Uma vez que o fluxo microvascular varia entre capilares e alterações ao longo de um curso de tempo de segundos, um método para a quantificação contínua do fluxo através de campos inteiros é necessário. A equipe permite uma medição quase contínua das velocidades de fluxo em campos inteiros de microscópio, em poucas horas, que levaria meses para obter manualmente. Embora esses procedimentos sejam simples, a demonstração visual ajudará significativamente novos usuários a navegar na equipe pela primeira vez.
Para usar o TrakEM2 para definir a rede vascular, selecione primeiro File, New e TrakEM2 Blank para configurar um novo projeto TrakEM2 em branco e selecione a nova pasta que contém a imagem única do filme como a pasta do projeto. As janelas TrakEM2 serão abertas. Clique com o botão direito do mouse na área de trabalho principal e selecione Imagem de Importação e Importação.
Navegue até a imagem única e selecione a imagem. Clique com o botão direito do mouse na área de trabalho principal novamente e selecione Exibir e Redimensionar automaticamente Canvas/LayerSet. Em seguida, clique à esquerda na janela de trabalho principal.
A imagem vai encher a área de trabalho. Para selecionar as áreas da imagem que contêm a rede vascular, na janela menor TrakEM2, clique com o botão direito do mouse no modelo Qualquer coisa e selecione Adicionar nova criança e lista de área. Na janela TrakEM2 menor, arraste o modelo Qualquer coisa para o Projeto Objetos, projeto sem título.
Em seguida, arraste o modelo Qualquer coisa, lista de área, para Objetos de Projeto, projetos sem título, Qualquer coisa. Em Objetos de Projeto, projeto sem título, a lista de áreas de Anything estará presente agora. Na janela principal do TrakEM2 sob a guia Z Space, uma lista de áreas rotulada por barras será criada.
Clique para selecionar a lista. Na janela principal do TrakEM2, selecione a ferramenta pincel e clique em Shift enquanto rola a roda do mouse para selecionar um tamanho de pincel menor que o diâmetro da vasculatura de interesse. Pressione o Controle S para salvar o projeto.
Utilizando a ferramenta paintbrush, pinte a rede vascular, excluindo qualquer região fora de foco. Quando a rotulagem estiver completa, clique com o botão direito do mouse na janela TrakEM2 principal e selecione Listas de Exportação e Área como Rótulos. Na janela pop-up, selecione Escala, 100% e exporte toda a Lista de Áreas.
Feche as janelas TrakEM2 e selecione Sim para salvar o projeto. A imagem da Lista de Áreas será aberta e poderá aparecer como uma imagem em branco e preta. No menu principal de Fiji, selecione Imagem, Ajuste e Brilho/Contraste.
Na janela Brilho e Contraste, clique em Auto e na Lista de áreas ficará visível. No menu principal de Fiji, selecione Imagem, Tabelas de Procurar e Tabela de Procuração Invertida. Salve esta imagem de etiquetas pretas no fundo branco como um arquivo t-i-f e feche a imagem.
Abra o arquivo Rótulos em Fiji e selecione Plugins, Skeleton e Skeleton Eyes. Então, salve a imagem dos Olhos Esqueletos como um arquivo t-i-f. Para criar um novo projeto de equipe, selecione Plugins, Macros e Open/Create Project e siga as instruções para criar ou atualizar um arquivo de configuração.
No menu de projeto Abrir/Criar, navegue e selecione a pasta Arquivo de Entrada do diretório do projeto e os arquivos Input Movie e Skeleton. Insira os valores para a velocidade máxima medida, a velocidade máxima mapeada, o comprimento mínimo do segmento, o tamanho do pixel e a taxa de quadro. Verifique a caixa de correção flicker se as imagens tiverem intensidade de fundo periódica piscando e clique em OK. Ajuste os parâmetros para a melhor visualização dos dados.
Defina a velocidade máxima mapeada para incluir cerca de 95% dos dados, de modo que os dados são mapeados em toda a gama da escala de cores. Para analisar o esqueleto, selecione Plugins, Macros e Analyze Skeleton. O arquivo esqueleto será aberto e o gerente da Região de Interesse abrirá e executará.
No gerente da Região de Interesse, clique em Mostrar Tudo e Rotular e clique em OK. Para selecionar os intervalos de tempo, selecione Plugins, Macros e Editar intervalos de tempo e aguarde que a macro gere um kymograph de um único segmento durante o tempo total do filme. Use as teclas Control plus e minus para aumentar o tamanho do kymógrafo conforme necessário e use a ferramenta de seleção retângulo para desenhar um retângulo em cada intervalo de tempo. Pressione a tecla T ou clique no botão Adicionar para gravar uma seleção intervalo de tempo e repita a seleção para quantos intervalos de tempo desejarem.
Para avaliar as opções de parâmetros, selecione três a quatro intervalos de tempo e complete a análise apenas para esses intervalos. Clique em OK quando a seleção do intervalo de tempo tiver sido concluída. Uma janela pop-up aparecerá quando os intervalos selecionados tiverem sido salvos na pasta do projeto.
Clique em OK. Para analisar o fluxo, selecione Plugins, Macros e Analyze Flow. A caixa de diálogo Analisar parâmetros de fluxo será aberta e exibirá os valores inseridos na etapa do Projeto Abrir/Criar. Edite esses valores se necessário e clique em OK. A caixa de diálogo Nomes de Arquivos de Saída será aberta e exibirá os nomes inseridos na etapa De Projeto Abrir/Criar.
Edite esses nomes conforme necessário e clique em OK para iniciar a Análise de Fluxo. Quando uma caixa de diálogo aparecer indicando que o fluxo foi analisado, clique em OK para armazenar os resultados da análise em arquivos CSV Planilha. Para produzir mapas espaciais, selecione Plugins, Macros e Produce Spatial Map.
A janela Parâmetros do Mapa Espacial será aberta exibindo os valores inseridos na etapa do Projeto Abrir/Criar. Edite esses valores conforme necessário e clique em OK. Uma sequência temporal de Mapas Espaciais de Velocidades de Fluxo será gerada com cada cor indicando uma velocidade de fluxo. Role a pilha gerada de uma imagem por intervalo para visualizar as variações espaciais e temporais no fluxo e salvar a pilha como um arquivo a-v-i para compartilhar o arquivo como um filme.
A Análise de Pessoal gera o censo completo das velocidades microvasculares em campos inteiros de microscópio, durante períodos de tempo que se estendem de segundos a minutos. Por exemplo, usando uma única imagem nesta série temporal da rede microvascular no fígado de um camundongo, a imagem esqueleto gerada foi usada para definir o eixo do fluxo microvascular, permitindo que o mapa gerado por pessoal de segmentos vasculares individuais fosse identificado para quantificação subsequente do fluxo. A partir dos segmentos vasculares individuais gerados a partir da imagem esqueletizada, os címógrafos podem ser gerados representando a intensidade ao longo de cada segmento de linha ao longo do tempo.
Os intervalos de tempo de fornecimento de esqueleto e usuário podem ser usados para quebrar o kymógrafo de cada segmento em intervalos de tempo individuais do segmento. A equipe então identifica o ângulo predominante no kymógrafo de cada intervalo de tempo do segmento e fornece as medições de velocidade calculadas como arquivos de dados CSV. A saída de CSV da equipe pode ser usada para analisar a distribuição geral de velocidade para permitir a plotagem da velocidade nos segmentos vasculares individuais ao longo do tempo.
E pode ser visualizado como pilhas de imagens de mapa de velocidade codificadas por cores. Observe que os resultados provenientes da Equipe dependem da qualidade da série de imagens, no que diz respeito à estabilidade da amostra, taxa de quadros, resolução e relação sinal-ruído. As saídas de mapa de velocidade da equipe permitem uma exploração intuitiva da padronização do fluxo espacial, enquanto as saídas de CSV da equipe permitem a análise estatística das velocidades de fluxo, dentro e entre grupos de tratamento.
