Estes estudos foram financiados, em parte, por doações da Fundação de Pesquisa e Desenvolvimento Alternativo (107.588), o Instituto Nacional de Saúde (1U54CA136465-04S1) e do Programa de Pesquisa de Câncer da Califórnia mama (201B-0141). Agradecemos Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor para a generosa doação de seu <pkt2 lubig=""> transponson e PK / hubiC-SB11 plasmídeos transposase. Agradecemos John Tamaresis, Ph.D. para aconselhamento sobre métodos estatísticos, Timothy Brown para a realização de citometria de fluxo, Georgette Henrich para aconselhamento sobre migrações ensaios, e Nancy Bellagamba para facilitar a coleta de espécimes THR. </pkt2>

Cabeças femorais foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia eletiva THR no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Todos os tecidos foram coletadas como espécimes identificados-de, em conformidade com a regulamentação do Compliance Office Research da Universidade de Stanford. 1. Seleção de uma linha (s) celular do cancro da mama <ol><li> Obter ou transfectar a linha celular de cancro da mama desejada (s) com uma construção repórter de luciferase-GFP. Os seguintes experimentos foram realizados utilizando o MCF-7 linhas celulares de cancro da mama projetados para a expressão estável de luciferase do pirilampo (FLUC) e reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) MDA-MB-231 e por transfecção com a Bela Adormecida transposon plasmídeo pKT2 / LuBiG e o pK transposase plasmídeo / hubiC-SB11 45,46. NOTA: As linhas de células transfectadas são referidos como MDA-MB-231-Fluc-EGFP, e MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isolar Tissue Fragments de cabeças femorais <ol><li> Após a cirurgia THR, recolher a cabeça femoral descartada em um recipiente estéril preenchido com soro fisiológico. Transferir a amostra para o laboratório e processá-lo dentro de 1-3 horas de cirurgia. Nota: se existir um atraso no processamento, colocar as amostras a 4 ° C. </li><li> Prepare uma área de trabalho, colocando os seguintes itens em uma manta absorvente em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô: luvas estéreis, rongeur cirúrgico, pinças, copo com 70% isopropanol para lavar os instrumentos, e em vasos de cultura de tecidos, conforme estipulado abaixo para cada tipo de experimento . </li><li> Vestindo uma luva cirúrgica estéril para segurar a cabeça do fêmur rodada em uma das mãos, use o rongeur na outra mão para extrair fragmentos de osso trabecular do tamanho desejado (~ 2-5 mm) do eixo superior exposta do fêmur. Transferir fragmentos de osso no interior do vaso de cultura (por exemplo, 6-, 12-, ou placa de cultura de tecidos ou câmara de migração de 24 poços), dependendo do tipo de proliferação, colonization ou migração experiência, como descrito nos passos 3, 4 ou 5. NOTA: fragmentos de tecido ósseo deve ser colhida, como descrito acima, após a conclusão das etapas iniciais para cada ensaio de proliferação, colonização ou de migração específica. Fragmentos irá variar em tamanho, como mostrado na Figura 2. Os fragmentos podem ser pesados ​​antes ou após as experiências para a finalidade de normalização. </li></ol> 3. Co-cultura de células cancerosas da mama vizinhos a fragmentos ósseos medir mama índice de proliferação celular BLI <ol><li> Antes do experimento, preparar uma suspensão contendo 2 x 10 5 células de cancro da mama / 50 ul, e preparar velas de cera de osso para imobilizar fragmentos ósseos em cultura. Corte uma ponta P200 micropipeta em 3 pedaços e usar a parte mais estreita da maior peça de uma forma &quot;pré-fabricadas&quot; para cortar pequenas (~ 35 mg) pedaços de cera de osso. Use a grande final do menor pedaço para ejetar os plugues de cera de osso em uma placa de Petripara armazenamento. </li><li> Coloque um pedaço de cera de osso na posição de 12 horas de cada poço e pressione suavemente para baixo com um dedo indicador estéril de luvas. </li><li> Pipetar 50 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-10% FBS + Pen-Strep no centro de cada poço de uma placa de 6 poços. (Alternativamente, as células de semente num padrão disperso se desejado). Colocar a placa a 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a fixação das células. </li><li> Coloque fragmento de um osso em um pedaço de cera de osso para cada bem experimental e aplique uma leve pressão com o rongeur para prendê-lo. Realizar experiências em triplicado, de tal modo que a partir de três fragmentos de osso numa dada amostra THR são colocados em três poços de topo, enquanto que o fundo três poços contêm cera de osso apenas como controles. </li><li> Usando uma pipeta de 5 ml, cuidadosa e lentamente entregar 5 ml de DMEM-10% de FBS ao lado de cada poço para evitar a retirada das células da mama ou fragmentos de ossos. Colocar a placa num 3776; C incubadora de cultura de tecidos durante 20-24 horas. </li><li> Para a realização de imagem de bioluminescência (BLI) remover a placa da incubadora e adicionar substrato luciferina (para obter uma concentração de 300 ug / ml) a cada poço. Imagem da placa imediatamente em uma plataforma de imagem IVIS usando os seguintes parâmetros: f-stop de 1, pequena binning, tempo de exposição de 1 segundo, o nível de D. Medir a intensidade do sinal de cada bem como radiância média (fótons / segundo centímetro / praça / steradian). </li><li> Use software de imagem para definir regiões de interesse (ROI) para quantificar o brilho médio para todos os poços experimental e controle. Exportação valores médios radiância para uma folha de Excel para executar estatísticas e gerar gráficos. </li></ol> 4. As células do cancro da mama-cultura Co semeadas diretamente em fragmentos de ossos para estudar Colonização e número de celular <ol><li> Utilize uma pinça para colocar os fragmentos ósseos directamente nos poços vazios de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos (1 fragmento / poço). </li><li> PipETTE um 50 ul de suspensão de células de gotículas de DMEM-10% FBS contendo 1 X outubro 3-6 células de cancro da mama directamente no topo de cada fragmento de osso. Colocar a placa a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante 45 minutos para promover a fixação das células. Adicionar cuidadosamente 1-2 mL de DMEM-10% de FBS para o lado de cada cavidade de tal modo que o fragmento é inteiramente submerso no meio. Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante 20-24 hr. </li><li> Após a incubação, utilize uma pinça para transferir cada fragmento de tecido ósseo de uma placa de 24 poços frescas contendo 1 mL de DMEM-10% de FBS em cada poço. Para executar BLI, siga os passos 3,6-3,7 acima. Além disso, os fragmentos podem ser visualizados utilizando um microscópio de fluorescência, ou descarregado para obtenção de uma população da medula para a análise do número de células de cancro da mama e as propriedades como descrito na etapa 6. </li><li> Para preparar os fragmentos intactos para uma avaliação qualitativa por microscopia de fluorescência seguinte BLI, pipeta de 5 mL de solução de etiquetagem fluorescente bisfosfonato (preparede de acordo com as instruções do fabricante) a cada poço para etiquetar as espículas mineralizadas dos fragmentos ósseos. Incubar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante mais 24 h. </li><li> Após 24 horas de cultura em fluorescente solução de etiquetagem com bifosfonatos, utilize uma pinça para transferir os fragmentos de placas de cultura de tecido contendo fenol médio e vista livre de vermelho usando um microscópio de fluorescência configuradas para GFP imagem (485 nm) e uma etiqueta com bifosfonatos (680 nm). </li></ol> 5. Medição de migração das células do cancro da mama para fragmentos de tecido ósseo e culta Osso Fragmento sobrenadantes <ol><li> A migração para o tecido ósseo sobrenadante da cultura. NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são usados ​​para gerar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, a migração é comparado em três poços contendo sobrenadantes ósseas vs. três poços contendo apenas meio controle. <ol><li> Gerar tis ósseaprocessar sobrenadantes colocando fragmentos ósseos nos poços de uma placa de 12 poços contendo 2,2 mL de DMEM-10% FBS por poço. Cultura em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora de 24 hr. Retirar o meio em 24 horas e substituir com 2,2 ml fresco DMEM-10% FBS. Tratar os poços de controlo contendo DMEM-FBS a 10% da mesma maneira. NOTA: O meio é mudado de 24 h para remover factores secretados em resposta a um trauma nos tecidos resultantes de cirurgia. Porque sobrenadantes tecido ósseo são geradas em FBS contendo médias, poços contendo FBS meio contendo apenas estão incluídos para controlar as contribuições de FBS a migração de células de câncer de mama. </li><li> Em 48 horas, recolher 0,9 ml de cada / sobrenadante e meio de controlo da pipeta para os poços de uma placa de receptor. As inserções serão posteriormente colocados nestas cavidades. Incubar a placa do receptor na cultura de tecidos incubadora enquanto semeando as inserções. Nota: O sobrenadante restante (~ 1 ml após a evaporação) podem ser coletadas para análise de secretoma factors se desejado 44. </li><li> Para semear as inserções Transwell, colocá-los em um padrão, vazio placa de 24 poços de cultura de tecidos. Pipetar 350 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-FBS a 10% sobre a superfície da membrana superior, interior de cada inserção como mostrado na Figura 1A. Colocar a placa de 24 poços contendo as inserções semeadas no 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a ligação. </li><li> Uma vez que as células se ligaram aos insertos, utilize uma pinça para transferir as inserções para a placa de receptor de acordo com as instruções do fabricante. Ângulo cada inserção ao colocá-la no receptor bem para evitar a formação de bolhas entre a membrana e o receptor de inserção bem sobrenadante. Incubar a placa receptor com inserções durante 20 horas em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora. NOTA: Verifique a parte de baixo da placa de receptor para bolhas entre a membrana de inserção e o receptor bem supernatant. Se as bolhas são visíveis, remova as inserções específicas e colocá-los novamente no receptor bem até que não há bolhas de ar. </li><li> Após 20 forceps uso hr para remover as inserções a partir da placa do receptor. Utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7 executar a imagem BLI as células que migraram para dentro e ligados ao fundo dos poços da placa de receptor. </li></ol></li><li> Migração para fragmentos de tecido ósseo. NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são colocados em três inserções separadas, e 3 esferas de vidro são colocadas em três inserções separadas como controles. <ol><li> Preparar a placa de receptor, pipetando 0,9 mL de DMEM-10% de FBS a cada poço. Coloque-o no tecido cultura incubadora enquanto prepara as inserções. </li><li> Para semear as inserções, inverter-los na superfície de uma caixa de tubo de plástico de microcentrífuga que tem uma tampa. Pipetar 50 ul de uma suspensão de células de gotículas de DMEM-FBS a 10% contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama directly na superfície exterior, no fundo de cada membrana de inserção (que está virada para cima sobre as inserções invertidas). Tampa da caixa de tubo de microcentrífuga com a tampa abriu e transferi-lo para o C incubadora tecido 37 ° por 45 min para promover a fixação das células. </li><li> Transfira a caixa de tubo de microcentrífuga para o capuz de cultura de tecidos, e utilizar uma pinça para ligar as inserções semeados lado direito para cima e transferi-los para os poços da placa de receptor. Pipetar 0,450 ml de DMEM-FBS a 10%, em cada copo de inserção. Utilizando uma pinça, transferir um fragmento de tecido ósseo (~ 3 mm) em cada copo de inserção preparado. Opcionalmente, use pérolas de vidro como controles negativos em poços adicionais. Colocar a placa num incubador de cultura de tecidos durante 20 horas. </li><li> Para medir a migração, preparar uma placa de 24 poços de cultura de tecidos padrão contendo 1 mL de DMEM-10% FBS por poço. Remova a placa do receptor da incubadora e utilizar uma pinça para transferir os fragmentos ósseos e os grânulos de cada inserir em cavidades separadas da placa padrão. Adicionar luciferinasubstrato (para se conseguir uma concentração final de 300 ug / ml) a cada poço e executar BLI utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7. </li></ol></li></ol> 6. As análises adicionais de pré e pós-experimentais <ol><li> Análise de medula corado. <ol><li> Transferir um fragmento de osso em um filtro de células de 70 mm colocada na parte superior de um tubo de 50 ml. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 G para lavar vigorosamente o fragmento com 10 ml de PBS para se obter uma suspensão de células de medula no tubo cónico. Centrifugar a suspensão de células durante 3 min a 300 xg e 21 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em PBS ou outra solução desejada para citometria de fluxo. NOTA: Os volumes ressuspensão irá variar dependendo do tamanho do agregado de células, após a centrifugação, e aplicação. </li><li> Para os ensaios de viabilidade ~ 75-300 volumes de PBS são apropriadas, e estas suspensões podem ser analisados ​​utilizando fluorescenc disponível comercialmentee os ensaios de viabilidade baseados de acordo com as instruções do fabricante, pipetada para um hemocitómetro convencional, e contados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. </li><li> Para a análise de citometria de fluxo ou triagem com base na detecção de células de cancro da mama positivas para GFP, ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS contendo 2% de FBS, 2 mM de EDTA, e 10 mM de HEPES de modo a que a concentração é de 1 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E Coloração e imuno-histoquímica. <ol><li> Para processar os fragmentos de hematoxilina e eosina (H &amp; E) coloração e / ou imuno-histoquímica, colocar os fragmentos em cassetes plásticas marcadas com um lápis número 2, e submergir num recipiente cheio com 10% de formalina tamponada durante 24 horas. </li><li> Tecidos de processo para a inclusão em parafina, com secção e de coloração, usando protocolos de rotina, que incluem um passo descalcificação para dar conta das espículas mineralizadas dentro de cada fragmento. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra et ai. Descreveram anteriormente a recolha post-mortem e análise de amostras de osso de pacientes com cancro da próstata metastático colhidas no momento de autópsia, revelando tecidos de alta qualidade e validação do uso de amostras de ossos humanos para estudar o processo metastático 47. Aqui descrevemos protocolos para a coleta, processamento e utilização de fragmentos de tecidos ósseos humanos obtidos a partir de cabeças femorais descartados após a cirurgia THR em um sistema de c...

O microambiente do tumor é amplamente reconhecido como um fator determinante para o comportamento de células de câncer durante a progressão do câncer de mama metastático e espalhar 1-3. O objetivo do método aqui apresentado é o de facilitar o estudo de células de câncer de mama, no microambiente do tecido ósseo humano, o local mais comum de metástase do câncer de mama 4-6. O osso é composto por mineralizado e medula compartimentos 7-9, tanto de células que abrigam e factores segregados implicados na progressão metastática 10,11. Embora amplamente utilizado em modelos in vivo rato facilitar estudos sistêmicos do processo metastático 12-15, interações celulares dentro do esqueleto não são facilmente acessíveis para observação e perturbação direta. Sistemas modelo para estudar e cultivar tecidos ósseos do mouse e as células da medula do mouse proporcionar um melhor acesso e têm rendido muitos insights em relação crosstalk e mecanismos subjacentes células do cancro da mama metastasis do esqueleto murino 16-22. No entanto, estudos sugerem que pode haver modelos de osteotropism específicas das espécies para o tecido ósseo 23,24. Esses padrões podem reflectir espécie-específicos inerentes diferenças nas propriedades do tecido ósseo, as diferenças resultantes de populações de medula óssea alterados em imuno-deficiente camundongos 11, e / ou a idade relativamente jovem de ratos utilizados em experimentos, os quais são possíveis determinantes do osso microambiente. In vitro abordagens para estudar as células de cancro da mama em co-culturas de ossos humanos têm tipicamente focada em tipos específicos de células de osso tais como os osteoblastos derivados de medula óssea ou de células do estroma cultivadas como monocamadas ou dentro engenharia sistemas modelo 3-dimensional 25-35. Embora os modelos de cultura de células 2-dimensional formaram o esteio da in vitro se aproxima para pesquisa do câncer, tem sido reconhecido que o comportamento da célula é fundamentalmente alterada em monolayer sistemas de cultura 18,36,37. Isto levou ao desenvolvimento de microambientes modificados que imitam a complexidade dos tecidos vivos 3-dimensionais, incluindo matriz- e modelos baseados em compostos de andaime de materiais naturais, tais como colagénio, polímeros sintéticos ou semeadas com tipos específicos de células para criar microambientes tecido semelhante 36-41. Abordagens de engenharia também incluíram a utilização de plataformas de biorreatores para controlar e estudar o ambiente hormonal do microambiente 18,19,41-43. Embora os modelos biomiméticos e biorreatores proporcionar muitos elementos de um microambiente tecido complexo em um ambiente controlado, e têm sido aplicados com sucesso para avançar no estudo da metástase do câncer de mama para os ossos 18,19,35,42,43, sistemas de modelos de engenharia em geral, não incorporam o espectro de tipos de células e componentes da matriz extracelular presentes no ambiente do osso nativo. Até recentemente, o câncer de mamaAs células não foram estudados no microambiente nativa intacta,, 3-dimensional do tecido ósseo humanos. Nós informou recentemente o desenvolvimento de um modelo de co-cultura utilizando fragmentos de tecidos ósseos humanos isolados de substituição total do quadril (THR) cirurgia espécimes 44. Estes espécimes abrigar tanto os compartimentos mineralizados e medula necessárias para estudar os mecanismos subjacentes micro-metástases em cultura de curto prazo. Em trabalho anterior estabelecemos prova de princípio para a utilização de imagem de bioluminescência (BLI) para monitorar a proliferação de células de câncer de mama que expressam luciferase (MDA-MB-231-FLUC) co-cultivadas com fragmentos de ossos 44. Aqui apresentamos detalhado protocolos experimentais para estudar a proliferação das células do cancro da mama, colonização e migração no contexto do microambiente nativa a partir de explantes de tecido ósseo humano. Primeiro apresentamos um protocolo para as células do câncer de mama co-cultura adjacentes a fragmentos de ossos para medir mamaproliferação celular utilizando BLI. Neste ponto, as suspensões de células da mama são semeadas como manchas de células em placas de 6 poços adjacentes aos fragmentos de osso, que são imobilizadas por pedaços de cera de osso. Os poços de controlo contêm cera de osso, mas nenhum fragmento ósseo. Uma vez que os pontos de células de anexar, o meio é adicionado e a placa é cultivada durante 24 h, após as quais a intensidade do sinal bioluminescente (associada com o número de células) é medida com BLI. No passo seguinte, apresenta-se métodos para células de cancro da mama co-cultura semeadas directamente sobre os fragmentos ósseos para estudar a colonização e proliferação. Aqui, as suspensões de células da mama são pipetados diretamente sobre os fragmentos de tecidos ósseos, que são monitoradas em cultura por BLI e microscopia de fluorescência ao longo do tempo para acompanhar a colonização e número de células. Neste método, a medula do compartimento podem ser retirados a partir dos fragmentos ósseos, em qualquer ponto de tempo para análise de células de cancro da mama colonizados por citometria de fluxo, ensaios de viabilidade ou medula. Além disso, desescriba duas abordagens diferentes para medir a migração de células de câncer de mama. No primeiro método passos são descritos para medir a migração para os sobrenadantes de cultura de tecido ósseo. Neste protocolo as células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies superiores dos interiores, Transwell inserir membranas com um tamanho de poro de 8 um (como mostrado na Figura 1A). As pastilhas são depois colocadas numa placa de receptor com poços contendo o sobrenadante de tecido ósseo ou meio de controlo. Ao longo de um período de incubação de 20 h, um pequeno número de células de cancro da mama migram através das membranas de inserção para dentro dos poços de cultura de tecidos mais baixos, onde eles se ligam para detecção pela BLI. No segundo método de migração de células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies inferiores exteriores, de membranas Transwell de inserção. Fragmentos de tecido ósseo são colocados em copos de inserção e as células de cancro da mama migrar para cima através das membranas para colonizar os fragmentos de osso (como mostrado na Figura 1B), o quesão então fotografada usando BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Óssea é o local mais comum de metástase do câncer de mama. Embora seja amplamente aceito que o comportamento de células de câncer influências microambiente, pouco se sabe sobre as propriedades das células de câncer de mama e comportamentos dentro do microambiente nativa do tecido ósseo humano. Nós desenvolvemos abordagens para acompanhar, quantificar e modulam as células de câncer de mama humanos dentro do microambiente de fragmentos humanos cultivados tecido ósseo isoladas de cabeças femorais descartados seguintes artroplastias totais de quadril. Usando células de câncer de mama projetados para luciferase e aprimorados proteína fluorescente (EGFP) expressão verde, somos capazes de quantificar reproducibly migração e proliferação padrões usando imagem de bioluminescência (BLI), as interações celulares pista dentro dos fragmentos ósseos através de microscopia de fluorescência, e avaliar as células da mama após colonização por citometria de fluxo. As principais vantagens deste modelo incluem: 1) a, microe nativa tecido arquitetura intactanvironment que inclui tipos de células humanas relevantes, e 2) o acesso directo ao microambiente, o que facilita quantitativa rápida e monitoramento qualitativo e perturbação de propriedades, comportamentos e interações de mama e de células ósseas. Uma limitação primária, na presente, é a viabilidade finita dos fragmentos de tecido, que confinam a janela de estudo à cultura de curto prazo. Aplicações do sistema de modelo incluem o estudo da biologia básica do câncer de mama e outros tumores malignos de osso buscando dentro do nicho metastático, e desenvolver estratégias terapêuticas para efetivamente como alvo as células de câncer de mama em tecidos ósseos.

Isolamento de fragmentos de tecido de cabeças femorais Cabeças femorais foram coletados a partir de um número igual de pacientes do sexo feminino (44-90 anos) submetidos a artroplastia electiva total da anca no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e masculinos. Cada cabeça femoral descartada contém uma pequena porção do fêmur superior, que abriga tecido ósseo trabecular composto por espículas mineralizados e medula. Este tecido é a...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K visualizações.  Stanford University School of Medicine.  Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante. 

Vídeo: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Medicina

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Um In Vitro Sistema para Estudo de dormência Tumor ea Mude para o crescimento metastático

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudar a ação do hormônio no peito humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...