Agradecemos ao Dr. Jennifer Emtage para a leitura crítica do manuscrito, Ryan Gill para assistência técnica e ajuda com o cuidado de peixe-zebra e Dr. Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) para reagentes. Nosso trabalho tem sido apoiado pela Temple University College de Ciência e Tecnologia e os Institutos Nacionais de Saúde (R01-HD061749).

1. Produção da geração F0 por microinjeção da armadilha Gene. Nós descobrimos que os embriões de diferentes origens genéticas exibir diferentes tolerâncias a este procedimento, com o tipo selvagem baseada em pet-store e Tuebingen - Long Fin (TLF), sendo o mais tolerante, enquanto cepas AB e Tuebingen têm pior sobrevida. <ol><li> Preparação de DNA transposon. Prepare GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. Em preparação) do DNA de plasmídeo utilizando o kit QIAprep miniprep padrão (Qiagen 27106). É indispensável incluir a etapa de lavagem PB (que é opcional no processo QIAprep), caso contrário, o ADN miniprep vai ser contaminado por ARNase A, o que leva à degradação do mRNA da transposase. Antes da injecção, dilui-se o ADN em água isenta de RNase (Ambion AM9937) a 10 ng / mL. </li><li> Preparação de mRNA de transposase. Linearizar pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 usando XbaI e transcrever o ADN linearizado usando uma máquina T3 mMessage(Ambion AM1348) no kit de transcrição in vitro. Nós modificamos a reação de transcrição in vitro pela adição de 0,5 mL de inibidor RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). Após o passo de tratamento de DNase, purificar o ARNm utilizando um kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Avaliar a qualidade de o ARNm transcrito in vitro, em por electroforese em gel de agarose. Diluir o mRNA em água RNase a 40 ng / mL, e armazenar como 2 mL alíquotas a -80 ° C. </li><li> Preparação da mistura de microinjeção. Antes da injecção, adicionar 8 ul de DNA transposon diluída a uma alíquota de 2 ul de ARNm da transposase. </li><li> Microinjeção. Injectar 3 nl de mistura de ADN / ARN na gema de 1 embriões de peixe-zebra celular usando técnicas de microinjeção padrão, apontando para a interface / gema de blastômeros. Coletar embriões a cada 20 minutos para garantir a injeção em um estágio de célula. Em nossa experiência, uma pessoa hábil pode facilmente injetar 1.000 embriões em 1-1,5 horas. </li><li> Após a injeção, executar 5 mL de esquerdamais de solução de injecção de um gel de agarose a 1% para o controlo de qualidade, para assegurar que o ARNm da transposase não tenha sido degradada. </li><li> Cuidado embrião injetado. No final da tarde, retire embriões não fertilizados e anormais e distribuir embriões para 60-80 por 100 milímetros placa de Petri. Embriões anormais e mortas são removidas no pós fecundação um dia (DPF), 2 dpf e 3 dpf. </li><li> Triagem para a expressão GFP. Embriões tela sem defeitos evidentes de fluorescência da GFP em 3 dpf (Figura 3). O rastreio pode ser feito tanto em um estereomicroscópio equipado com fluorescência (nós usamos uma Nikon SMZ1500) ou em um microscópio vertical (nós usamos uma Zeiss AxioImager com um objetivo 5X Fluar). Baixa expressão da GFP indica um insucesso de injecção ou a degradação de RNA de transposase, devido à contaminação com RNase (Figura 3A). Selecione cerca de 30% dos embriões mais brilhantes que ou tenham expressão GFP em vários tecidos ou em uma alta porcentagem de células de um tecido específico (compare Figures 3B e 3C). A partir de uma injeção de 1.000 embriões, que geralmente têm até 100, de alta GFP-expressando embriões developmentally-normais. </li><li> Levante embriões F0 selecionados usando os procedimentos de criação de peixe-zebra normais. É razoável esperar que 20-30% dos embriões injetados selecionados para criação vão sobreviver até a idade adulta. </li></ol> 2. Manutenção dos UAS: MRFP Tester Line. Geramos um 14xUAS: Linha MRFP marcado por γCry específicas de lente: GFP. Desde UAS está sujeita a silenciar por metilação do DNA, é importante para selecionar os peixes com baixos níveis de silenciar para propagar o estoque. <ol><li> Configure UAS individual: homozigotos MRFP para acasalar com um de nossos Gal4 linhas armadilha gene mais confiáveis, tpl6 NSF (Balciuniene et al, em preparação.). </li><li> No dia seguinte, transferir os UAS: MRFP peixe que deram embriões para os tanques estáticos individuais, ao passo que os embriões são recolhidose limpos. </li><li> Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf e 3 dpf. </li><li> Peixe intercross que deu embriões com alta expressão MRFP para estabelecer a próxima geração de UAS: Linha MRFP. </li></ol> 3. Triagem da F0 peixe. <ol><li> Atravessar F0 indivíduo com o UAS homozigoto: MRFP peixe (Figura 4). Costumamos injetar nossos GBTS em linhas com padrões do tipo selvagem ou leopardo de pigmentação, e os nossos UAS homozigotos: Linha MRFP está na base bronze. Portanto peixe F0 GBT-injetado pode ser facilmente distinguidas das UAS: MRFP peixe, eliminando a necessidade de registrar se o F0 sendo exibido era um homem ou uma mulher, bem como os erros potenciais resultantes de erros de gravação e / ou que determinam o sexo do cada peixe. Pessoal com experiência muito limitada, tais nós, estudantes de graduação, são, portanto, capaz de criar e quebrar acasalamentos de peixe. Esta abordagem tem a desvantagem de que duas origens genéticas diferentes sãosendo utilizado, potencialmente complicando a interpretação de perda de fenótipos funcionais. </li><li> No dia seguinte, retornam os UAS bronze: MRFP peixe para seu tanque. Coloque o peixe, o que deu F0 embriões em tanques estáticos individuais (usamos Hagen Exo Terra Faunarium pequeno, mas qualquer pequeno tanque pode ser utilizado para este fim), enquanto que os embriões são colhidos e rastreados. </li><li> Embriões coletados limpas e transferência para novas placas de Petri (&lt;100 por prato) na tarde do dia 0. </li><li> Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf, 2 e 3 dpf dpf. Puxe embriões positivos tanto para GFP e RFP para fora, ordená-los por GFP / RFP padrão de expressão (se mais de um padrão é observado em uma embreagem) e criá-los para estabelecer a geração F1. </li><li> Eutanásia o peixe F0 que produziu apenas os embriões negativos (de um total de 50-100 embriões). </li><li> Cruze os peixes F0 que produziu GFP / RFP progênie positivo novamente para obter um segundo lote de positivos. </li></ol> 4.Triagem da F1 peixe. O peixe F1 são selecionados para estabelecer famílias F2, para documentar armadilha gene padrão de expressão e de congelar lotes de embriões para a identificação molecular de armadilha gene loci por 5 &#39;RACE e PCR inversa. <ol><li> Atravesse peixe F1 indivíduo com a UEA homozigoto: MRFP peixe (Figura 4). </li><li> No dia seguinte, coloque o peixe F1 que deu embriões em tanques estáticos individuais enquanto os embriões são coletados e selecionados. </li><li> Embriões de tela para GFP e RFP fluorescência em 1 dpf, 2 e 3 dpf dpf. Embriões separados e fotografar positivos tanto para GFP e RFP 24. </li><li> Às 5 dpf, congelar lotes de 20 GFP / RFP-positivo e 20 GFP / RFP embriões-negativo para a identificação de genes que sofreram mutação por inserção por PCR inverso e 5 &#39;RACE 9,10. Levante restantes GFP / RFP embriões positivos para estabelecer a geração F2. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Os vetores armadilha gene ea metodologia aqui descritas já estão sendo utilizados em vários laboratórios independentes. Em nossa experiência, há duas etapas críticas do processo. O primeiro passo crítico é atingir altos índices de integração armadilha gene em embriões de F0 injetadas. Falha neste passo pode muitas vezes ser atribuída à contaminação com RNase dos reagentes de injecção, especialmente o ADN miniprep. É também muito importante para injectar embriões na fase 1 de células para as experiências de armadilha de genes. Na nossa experiência, transgénese mediada Tol2 é muito eficiente, tornando-se possível obter linhas transgénicas mesmo quando se injecta mais tarde do que a fase 1 da célula ou com o ADN de menor qualidade. Injeções de qualidade inferior são muito mais problemáticas na realização de mutagênese armadilha gene, uma vez que apenas uma pequena fração das integrações vetor resultar em eventos armadilha gene eficazes. O segundo passo fundamental é verificar interceptar eventos de genes através do cruzamento para o nosso UAS: Linha MRFP. Ausência de expressão é MRFPquase sempre indicativo de um evento potenciador armadilha. No entanto, por vezes, a falta de expressão MRFP pode indicar silenciamento dos 14x UAS. Por isso, é importante manter as UAS: Linha MRFP em um estado não-silenciadas pela propagação da próxima geração usando indivíduos com alta expressão de RFP, quando cruzou para tpl6 NSF. Podemos prever fazendo várias melhorias para nossos vetores armadilha gene e protocolo. A primeira é a utilização de uma UAS menos repetitivo na construção armadilha de genes. Tem sido demonstrado que uma 5x UAS é suficiente para alcançar a activação completa em experiências de cultura de células, e que as sequências UAS menos repetitivas são menos sensíveis à metilação e silenciamento 6,25. Também pode ser possível conceber vectores armadilha de genes para a mutagénese totalmente condicional, em analogia com os vectores usados ​​pelo ratoeira gene consórcio internacional e recentemente adaptados para peixe-zebra 2,26,27. Outra melhoria seria a utilização de um diferente tsistema ransposon, por exemplo A Bela Adormecida 28, para gerar um UAS: linha repórter MRFP. Isso permitiria a injeção de armadilhas de genes baseados em Tol2 diretamente na linha de repórter e triagem de F0s por incrossing. Além disso, isto elimina a utilização de dois fundos genéticos diferentes, fazendo a interpretação de perda de fenótipos funcionais mais simples. Mesmo com estas melhorias, o Gal4 protocolo geral armadilha gene apresentado aqui ainda seria plenamente aplicável.

Mutagénese insercional provou ser uma abordagem poderosa para dissecar a função de genes em vários sistemas de modelo a partir de organismos unicelulares, como bactérias e leveduras para os organismos multicelulares, tais como ratos e plantas. Qualquer DNA exógeno (vírus, transposão ou plasmídeo) pode servir como um agente mutagénico, ao interromper elementos essenciais de genes, tais como os exões ou promotores. O alvo eficaz de tais abordagens simples é extremamente pequeno em grandes genomas complexos, uma vez que compreendem exões apenas 1-3% de um genoma animal vertebrado normal. O tamanho pequeno alvo eficaz pode ser superada pelas taxas de integração muito alto vetoriais, como exemplificado pelo tremendo sucesso de mutagénese insercional retroviral em zebrafish 11,12. Em contraste, os intrões compreendem cerca de 20-30% dos genomas de vertebrados. No peixe-zebra, vetores mutagénese de inserção à base transposon que efetivamente introduzir mutações hypomorphic graves na integração nulo ou em íntrons foram nomeados &quot;transposo gene quebrarns &quot;(GBTS) 8-10. Para a integração armadilha gene eficiente, eles usam uma Tol2 transposon mínimo 13,14. Mutagenicidade de GBTS depende de emenda aceitante derivados de peixe e as sequências de terminação / poliadenilação transcrição. Os elementos responsáveis ​​pela GBT mutagenicidade são acompanhadas por sítios loxP directos para a excisão de recombinase Cre. Assim, a injecção de Cre ARNm conduz à reversão eficaz de mutações induzidas por GBT, embora algumas sequências de transposões permanecer no locus integração 9,10. Os vetores GBT recentemente publicados usar MRFP como o repórter 9,10 armadilha gene, levando a duas possíveis deficiências. Em primeiro lugar, não se sabe qual a fracção de genes de peixe-zebra são expressas a um nível suficientemente elevado para ser detectado por proteínas de fusão repórter fluorescentes directos. Em segundo lugar, apenas um pequeno subconjunto de genes que se espera que tenham funções essenciais. Estima-se que existem apenas 1,400-2,400 genes necessários para developme zebrafishnt 15,16. A maioria dos mutantes de armadilha de genes não são esperados exibir os fenótipos evidentes e, por conseguinte, têm utilidade limitada. Para superar estas duas limitações, modificamos GBT-R15 9,10 para usar com Gal4-VP16, como o gene repórter armadilha primária (Balciuniene et al. Em preparação). Tal como acontece com AGO-menos MRFP em GBT-R15, o local de início da tradução foi removida da Gal4-VP16. Para a detecção directa de eventos de armadilha de genes, os vectores contêm um repórter eGFP sob controlo de 14x Gal4 UAS 17,18. Vários recursos adicionais são projetados em nossa bipartido vetor armadilha gene. Os UAS: gaveta eGFP é ladeada por locais DRF diretos (chevrons cinza na Figura 1). A injeção de Flp recombinase mRNA leva a excisão das UAS: gaveta eGFP, deixando a mutação armadilha gene não marcado por eGFP fluorescência. Ele pode então ser utilizado em linhas transgénicas que marcam tecidos específicos ou eventos de desenvolvimento de fluorescência da GFP. Como em outrosGBTS, toda a cassete de armadilha gene é flanqueado por sítios loxP directos (pentágonos abertas na Figura 1). Isso faz com que os eventos de armadilha de genes reversível por expressão de Cre recombinase, prontamente, que estabelece a prova de relação de causalidade entre a integração específica armadilha de genes e observado o fenótipo (Figura 2). Finalmente, a cassete de armadilha de genes é flanqueado por sítios invertidas meganuclease I-Scel (triângulos pretos na Figura 1). Em Drosophila, integrações de transposons são muitas vezes convertidos em deleções (deficiências) por excisão imprecisa do elemento P. Não há evidências de que a excisão de Tol2 transposon (ou qualquer outro transposon ativo em vertebrados, como A Bela Adormecida, PiggyBac ou Ac / Ds) pode levar a exclusões. Por isso, incluímos sites de I-SCEI como um método substituto potencial para indução de deleções, mesmo que não haja nenhuma evidência de que I-SCEI pode induzir eliminações no peixe-zebra. Deve notar-se que, enquanto que Mega-Scelnuclease pode ser utilizado para facilitar a transgénese em peixes-zebra, a clivagem de ADN de I-Scel meganuclease é utilizada para estudar os mecanismos de reparação de ADN, incluindo a extremidade não homóloga juntando propensa a erros, de levedura e células de mamíferos 19-22. Integração do nosso vector armadilha de genes pode levar à expressão eGFP por dois mecanismos diferentes. O primeiro é um verdadeiro evento armadilha de genes (Figura 1C): o vector se integra num gene (IMG para Mutante por inserção do gene), um transcrito de fusão entre a 5 &#39;do transcrito IMG endógeno e o Gal4-VP16 é feita e traduzida numa proteína de fusão contendo a extremidade N-terminal da proteína codificada pelo IMG e Gal4-VP16. Esta proteína de fusão se liga ao UAS 14x e activa a transcrição de eGFP. O segundo caso, menos desejável, é uma armadilha de intensificador (Figura 1D): o promotor mínimo na frente de eGFP cai sob o controlo de um intensificador de perto do local de integração, o que leva à produção de eGFP na abNesse aspecto de produção Gal4-VP16. Em nossa estimativa, 30-50% dos eventos de expressão eGFP são devido a uma armadilha enhancer e 50-70% são devido a uma armadilha gene 23 (Balciuniene et al., Em preparação). Para distinguir entre essas duas classes de eventos, fizemos uma 14xUAS: linhagem transgênica MRFP (Figura 1B), por conveniência marcada pela específico lente γCry: (. Balciuniene et al, em preparação) GFP. Eventos gene trap são verificados por co-expressão da GFP e RFP (comparação C e D na Figura 2). Em nossa tela piloto, recuperamos mais de 40 eventos de trap gene após triagem 270 F0 peixes injetados com uma mistura de DNA transposon e mRNA transposase. Duas de nossas integrações armadilha gene ter ocorrido em genes com previamente publicados mutantes induzidas quimicamente: NSF e flr. Os fenótipos de nossa Mutantes insercionais tpl6 nsf e flr tpl24 são superficialmente indistinguível do fenótipos dos correspondentes mutantes induzidas quimicamente. Observamos também que os eventos de armadilha de genes apareça inclinado para os intrões perto da extremidade 5 &#39;de genes, aumentando assim a probabilidade de alelos nulos. Fazemos observar algum grau de silenciamento UAS (variegation), em todas as nossas linhas de armadilha gene, e alguns loci são claramente mais suscetíveis a variegation do que outros. Nós não acreditamos que UAS silenciamento é um problema significativo para a propagação de linhas armadilha gene, como temos sido capazes de se propagar facilmente todas as nossas linhas de armadilha gene através de pelo menos cinco gerações, selecionando para a expressão GFP sozinho.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Tamanho da ninhada grande e desenvolvimento externo de embriões opticamente transparentes fazer zebrafish um sistema modelo de vertebrados excepcional para in vivo mutagênese insercional usando repórteres fluorescentes para marcar expressão de genes mutantes. Vários laboratórios construídos e testados vectores estimuladoras e gene-armadilha no peixe-zebra, utilizando proteínas fluorescentes, activadores da transcrição à base de lexA-Gal4 e como repórteres 1-7. Estes vetores tinha duas desvantagens potenciais: rigor de qualidade inferior (por exemplo, a falta de capacidade de diferenciar entre os eventos realçador e gene-armadilha) e baixa mutagenicidade (por exemplo, integrações em genes raramente produzidos alelos nulos). Gene Quebrando Transposon (GBTS) foram desenvolvidos para enfrentar essas dificuldades 8-10. Nós modificamos um dos primeiros vetores GBT, GBT-R15, para uso com Gal4-VP16 como o repórter principal armadilha gene e UAS adicionados: eGFP como o repórter secundário para detecção direta de eventos armadilha gene. APLICAÇÃO de Gal4-VP16 como o principal repórter armadilha gene oferece duas vantagens principais. Primeiro, aumenta a sensibilidade para os genes expressos em baixos níveis de expressão. Em segundo lugar, permite aos pesquisadores usar linhas armadilha de genes como motoristas Gal4 a expressão direta de outros transgenes em tecidos muito específicas. Isto é especialmente pertinente para genes com funções não essenciais ou redundantes, onde a integração armadilha gene pode não resultar em fenótipos evidentes. A desvantagem do uso de Gal4-VP16, como o principal gene repórter armadilha é que os genes que codificam para proteínas com sequências de sinal N-terminais, não são passíveis de aprisionamento, como as proteínas de fusão Gal4-VP16 resultantes são susceptíveis de ser capaz de entrar no núcleo e activar transcrição. Mais importante, o uso de Gal4-VP16 não pré-seleccionar as proteínas nucleares: recuperamos mutações armadilha de genes nos genes que codificam para proteínas que funcionam no núcleo, citoplasma e na membrana plasmática.

Em uma injecção com sucesso, pelo menos 80% dos embriões injectados com a armadilha de genes de DNA / Tol2 mistura ARNm da transposase exibir algum grau de fluorescência de GFP (Figura 3). Quando os embriões mais brilhantes GFP positivas (Figura 3C) são seleccionados para estabelecer a piscina F0, cerca de uma em 10 rastreados peixe F0 produzirá gene armadilha descendência. Entre os peixes F0 a partir do qual os eventos armadilha gene são recuperados, a maioria transmitir um único evento armadilha gene além de várias integrações transposon não expressando. No entanto, nós estabelecemos até quatro linhas armadilha gene de um único indivíduo F0. Padrões de expressão GFP / RFP em linhas de armadilha de genes variam de extremamente específica do tecido (por exemplo, em bulbos olfatórios) para bastante onipresente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figura 1. Tele gal4 contendo armadilha gene bipartido vetor GBT-B1 e suas aplicações. A. Componentes da Gal4 contendo vetor armadilha gene: Tol2 5 &#39;e Tol2 3&#39;, minimal transposon Tol2 termina 13; CSA, Carp β-actina emenda aceitante 8; ^ Gal4-VP16, AUG-menos Gal4-VP16; zp ( A), peixe-zebra β-Actina UTR e poli 3 &#39;(A) elementos do GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP e SV40 p (A) são componentes da UAS: eGFP cassete de expressão 17,18. A seta indica a ativação do UAS: eGFP por Gal4-VP16 produzido pela armadilha gene B. A 14XUAS:. MRFP transgene marcado por uma lente específica γCry: cassete GFP. A seta indica a ativação do UAS: MRFP por Gal4-VP16 em C. Gene evento trans armadilha.. As caixas azuis são exons. Emenda é indicado pela linha pontilhada D. Enhancer evento armadilha.. A integração do vector de perto de um potenciador (caixa castanho) pode colocar o promotor eGFP mínima sob o controle deste potenciador (seta castanho). Isto resultaria em uma expressão específica de tecido de eGFP, mas uma vez que Gal4-VP16 não é feito, a expressão MRFP não seria activado. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figura 2. Reversão de eventos armadilha gene utilizando Cre recombinase. A, B. Esquema de uma mutação armadilha de genes (A) e reverteu Cre-armadilha alelo do gene (B). C, D. A co-expressão de GFP (C) e RFP (D) no sistema nervoso do gene tpl6 nsf linha de armadilha. E, F. A injeção de Cre RNA em embriões tpl6 NSF leva à perda de GFP (E) e RFP (F) expressão. Note-se que não existe uma redução da expressão da GFP na lente, conforme o esperado. Figura 3. Os embriões injectados com a armadilha de genes GBT-B1 (pDB783). . A. Os embriões injectados com pGBT-B1 (pDB783) sozinho exibição pouco fluorescência da GFP no corpo B, C. Os embriões injectados com pGBT-B1 e Tol2 ARNm da transposase: um grupo aleatório de embriões (B) e alto-expressores seleccionados para a criação (C). <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figura 4. Delineamento experimental para o estabelecimento de linhas Gal4 armadilha gene. Estruturas vermelho / verde parcialmente coincidentes indicam co-expressão de GFP e RFP, enquanto verde por si só indica mosaicismo para interceptar eventos gene ou potenciador armadilha.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Este protocolo descreve o método de armadilha de genes de mutagénese insercional utilizando Gal4-VP16, como o repórter primário e GFP / RFP como repórteres secundárias em peixes-zebra. Cerca de um em cada dez alta expressar F0 gene rendimento peixe armadilha descendência co-expressando GFP e RFP. O processo de rastreio pode ser facilmente dimensionado para se adaptar ao tamanho do laboratório que realiza o ecrã mutagénese insercional.

Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K visualizações.  Temple University.  Este protocolo descreve o método de armadilha de genes de mutagénese insercional utilizando Gal4-VP16, como o repórter primário e GFP / RFP como repórteres secundárias em peixes-zebra. Cerca de um em cada dez alta expressar F0 gene rendimento peixe armadilha descendência co-expressando GFP e RFP. O processo de rastreio pode ser facilmente dimensionado para se adaptar ao tamanho do laboratório que realiza o ecrã mutagénese insercional. 

Vídeo: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biologia

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...