Agradecemos Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) para o conselho em experimentos de comportamento e de laser DPSS estabelecidos; Heesoo Kim e Chiara Cerri do Curso de Neurobiologia MBL para auxiliar na Chef-tdTomato experimentos; PetronellaKettunen (Universidade de Gotemburgo ) para colaboração inicial em experimentos optogenética; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) para assessoria técnica, e Roger Tsien (UCSD) para o chef-tdTomato construir. Este trabalho foi financiado por uma concessão NRSA (5F31NS064817) para AMSP e uma bolsa da NSF (RIG: 0819010) para AS.

Preparar o seguinte antes do tempo. 1. Prepare cabo ótico <ol><li> Criar uma unidade de armazenamento para o cabo de fibra óptica por fusão do gargalo cónica de uma pipeta de Pasteur de vidro ao longo de um bico de Bunsen para criar um ângulo de ~ 150 °. </li><li> Utilizando um cortador de fio ou uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente o cabo de fibra óptica em duas partes. Cada peça deve ter uma extremidade com um FC / PC adaptador e uma extremidade exposta. Armazenar uma peça como um cabo de reserva. </li><li> Descascar o cabo de fibra óptica para baixo para o revestimento através da remoção do revestimento de fibras e as fibras de reforço (Figura 1A), de 5,0 cm de corte de extremidade do cabo. </li><li> Insira o cabo óptico no preparado Pasteur pipeta. Certifique-se de cabo pode facilmente entrar e sair da ponta da pipeta. </li><li> Com cabo óptico saindo da ponta da pipeta Pasteur, corte cuidadosamente e retire revestimento de fibra de cerca de fibra de vidro, ~ 2 mm de corte final. </li><li> Usando um cortador de diamante caneta / vidro, entalhe a fibra de vidro e quebrar off a fim de criar um corte limpo / superfície na extremidade da fibra (Figura 1B). </li><li> Retrair cabo ótico em pipeta Pasteur para armazenamento. Repita o passo (1,6) se a ponta de fibra óptica fica lascado ou quebra de forma desigual. </li><li> Cabo óptico de posição usando uma pipeta de Pasteur micromanipulador (Figura 1C). </li></ol> Procedimentos 2-8 descrevem um método para a injecção em embriões de transgenes geralmente aplicáveis ​​a muitos experimentos zebrafish. Variações sobre este método, como as descritas em outros vídeos Jove 6, 7, 8, 9, 22 são igualmente eficazes. 2. Puxe agulhas de injeção <ol><li> Usando um extrator de agulha, puxar um tubo de vidro de borosilicato em duas agulhas de injeção com uma ponta gradualmente reduzida. Puller configurações irão variar. (Em um extrator agulha Sutter Instruments usamos configurações: P = 500 Calor, = 720, Pull = 50 Velocity, = 70 e Tempo = 150). Cada extrator agulha é diferente, assim otimizar as configurações do extrator lospirically. Para mais agulhas cónicas, aumentar o calor e / ou recepção. Para agulhas menos cônico, aumentar o tempo e / ou Pull diminuição. </li><li> Agulhas guarde em um recipiente seguro (ou seja, uma placa de Petri com fita enrolada, para fora do lado adesivo). </li></ol> 3. Despeje moldes de injeção <ol><li> Derreta 0,5 g de agarose em 30 embrião ml / água azul, até agarose se dissolva completamente. </li><li> Despeje a metade inferior de uma placa de Petri. </li><li> Coloque o molde rectangular com poços de montagem (Figura 2) em agarose, tendo o cuidado de limitar a formação de bolhas em torno dos poços. </li><li> Permitir agarose solidificar. </li><li> Retire do molde eo placa de Petri com o azul / água embrião. </li><li> Armazenar em posição vertical, enchido com água limpa, à temperatura ambiente para utilização no mesmo dia ou a 4 ° C para uso futuro. </li></ol> 4. Mix fazer DNA plasmídico para Injectáveis <ol><li> Diluir o ADN plasmídico até uma concentração de 50 ng / ul com vermelho de fenol a 1:10 em DDH 2 O. Paraexemplo: <table border="1"><tbody><tr><td> 1,0 ml </td><td> DNA plasmídeo (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0,5 ml </td><td> vermelho de fenol </td></tr><tr><td> 3,5 ml </td><td> DDH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Mistura de ADN podem ser mantidas à temperatura ambiente, se usar imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante vários dias. </li></ol> 5. Configure pares acasalados Isto deve ser feito a noite antes que você pretende fazer injeções. <ol><li> Preencha tanques de criação com sistema de água e coloque peixes machos e fêmeas juntos. Se as injecções não pode ser realizada logo que as luzes mudam na instalação, peixe macho e fêmea com um divisor separado. </li></ol> 6. Prepare-se para Injeções (pode ser feito enquanto espera para embriões) <ol><li> Ligue pressão injetor plataforma. Verifique se o sistema está configurado para pulsar. Comece com o conjunto de duração de pulso a 1. </li><li> Ligue a válvula de ar eAjuste a pressão injetor para ~ 20 psi. </li><li> Usando um escopo de dissecação com a maior ampliação, quebrar a ponta da agulha com uma pinça ou uma póquer para criar uma abertura uM ~ 2 (Figura 3, Movie 1). </li><li> Preencha agulhas com uma mistura de DNA por: 1. Colocação da agulha do lado da ponta, para cima, para a mistura de ADN e permitindo que a agulha preencher por acção capilar ou 2. Utilizando uma ponta de longo alcance para pipetar 1-2 ul do DNA misturar directamente para dentro da agulha. </li><li> Lugar cheio de agulhas em um lugar seguro até que esteja pronto para injetar. </li></ol> 7. Coletar embriões <ol><li> Depois de luzes facilidade de ter ligado, remova divisores (se aplicável). Coletar embriões com um coador / peneira pequena e transferi-los para uma placa de Petri com o azul fresco / água embrião. </li></ol> 8. Injectar embriões no estágio de célula 1-2 <ol><li> Transferir os embriões colhidos para moldes de injecção, utilizando uma pipeta de plástico. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, empurre embriões empoços com uma pinça ou um pôquer sem corte (Figura 4, filme 2). </li><li> Coloque agulha carregada em um micromanipulador e posição sobre embriões. </li><li> Calibrar o volume de injecção, ajustando a duração do pulso em um passo incrementos de até alcançar o volume desejado (~ 1 nl). Isto poderia ser calibrado com um micrómetro, como descrito em um vídeos anteriores Jove 8, 22, mas para esta precisão experiência não é necessária, uma vez que uma ampla gama de volumes de injecção irá resultar em expressão adequada. </li><li> Injectar ~ 1 nl DNA misturar diretamente na célula e repita para todos os embriões. O ADN pode também ser injectado na gema de ovo, mas esta tende a ser menos eficientes (Figura 5, Movie 3). </li><li> Remover embriões injetados de molde utilizando um fluxo suave de azul / água embrião. </li><li> Loja injectado em embriões de 28,5 ° C no escuro. </li><li> Remover não fertilizados, embriões danificados ou mortos periodicamente. </li><li> Trate embriões wiª PTU entre 18-24 hpf para evitar a pigmentação. </li></ol> 9. Tela para a expressão do transgene <ol><li> Manualmente dechorionate 24-48 embriões HPF usando uma pinça. </li><li> Anestesiar larvas usando 0,02% tricaina. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência de dissecação, identificar larvas com RB ou expressão neurônio trigêmeo e transferir para um novo prato com água fresca PTU azul / embrião. Embriões com expressão em células esparso facilmente identificáveis ​​são óptimas, mas neurónios individuais serão orientadas para a activação com um cabo de fibra óptica para uma ampla gama de densidade de expressão é aceitável. </li><li> Embriões Armazenar a 28,5 ° C no escuro até desejada fase experimental. </li></ol> 10. Monte larvas para Experimentos Comportamento <ol><li> Faça 1,5% baixo derretimento de agarose em DDH 2 O e armazenar em um bloco de aquecimento 42 ° C para evitar que ele se solidifique. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, a transferência de uma das larvas pré-rastreada para uma banheirae de 1,5% de agarose de fusão baixo, com água como azul / embrião pouco quanto possível. </li><li> Transferir as larvas numa gota de agarose sobre uma placa de Petri pequenas. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, a posição se dorsal larva. </li><li> Quando agarose solidificou, cortar a agarose com uma lâmina fina (# 11 bisturi), deixando uma cunha de agar em torno da larva inteira. </li><li> Faça dois cortes diagonais em cada lado da gema, tomar cuidado para não nick da larva. </li><li> Preencha a área em torno da agarose com embrião / água azul. </li><li> Puxar agarose longe do tronco e cauda da larva (Figura 6). </li></ol> 11. Prepare alta velocidade da câmera e software de imagem <ol><li> Monte de alta velocidade da câmera para dissecar escopo. </li><li> Conectar a câmera ao computador. </li><li> Ligue o computador. </li><li> Ligue de alta velocidade da câmera. </li><li> Software de vídeo / imagem aberta (Usamos AOS software de imagem e descrever os procedimentos para usá-lo aqui, mas outra imagemsoftware é igualmente aceitável). </li><li> Ajustar as configurações da câmera de acordo (ou seja, 1.000 quadros por segundo (fps), tampão de gatilho de 50% ou outras configurações preferenciais). </li><li> Iniciar a gravação. </li></ol> 12. Ativar neurônios individuais usando um laser de 473 nm <ol><li> Anexar a laser estimulador e cabo óptico. </li><li> Ligue estimulador. </li><li> Definir estimulador a um máximo de 5 volts e com uma duração de pulso de 5 mseg. </li><li> Ligar a laser de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Usar um microscópio de dissecação para posicionar a ponta do cabo óptico próximo do corpo celular de um neurónio com Chef-tdTomato expressão (Figura 6). </li><li> Entregar pulso de luz azul para ativar neurônio sensorial. </li><li> Comportamento registro usando uma câmera de alta velocidade fixado em 500 ou 1.000 quadros por segundo. </li><li> Repita experimento como desejado, espera 1 min entre cada activação para evitar a habituação. (Nós registramos um mínimo de três respostas para cada neurônio). </li><li> Paralarvas lançamento, erguer além de agarose com uma pinça, tomando cuidado para não ferir o animal. Este animal pode ser permitido o desenvolvimento adicional e o processo pode ser repetido em uma fase mais antiga para caracterizar o desenvolvimento do comportamento. O embrião pode ser remontado de alta resolução de imagem confocal de células activadas para correlacionar o comportamento com a estrutura celular, tal como descrito abaixo. </li><li> Transfira a larva placa de cultura com o azul fresco / água embrião. Nós usamos uma placa de 24 cavidades para controlar larvas individual. </li></ol> 13. Neuron imagem (s) com um microscópio Confocal <ol><li> Anestesiar larvas com tricaina 0,02%. </li><li> Mount larvas, com o lado dorsal para cima, em 1,2% de agarose de fusão baixo ou de um molde dorsal. </li><li> Imagem chef-tdTomato neurônios com um laser nm 543 e filtro adequado e objetivo. Usamos uma objetiva de 20x. </li><li> Remover larvas de agarose e voltar ao indivíduo bem com o azul / água embrião. </li><li> Armazenar a 28,5 ° C no escuro, para fuanálise rther. </li></ol>

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	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.

Nós descrevemos uma abordagem para optogenética ativação de neurônios individuais em zebrafish RB ao vivo. Nosso método emprega transgenia transitória para expressar uma fluorescente etiquetado variante channelrodopsina, chef-tdTomato 13, em determinados neurônios somatossensoriais. Esta abordagem poderia ser facilmente adaptado para o uso em outras populações de células larvais zebrafish. Usando essa abordagem, consistentemente induziu respostas comportamentais 34-48 l...

O desenvolvimento de métodos optogenética para promover ou inibir a excitabilidade neuronal com comprimentos de onda de luz definidos, tornou possível estudar a função de populações distintas de neurônios nos circuitos neurais que controlam o comportamento 1, 19, 21. Esta técnica é frequentemente usada para activar grupos de neurónios, mas também pode ser usado para activar os neurónios individuais. Larvas de peixe-zebra são particularmente sensíveis a estes métodos, uma vez que são translúcidos, o sistema nervoso se desenvolve rapidamente, e a criação de animais transgénicos é rápida e de rotina. No entanto, importantes barreiras técnicas devem ser superados para conseguir a ativação confiável único neurônio. Para otimizar um processo de ativação dos neurônios optogenética zebrafish individuais, nós nos concentramos em neurônios somatossensoriais. Larvas do peixe detectar uma variedade de estímulos somatossensorial, utilizando duas populações de neurônios: os neurônios trigeminais, que inervam a cabeça, e Rohon Barba-(RB), que inervam neurónios do resto do corpo. Cada neurônio trigêmeo e RB projeta um axônio periférico que ramos extensivamente na pele para detectar estímulos e um axônio central que conecta a jusante circuitos neurais. Os animais respondem ao toque tão cedo quanto 21 horas pós-fertilização (hpf), indicando que os circuitos somatossensoriais coerentes formaram 5, 18. Durante o desenvolvimento das larvas, pelo menos, algum do trigémeo e RB sinapse neurônios na célula Mauthner para activar respostas de fuga clássicos, mas a acumular evidência sugere que há múltiplas classes de neurónios somatossensoriais com diferentes padrões de conectividade que podem suscitar variações sobre o comportamento de fuga 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. A motivação para o desenvolvimento deste método foi caracterizar a função comportamental de diferentes classes de neurónios sensoriais, mas esta abordagem poderia, em princípio, ser utilizado para estudar a função do neurónio ou quase qualquer população de neurónios no larval zebrafish. Douglass et ai. Anteriormente descrito um método para a activação channelrodopsina-2-expressando neurônios somatossensoriais com luz azul, provocando o comportamento de escape 3. A sua abordagem utilizado um elemento potenciador do gene ISL1 para conduzir a expressão de CHR2-EYFP em neurónios somatossensorial. Este transgene, no entanto, foi relatado para exibir fluorescência relativamente fraco, o que requer a co-injecção de um segundo repórter, UAS :: GFP, para permitir a visualização das células que expressam CHR2-EYFP. Esta abordagem foi utilizada para obter respostas de comportamento entre 24-48 hpf, mas nunca poderia provocar uma resposta passado 72 hpf. Assim, embora este método funciona para estudar circuitos neurais em muito primeiros estágios larvais (24-48 hpf), é insuficiente para a caracterização de circuitos neurais e respostas comportamentais em larvas mais velhas, quando mais diversas respostas comportamentais são aparentes e os circuitos neurais são mais maduros. Procuramosmelhorar a sensibilidade desta técnica, a fim de caracterizar a função de sub-populações de neurónios RB larvais. Para melhorar a expressão utilizou-se um intensificador somatossensorial específico (CREST3) 20 para conduzir a expressão de LexA-VP16 e um alongamento de sequências do operador LexA (4xLexAop) 11 para amplificar a expressão de um canal de fluorescência marcado activado pela luz. Esta configuração amplificado expressão do canal, eliminando a necessidade de co-expressão de um segundo repórter e que nos permite determinar directamente a abundância relativa do canal em cada neurónio. Usando a sequência de LexA / LexAOp tinha a vantagem adicional de permitir-nos introduzir o transgene em peixes-zebra linhas repórter que utilizam o sistema Gal4/UAS. A expressão transitória do transgene resultou em níveis variáveis ​​de expressão, mas era geralmente suficientemente robusto para visualizar o corpo da célula e as projecções axonais dos neurônios individuais ao longo de vários dias. Para otimizar a sensibilidadedade de luz que usamos a luz ativado canal chef, uma variante channelrodopsina consistindo de uma quimera de channelopsin-1 (Chop1) e channelopsin-2 (Chop2) com um site de cruzamento na hélice laço EF 13. Este canal é ativado no mesmo comprimento de onda chr2, mas requer menor intensidade de luz para ativação, tornando-a mais sensível do que outros canais comumente usados, incluindo chr2. A proteína chef foi fundida com a proteína fluorescente vermelha, tdTomato, permitindo-nos para a tela para a expressão da proteína sem ativar o canal. Como uma fonte de luz, foi utilizado um diodo bombeado laser de estado sólido (DPSS) acoplado a um cabo de fibra óptica para proporcionar uma precisa, pulso de alta potência de luz azul, para uma região específica da larva. Isto permitiu-nos concentrar a luz laser sobre neurónios individuais, eliminando a necessidade de encontrar raros animais transgénicos que expressam o canal num único neurónio. Usando essa abordagem, fomos capazes de ativar neurônios individuais RB, gravar resposta comportamentals com uma câmera de vídeo de alta velocidade, e os neurônios ativados imagem em alta resolução com microscopia confocal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiais </td></tr><tr><td> Pipeta de Pasteur de vidro </td><td> Pescador </td><td> 1367820B </td><td> ou equivalente (10-15 mm de diâmetro) </td></tr><tr><td> 200 fibra óptica mM </td><td> Thorlabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Comprimento: 3 m, Acabar A: FC / PC End, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> 50 fibra óptica mM </td><td> Thorlabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> Patch Cord, Comprimento: 3 m, Acabar A: FC / PC End, B: FC / PC, Jacket: FT030 </td></tr><tr><td> Ferramenta de descascamento ajustável </td><td> Thorlabs </td><td> AFS900 </td><td> Ferramenta ou três furos Stripping (FTS4) </td></tr><tr><td> Diamante escriba Wedge </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Tubo de vidro de borosilicato com filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> Molde de injeção </td><td> n / a </td><td> n / a </td><td> Figura 5 </td></tr><tr><td> 1,5 ml tubos de centrífuga </td><td> Qualquer </td><td> Qualquer </td><td></td></tr><tr><td> Placa de petri (100x15 mm) </td><td> Qualquer </td><td> Qualquer </td><td></td></tr><tr><td> Petri (60x15 mm) </td><td> Qualquer </td><td> Qualquer </td><td></td></tr><tr><td> Pressão injetor </td><td> ASI </td><td> MPPI-3 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Micromanipulador e metal estande </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Pipetas descartáveis ​​de plástico </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Poker (titular Pin e pino Inseto) </td><td> Multa Ciência Tools, Inc. </td><td> 26018-17 e 26000-70 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Multa Ciência Tools, Inc. </td><td> 11255-20 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Microloader ponteiras </td><td> Eppendorf </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 ° C incubadora </td><td> qualquer </td><td> qualquer </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C de calor bloco </td><td> Qualquer </td><td> Qualquer </td><td></td></tr><tr><td> Não-estéreis lâminas de bisturi # 11 </td><td> Belas ferramentas científicas, Inc. </td><td> 10011-00 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Dissecando slidar </td><td> Zeiss </td><td> Stemi </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Fluorescente escopo de dissecação com filtro padrão </td><td> Qualquer </td><td> qualquer </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 ou 710 </td><td> ou objetivos equivalentes com lasers para GFP e RFP, e 10x, 20x e 40x </td></tr><tr><td> Câmera de alta velocidade </td><td> AOS Technologies, Inc. </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> 473 nm laser portátil </td><td> Lasers de cristal </td><td> CL-473-050 </td><td> ou poder superior, com opção TTL </td></tr><tr><td> S48 Estimulador </td><td> Astro-Med, Inc. divisão Instrumento Grama </td><td> S48K </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> FC PC / para FC / PC manga de acoplamento </td><td> Thorlabs </td><td> ADAFC1 </td><td> Maio need para conexão de cabo óptico </td></tr><tr><td> Segurança Laser óculos </td><td> Thorlabs </td><td> LG10 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> 24 placas de cultura </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Solteiro lâminas depressão </td><td> Pescador </td><td> S175201 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Ecossistemas Aquáticos </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de metileno </td><td> Pescador </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de fenol </td><td> Sigma </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> ou equivalente </td></tr><tr><td> Baixa Melt agarose </td><td> Sigma </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; ou equivalente </td></tr><tr><td> PTU </td><td> Sigma </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaina </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> água / embrião azul </td><td></td><td></td><td> 10 L DDH 2 O 0,6 g instantânea Oceano 6 gotas de metileno azul </td></tr><tr><td> vermelho de fenol </td><td></td><td></td><td> (5 mg / ml em 0,2 M KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0,150 g PTU 50 ml DDH 2 O dissolver em 70 ° C, agitar frequentemente alíquota e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 ml 100x PTU 99 ml de água azul / peixe </td></tr><tr><td> Tricaina solução estoque </td><td></td><td></td><td> 400 mg tricaina 97,9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2,1 ml de Tris 1M, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; ajustar o pH para 7,0 ~ armazenar em 4 ° C ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

Zebrafish larvais estão a emergir como um modelo para descrever o desenvolvimento ea função de simples circuitos neurais. Devido à sua fertilização externa, o rápido desenvolvimento, e translucidez, peixe-zebra são particularmente bem adequados para as abordagens optogenética para investigar a função do circuito neural. Nesta abordagem, os canais de iões sensíveis à luz são expressos em neurónios específicos, permitindo que o experimentador para activar ou inibir-los à vontade e, assim, avaliar a sua contribuição para comportamentos específicos. A aplicação destes métodos em zebrafish larval é conceitualmente simples, mas exige a otimização de detalhes técnicos. Aqui demonstramos um procedimento para expressar uma variante channelrodopsina nos neurônios de larvas de zebrafish somatossensoriais, foto-ativação de células individuais, e registrando os comportamentos resultantes. Com a introdução de algumas modificações de métodos previamente estabelecidos, esta abordagem pode ser utilizada para eliciar respostas comportamentais de neurónios individuais activados atépara pelo menos 4 dias pós-fertilização (DPF). Especificamente, nós criamos um transgene usando um neurônio somatossensorial enhancer, CREST3, para dirigir a expressão do marcado channelrodopsina variante, chef-tdTomato. Injectar este transgene em células de embriões de uma-etapa resulta na expressão de mosaico em neurónios sensoriais, que podem ser visualizados por microscopia confocal. Illuminating identificaram células desses animais com a luz de um laser de 473 nm DPSS, guiado através de um cabo de fibra óptica, provoca comportamentos que podem ser gravados com uma câmera de vídeo de alta velocidade e analisados ​​quantitativamente. Esta técnica pode ser adaptada para comportamentos de estudo induzidas pela activação de qualquer neurónio de peixe zebra. Combinando esta abordagem com perturbações genéticas ou farmacológicas será uma forma poderosa para investigar a formação de circuito e função.

<img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Cabo de fibra óptica configurar. (A) Camadas de um cabo de fibra óptica. (B) do cabo de fibra óptica descascado em uma pipeta Pasteur. (C) Cabo de fibra óptica em pipeta Pasteur posicionado usando um micromanipulador. <img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Modelo de m...

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Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Optogenética técnicas tornaram possível estudar a contribuição dos neurónios específicos para o comportamento. Nós descrevemos um método em zebrafish larval para ativar neurônios individuais somatossensoriais expressando uma variante channelrodopsina (chef) com um diodo-bombeado do laser de estado sólido (DPSS) e registrando os comportamentos eliciados com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Optogenética ativação de neurônios Zebrafish somatossensoriais usando chef-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K visualizações.  University of California, Los Angeles. Optogenética técnicas tornaram possível estudar a contribuição dos neurónios específicos para o comportamento. Nós descrevemos um método em zebrafish larval para ativar neurônios individuais somatossensoriais expressando uma variante channelrodopsina (chef) com um diodo-bombeado do laser de estado sólido (DPSS) e registrando os comportamentos eliciados com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Neurociência

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

Potenciais relacionados a eventos somatossensorial de pele Orofacial estiramento Estimulação

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...