestre modelado (Figura 1) <ol><li> Centro de wafer de silício sobre o spin-aplicador e lave o wafer com acetona durante a etapa inicial do programa de rotação de dois ciclos na Tabela 1. A acetona evapora durante a segunda etapa do programa de spin deixando um wafer, limpo e seco. </li><li> Aplicar cerca de 1 mL fotorresiste AZ9245 / in (em diâmetro) para a bolacha e spin-coat usando as condições descritas na Tabela 1. </li><li> Soft-cozer a bolacha fotorresiste revestido a 110 ° C por 2 m usando uma placa de alta uniformidade. </li><li> Photopattern o substrato utilizando um sistema de fotolitografia direto escrever ou um sistema de alinhador de máscara e uma máscara apropriada. Máscaras podem ser adquiridas a partir de um número de fontes comerciais. Além disso, transparências impressas com tinta absorvente UV, gravada para um apartamento óptica, pode ser usado para produzir padrões com características de grande porte. </li><li> Desenvolver o wafer estampados em 1:2 desenvolvedor 400K: semi-condutores de água deionizada para a grade 1 m 45 s, com agitação suave. Lavar cuidadosamente com semi-condutores de água de grau deionizada e seque com uma corrente de azoto (N 2) de gás. Desenvolvimento padrão pode ser verificada com um microscópio com um filtro UV. Se o padrão não está totalmente desenvolvido, o wafer pode ser devolvido para a solução de desenvolvimento para o tempo adicional. </li></ol> Nota: Para melhores resultados, photopatterning devem ser realizadas em um ambiente de sala limpa. 2. Preparação de PDMS Stamp (Figura 2) <ol><li> Preparar uma resina 10:01 por peso: mistura endurecedor de Sylgard 182 (PDMS) e cobrir completamente o mestre (wafer photopatterned) com a mistura em uma placa de Petri descartável. </li><li> De-gás PDMS coberto mestre em um exsicador de vácuo até que não haja bolhas são visíveis e permitir que o selo para a cura em estufa a 65 ° C por 1,5 h. Antes de curar, é importante certificar-se o mestre está no fundo do prato, pois pode subir à superfície durante a etapa de desgaseificação. </li><li> Corte o PDMS erradicar do mestre e ornamento para o tamanho apropriado. Armazenar o selo em um recipiente coberto (lado apresentam-se) para protegê-lo de poeira e detritos. </li></ol> 3. Preparação do substrato de ouro modelado (Figura 3) <ol><li> Prepare 25 milímetros no. 1 rodada lamínulas de vidro para a deposição de metal, tratando-as com plasma de oxigênio para 10 m. Enxágüe duas vezes com 18,2 de água deionizada mohms seguido por duas vezes com etanol, secagem com uma corrente de gás N 2 entre cada etapa. </li><li> Usando um bolso multi-sistema de deposição por feixe de elétrons, depósito de 50 Å de titânio seguido por 150 de ouro Å. Não ventilação do evaporador entre deposição da camada de titânio e camada de ouro. Alternativamente, revestidas de ouro lamelas podem ser adquiridos a partir de uma variedade de fornecedores, no entanto, é importante que as camadas de metal são preparados por evaporação por feixe de elétrons e evaporação térmica não. Se comprado de uma fonte externa, substratos de ouro pode ser limpa por oxidação plasma ou &quot;piranha&quot; (7:3 Conc H 2 SO 4:. 30% H 2 O 2) 11 antes de usar. </li></ol> Nota: &quot;Piranha&quot; solução é explosiva na presença de compostos orgânicos. <ol start="3"><li> Prepare a solução stamping, 10 hexadecanethiol mM em etanol absoluto ea solução de aterro, 1 mM glicol terminada tiol em etanol absoluto. </li><li> Lavar o selo com etanol e seque bem com gás N 2. Aplicar solução para carimbar o selo gotas PDMS até totalmente revestido. Seque o selo cuidadosamente com gás N 2. Proceder a 5a e 5b conforme o caso com base nas características do selo PDMS. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pressione suavemente o selo sobre o substrato de ouro e permitir que a monocamada para formar por 15 s. </li><li> Coloque o substrato de ouro em uma placa de Petri contendo 18,2 de água deionizada mohms, garantindo o substrato está submerso. Pressione suavemente o selo sobre o substrato de ouro e permitir que a monocamada para formar por 15 s. </li></ol></li><li> Lavar o substrato carimbada duas vezes com etanol, secagem com gás N 2 após cada lavagem e coloque o substrato em uma placa de Petri. </li><li> Cobrir o substrato com solução de aterro e selar o prato com parafilme para evitar a evaporação. </li><li> Permitir que a monocamada de fundo para formar no escuro por 12-14 h. </li><li> Retirar as lamelas padronizada a partir da solução de enchimento e enxaguar duas vezes com etanol, secagem com gás N 2 após cada lavagem. </li></ol> 4. Aplicação de proteínas e células para o substrato Patterned <ol><li> Coloque a lamela estampados em uma pequena placa de Petri ou câmara de cultura de células e cobrir com 500 mL a 1 mL de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS). O DPBS deve cobrir completamente o substrato durante a incubação de proteína para garantir uma cobertura de proteína. </li><li> Adicionar uma solução concentrada de proteínas para o DPBS e misturar a solução por pipeting várias vezes. Incubar a mistura de proteína com o substrato a 37 ° C por 1 h. Concentrações finais de laminina e fibronectina são tipicamente 12 mcg / mL e 20 mcg / ml, respectivamente. Proteínas podem ser rotulados com um corante reativo de amina fluorescentes para permitir a visualização padrão fácil. No entanto, a proteína com a etiqueta deve ser misturado com proteína unlabeled 01:01 a rotulagem de proteínas pode interferir com a atividade biológica. </li><li> Após a incubação, lavar abundantemente com o substrato DPBS (4-5x) para remover proteína desacoplado, tomando cuidado para não secar o substrato ou levá-lo através da interface ar-água. Após as três primeiras lavagens, adicionar aproximadamente 500 mL de meio de crescimento de células completo para manter um substrato molhado. </li><li> Substituir o meio de crescimento usado para lavar o substrato com a mídia fresco. </li><li> Dissociar e contagem de células para revestimento sobre o substrato. Ou células dissociadas primários, como os neurônios do hipocampo, ou linhagens de células imortalizadas, como células CHO-K1, pode ser utilizado. </li><li> Células placa dissociado sobre o substrato. Tipicamente 30 a 200 células / mm 2 são utilizados. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquemática gerais para a preparação de um mestre de fotolitografia padrão. Neste processo, uma bolacha de silício é limpa com acetona, revestidas com fotorresiste, expostos ao padrão de interesse, eo padrão é desenvolvido. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Gerais esquemático para PDMS preparação selo. Neste processo, o mestre padronizada é coberto com Sylgard (10:1 resina: endurecedor), de-gaseados num exsicador de vácuo, curada em estufa a 60 ° C e cortados. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Esquemática Geral de padronização substrato. Neste processo, substratos de vidro são revestidas com titânio (50A) e ouro (150A), utilizando um evaporador feixe de elétrons, modelado por hexadecanethiol microcontact impressão usando um carimbo de PDMS, backfilled com tióis glicol terminado alcano, e revestido com proteína fluorescente-rotulados. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Patterned master (A) e PDMS selo (B) preparado usando os métodos descritos. Barras de escala são 100μm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Figura 5"/> SAMs Figura 5. Patterned visualizado com AlexaFluor 647-rotulados fibronectina (A) e CHO-K1 confinamento celular (B). Barras de escala são 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Patterned laminina semeados com neurônios de rato E18 hipocampo menos 4 dias in vitro. AlexaFluor 350-conjugados de anticorpos anti-laminina é utilizado para a visualização padrão (A) e E18 neurônios do hipocampo do rato estão manchadas com MitoTracker Red 580 (B). Barras de escala são 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Armadilhas potenciais no preparo do substrato padrão visualizado por AlexaFluor 647-conjugados fibronectina adsorção. (A) insuficiente leva a mistura irregular adsorção de proteínas. (B) aplicação irregular de pressão durante stamping leva à transferência parcial patten. (C) A pressão excessiva durante a estampagem pode levar ao colapso do selo. (D) de exposição da superfície padronizada para a interface ar-água durante a lavagem pode resultar em fundo adsorção de proteínas. Barras de escala são 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Padronização submerso pode produzir padrões com características pequenas que são difíceis de impressão, impressão convencional microcontact no ar. Imagens (A) e (B) mostram diferentes regiões do mesmo padrão, impressas com o selo PDMS mesmo no ar (A) ou água deionizada (B). Linhas de 10μm de largura de apoio que cercam o padrão (adicionado para ajudar a evitar o colapso de selo) são vistos em (A), no entanto, as características menores dot como mostrado em (B) não são vistos. Isso demonstra que a impressão no ar funciona bem para os recursos maiores, mas a impressão em água pode ser necessário para os padrões com recursos menores. Barras de escala são 20 mM. <table border="1"><tbody><tr><td> Ciclo </td><td> Taxa de aceleração (rpm / s) </td><td> Velocidade final (rpm) </td><td> Tempo (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tabela 1.Dois ciclos do programa de rotação usado para criar uma camada grossa de 4,5 mM AZ9245 em um wafer de silício. Para preparar selos PDMS para a formação de padrões substratos, um mestre em fotorresiste é o primeiro fabricadas (Figuras 1 e 4A). O mestre é o inverso do selo e é criado usando um sistema de litografia e gravação direta ou um alinhador de máscara. Quando um fotorresiste positivo, como AZ9245, é usado para a produção de mestre, o wafer resistir revestido é exposto à luz com o mesmo padrão que aparecerá sobre o substrato final. Embora nem sempre é possível, tem sido relatado que a proporção ideal (tamanho característica de resistir a espessura) para PDMS mestres selo é 1:2. 13 Descobrimos que proporções de 1:40 são possíveis, dependendo da natureza do padrão. AZ9245 wafers de silício revestido nas condições descritas aqui dar fotorresiste com uma espessura nominal de 4,5 mM. Nós descobrimos que essa espessura de AZ9245 pode ser usado para produzir mestres PDMS com recursos que variam de&gt; 100 mm até 2 micra. Selos PDMS são lançados a partir Sylgard 182 (ou Sylgard 184) usando o mestre fabricados a partir de fotorresiste (Figura 2). Mestres fotorresiste pode ser usado várias vezes para criar muitas cópias do mesmo selo. Após o endurecimento do PDMS, selos são removidos do mestre utilizando uma lâmina de barbear eo carimbo resultantes podem ser visualizadas em um microscópio, colocando recursos adicionais no selo para baixo sobre uma lamela de vidro (Figura 4B) Adequada resultados stamping em uma afiada padrão de proteínas, claro que pode ser visualizado através da aplicação de proteína fluorescente etiquetado (Figuras 3 e 5). Alternativamente, imuno-histoquímica pode ser usado para visualizar o padrão de proteínas após a fixação das células (Figura 6). Crescimento celular é bem limitada ao padrão de proteínas para ambas as linhas de células imortalizadas e pilhas (Figuras 5 e 6). Embora esta técnica é facilmente dominado, vários problemas comuns podem surgir. A aplicação da proteína sem mistura suficiente da solução de proteína concentrada no DPBS pode levar a padrões de proteínas desigual (Figura 7A). Stamping impróprio pode levar à transferência de padrões colapso parcial ou selo (Figura 7B-C). Além disso, expondo o substrato padronizado contendo proteínas adsorvidas ao ar podem prejudicar o monocamada causando diminuição da resistência no fundo (Figura 7D). Padrões composto de características muito pequenos (&lt;5 mm) e alta razão de aspecto muitas vezes requerem o uso da impressão microcontact submersas. Neste procedimento de água (3.5b) é usado como uma barreira para evitar hexadecanethiol de depósito sobre o substrato fora do padrão (Figura 8). 14

<ol>
	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma série de questões podem surgir na produção litográfica do mestre utilizado para PDMS criação de selo. Subexposição dos resultados resistir revestido wafer nos padrões nebulosas e indistintas e superexposição dos resultados resistir revestido wafer em recursos alargada ou faltando. Em geral, os mestres com tamanhos recurso de grande porte (&gt; 10 mm) são relativamente fáceis de desenvolver padrões e, ao mesmo tempo mestres com recursos menores podem exigir extensa otimização de parâmetros photopatt...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Pastilha de silício </td><td> Wafer Reclaim Serviços </td><td></td><td> 2 polegadas </td></tr><tr><td> Spin-coater / prato quente </td><td> Brewer Ciência </td><td> Cee 200CB Spin-Bake Sistema </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 Photoresist </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Direto escrever sistema de fotolitografia </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 Sistema LaserWriter </td><td></td></tr><tr><td> Alinhador de máscara </td><td> HTG </td><td> 3h </td><td></td></tr><tr><td> AZ Desenvolvedor 400K </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard Kit de elastômero de silicone 182 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 milímetros no. 1 rodada lamínulas de vidro </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Oxidizer Plasma </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Titânio peças Kamis </td><td> Incorporado </td><td></td><td> 99,95% puro </td></tr><tr><td> Pellets de ouro </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> 99,999% puro </td></tr><tr><td> Feixe de elétrons do evaporador </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> 75 sistema de deposição PVD Thin Film </td><td> com feixe de elétrons acessório </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenoglicol) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Pharmco-aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 prova, absoluta </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Sem cálcio e magnésio </td></tr><tr><td> Rato laminina I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina de plasma humano </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 ácido carboxílico, éster succinimidyl </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker Red 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 ácido carboxílico, éster succinimidyl </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo anti-laminina </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Impressão microcontact fornece um método rápido e altamente reprodutível para a criação de substratos bem definidos padronizada. Microcontact 1 Durante a impressão pode ser empregada para imprimir diretamente um grande número de moléculas, incluindo proteínas, DNA 2, 3 e silanos, 4 a formação de auto- monocamadas (SAMs) de tióis de cadeia longa alcano em ouro fornece uma maneira simples para confinar proteínas e células para padrões específicos contendo regiões adesivo e resistente. Esse confinamento pode ser usado para controlar a morfologia das células e é útil para examinar uma variedade de questões em proteínas e biologia celular. Aqui, descrevemos um método geral para a criação de padrões bem definidos de proteínas para estudos celulares 5 Esse processo envolve três etapas:. Produção de um mestre modelado usando fotolitografia, a criação de um selo de PDMS, e microcontact impressão de um ouro substrato revestido. Uma vez modelada, estes substratos de cultura de células são capazes de proteínas confinar e / ou células (pilhas ou linhas de células) para o padrão. O uso de auto-montagem química monocamada permite o controle preciso sobre o padrão regiões proteína / células adesivas e não adesivas regiões, o que não pode ser conseguido usando stamping proteína direta. Hexadecanethiol, a longa cadeia de tiol alcano utilizado na etapa de impressão microcontact, produz uma superfície hidrofóbica que prontamente adsorve proteína de solução. O glicol terminada tiol, utilizado para preenchimento das regiões não-impressos do substrato, cria uma monocamada que é resistente a adsorção de proteínas e, portanto, de crescimento celular. 6 Estes monômeros tiol produzir monocamadas altamente estruturado que definir com precisão as regiões do substrato que pode suportar adsorção de proteínas eo crescimento celular. Como resultado, estes substratos são úteis para uma ampla variedade de aplicações, desde o estudo do comportamento intercelular 7 para a criação de microeletrônica. 8 Enquanto outros tipos de química monocamada têm sido utilizados para estudos de cultura de células, incluindo o trabalho do nosso grupo usando trichlorosilanes para criar padrões diretamente sobre substratos de vidro, 9 monocamadas padrão formado a partir de tióis alcano em ouro são straight-forward para se preparar. Além disso, os monômeros usados ​​para a preparação monocamada estão disponíveis comercialmente, estável, e não necessitam de armazenamento ou manipulação sob atmosfera inerte. Substratos padronizados preparados a partir de tióis alcano também pode ser reciclado e reutilizado várias vezes, mantendo confinamento na cela 10.

Watch this Scientific Journal Video about Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement at JoVE.com

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

creating-two-dimensional-patterned-substrates-for-protein-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K visualizações.  Washington University in St. Louis. Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Vídeo: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Bioengenharia

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recuperação de fluorescência após a fusão uma gota de medir a difusão bidimensional de um Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Avaliação da proliferação queratinócito em duas e três dimensões tipo I colágeno substratos

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...