Gostaríamos de agradecer a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi e Sonia Garcia para conselhos valiosos sobre melhorias para a automação de processo patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para aconselhamento e assistência com implementação de software valioso. Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto Synapse UE e, em parte, pelo Programa Ciência Fronteiras Humanos.

1. Preparação Equipamento <ol><li> Manipuladores de controle de um computador <ol><li> Conecte cada caixa controlador micromanipulador para um computador através de portas seriais (RS-232). </li><li> Implementar os comandos para posicionamento, consulta e ajustar as configurações para ser enviado através da porta serial. Problemas de velocidade e compatibilidade de hardware Dado C / C + + é recomendada como a linguagem de programação. </li><li> Padronizar o sistema de referência de modo a que os manipuladores de zero é a posição mais próxima possível no que diz respeito aos motores e movimento positivo é dirigido para fora a partir dos motores. </li><li> Posicione o microscópio em sua posição central de 2 mm acima da amostra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]). </li><li> Loja, para cada manipulador, as coordenadas do local que permita que a ponta de uma pipeta a ser observada no centro do campo de visão do microscópio. Este é o ponto de referência inicial para cada eletrodo. </li></ol></li><li> Visuaposições dos eletrodos Lize. Ele é muito útil para ser capaz de controlar a posição de cada eletrodo durante um experimento. A representação gráfica é a forma mais intuitiva de realizar isto. Para o efeito os sistemas de referência de cada eletrodo e que do microscópio deve ser correspondido. Uma maneira simples de fazer isso é: <ol><li> Traga a ponta de um eléctrodo para o centro do campo de visão. </li><li> Guardar a posição de cada eixo do manipulador e cada eixo do microscópio. </li><li> Executar com o eixo x do manipulador de um movimento relativamente grande (1 mm). </li><li> Localize a ponta mais uma vez movendo-se apenas ao microscópio. </li><li> Calcula-se a diferença na posição do microscópio, uma vez que foi passado medido. Estas são as projeções do movimento do eixo do eletrodo sobre o eixo do microscópio. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,5 para o Y e Z do manipulador eletrodo. Isto permite que uma matriz de projecções com o microscópio eixos a ser determinado (&lt;strong&gt; Figura 2) também chamada matriz de co-seno: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg" /></li><li> Inverter esta matriz para torná-lo possível calcular os movimentos, em três dimensões, necessários pelo manipulador eléctrodo para atingir uma dada posição no microscópio sistema de coordenadas: <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg" /></li><li> Usando o ponto inicial de referência e a matriz de co-seno determinar a posição de cada eléctrodo no microscópio coordenadas. </li><li> Apresentar graficamente, com base no microscópio coordenadas, a posição de cada um dos eléctrodos em intervalos regulares. Optamos por usar C / C + + bibliotecas desenho (GDI +) para desenhar posições dos eletrodos a cada 40 milissegundos. </li><li> Repita os passos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez ângulos do manipulador são alteradas ou se são necessárias mudanças de posição de vários milímetros, por exemplo, quando o tipo de eletrodo é alterado. </li></ol></li><li> Ativar o armazenamento do positions de características relevantes no tecido, como as células ou pontos de referência anatômicos, em microscópio coordena. </li><li> Adquirir vídeo e sobrepor informações relevantes. <ol><li> Mecanicamente alinhar o eixo-x de movimento do microscópio, com o eixo horizontal da câmara do microscópio. </li><li> Instale no computador um framegrabber com vídeo ao vivo e capacidade de sobreposição e um kit de desenvolvimento de software (SDK). </li><li> Implementar a operação de exibição de vídeo ao vivo com o SDK. </li><li> Converter o sistema de coordenadas do microscópio para o sistema de referência da câmara pela tradução adequada e escamação. </li><li> Desenhe as características relevantes em coordenadas de câmera e sobreposição no vídeo ao vivo a imagem resultante em intervalos regulares de cerca de 40 ms (Figura 3). </li></ol></li><li> Amplificadores de controle. <ol><li> Use o software amplificador para controlar as configurações do amplificador da interface. </li></ol></li><li> Control osciloscópios. <ol><li> Conecte os osciloscópios ao PC usando portas seriais. </li><li> Determine a escala do osciloscópio, acoplamento e resolução temporal para as diferentes etapas do processo de patch-clamp em tensão-clamp (por exemplo, eletrodo na banheira, formação de selo, a configuração de célula inteira) e corrente-clamp. </li><li> Envie os comandos de configuração do osciloscópio apropriadas sempre que os comandos de amplificação são emitidos a partir da interface. </li></ol></li><li> Pressão pipeta de controle. <ol><li> Montar um sistema de controlo de pressão de acordo com a Figura 4. <ol><li> Use uma fonte de alimentação de 12 V / 5 V para fornecer a cada componente eletrônico de forma adequada. </li><li> Ligue a saída de uma bomba de membrana para o buffer de pressão positiva (um recipiente de 100 ml). </li><li> Ligar a entrada de uma bomba de membrana para o buffer de pressão negativa (um recipiente de 100 ml). </li><li> Ligue o tubo porta-pipeta para um sensor de pressão no pressure sistema de controlo e uma válvula pneumática, que liga para o compartimento de pressão principal. </li><li> Ligar cada um dos tampões de pressão para uma válvula ligada ao compartimento de pressão principal. </li><li> Conectar uma válvula de pressão entre o compartimento principal e a atmosfera. </li><li> Conectar um sensor de pressão para o compartimento de pressão principal. </li><li> Conectar um sensor de pressão de cada tampão. </li><li> Ligar o sistema de controlo de pressão de uma placa de aquisição de dados. </li><li> Conecte cada sensor de pressão para uma entrada analógica. </li><li> Conecte cada válvula para uma saída digital. </li></ol></li><li> Retirar deslocamento de todos os sensores, abrindo as válvulas excepto as ligar às bombas de membrana e subtraindo a medida de pressão à pressão atmosférica. </li><li> Implementar o controle da pressão <ol><li> Definir na interface de um controle para ativar ou de-ativar o controle de pressão positiva para cada pipeta. </li><li> Definir uma pressão positiva mínima para a pipetas de cerca de 70 mbar. </li><li> Periodicamente (a cada 0,5 seg) detectar sempre que a pressão em pipetas sob controle de pressão ativo cai abaixo do limiar definido. </li><li> Após a passagem da cabeceira abrir o tampão de pressão positiva para o compartimento de pressão principal e esse compartimento para a pipeta em questão durante períodos breves (20 ms) até que a pressão nas pipetas é acima do limiar. Feche todas as outras válvulas. </li><li> De-ativar ainda mais o controle da pressão, como a aproximação final para uma célula de interesse é iniciada. </li></ol></li><li> Aplique uma pressão negativa para a formação selo <ol><li> Feche todas as válvulas e abra a válvula tampão pressão negativa em relação à pressão do compartimento principal e esse compartimento para a pipeta em questão para a duração do experimentador requer por manter um botão pressionado. </li></ol></li></ol></li><li> Centralize comandos para um dispositivo de interface humana. <ol><li> Conecte um wirele disponível comercialmentess gamepad para o PC. </li><li> Implementar leitura de status de joystick. Por exemplo, usar as bibliotecas do DirectX para C / C + + para realizar leituras a cada 5 ms. </li><li> Compare o estado atual com o estado anterior para detectar quais botões foram pressionado, liberado ou permanecer pressionado desde passo última vez. </li><li> Atribuir funções a cada botão no gamepad. Um exemplo deste mapeamento é mostrado na Figura 5. </li></ol></li></ol> 2. Patch-clamp Procedimento <ol><li> Preparar as fatias de cérebro da região de interesse. </li><li> Coloque uma fatia do cérebro de interesse, com a região de interesse no centro da faixa de deslocamento do microscópio. </li><li> Seleção celular <ol><li> Identificar células de interesse por navegar com o microscópio. Guarde a posição das células com base no microscópio sistema de coordenadas com um direito do mouse clique sobre o monitor de vídeo ao vivo na parte superior da célula de interesse. </li&gt; <li> A interface gráfica apresenta as células seleccionadas, assim como as micropipetas para uma visão geral e global do software irá adicionar um marcador na posição de célula que vai ser revestida sobre as imagens. Além disso uma imagem do celular é capturado para referência futura no arquivo &#39;celular #. Jpg&#39;. </li></ol></li><li> Atribuição de células para pipetas <ol><li> Depois de selecionar as células de interesse, atribuir pipeta que irá gravar cada célula. A interface gráfica fornece controles de atribuição que deve ser definido. Visualize uma prévia da configuração final selecionando a opção &#39;Mostrar posições finais. </li><li> Selecione cada pipeta para que a pré-visualização posição final é desejado ou marque a caixa &#39;Selecionar tudo&#39;. Desativar a exibição de posição atual para melhor visualização, se necessário. </li></ol></li><li> Prepare as Pipettes <ol><li> Encha as pipetas (6-8 mohms são geralmente melhor se muitas pipetas são usados) wiª solução intracelular e carregá-los em seus titulares. Coloque os headstages em suas fixações, mas não deslizar para a frente para evitar tocar o banho com a ponta da pipeta. </li><li> Ativar o controle de pressão positiva e selecione todas as pipetas para garantir que as dicas permanecerá limpo. Deslize com cuidado cada headstage no lugar. </li></ol></li><li> Localizando as pontas de pipeta <ol><li> Posicione o microscópio para uma posição central, com foco três milímetros acima da fatia, premindo o botão R2, mantendo o botão &#39;A&#39;. Use a posição correspondente para cada manipulador como armazenado a partir da experiência anterior, premindo o botão L2, mantendo o botão A. Nota: Neste ponto não deve ser uma sombra distintivo de uma pipeta em vista ou um pequeno movimento ao longo do eixo da pipeta deve ser suficiente para observá-lo na maioria dos casos. Compensação para as pequenas diferenças na forma pipeta tem de ser realizada manualmente. </li><li> Traga a ponta da pipeta em foco. Coloque a ponta no ponto central de vermelho da exibição de vídeo, sem mover o microscópio (que ainda deve estar na posição [0, 0, 2000]). </li><li> Informar o software que a pipeta está no centro da tela, pressionando o botão Z, mantendo o botão C. Após cada ponta da pipeta está localizado, enviar essa pipeta para trás de modo que o seguinte pode ser localizado, premindo o botão L1, mantendo o botão A. </li></ol></li><li> Aproximando-se as células <ol><li> Uma vez que todas as pontas de pipetas foram localizados com precisão e cada pipeta é atribuída a uma célula, posicionar automaticamente as pipetas perto das suas respectivas células. Simplesmente clique com o botão direito no centro do grupo de células e selecione a opção &#39;cluster&#39; no menu pop-up. Na janela de opções do cluster que irá aparecer, selecione todas as pipetas que deseja posicionar neste momento e clique em &#39;Vá com todas as pipetas verificados. Repita esta operação para cada conjunto de células de interesse. </li><li> Perform a aproximação final manualmente. A posição das pipetas relativos às células podem ser especificados de forma diferente, mas normalmente é simplesmente de 200 mM para longe da célula do eixo da pipeta e 200 um acima dela, em sentido vertical, o que é suficiente para manter a ponta da pipeta de fora do tecido . Aguarde até que o posicionamento das pipetas está acabado e mover o microscópio no sentido de uma pipeta, premindo o botão R1 enquanto pressiona o botão C. </li><li> Recalibrar cada posição pipeta, concentrando-se o microscópio sobre a sua ponta em qualquer lugar do monitor de vídeo e pressionando o botão B enquanto segura o botão C. A grade quadrada deve aparecer brevemente indicando a posição identificada da pipeta. Se a posição não está correta, posicione a ponta no ponto central da exibição de vídeo e pressione o botão Z, mantendo o botão C. </li></ol></li><li> Estabelecer a configuração anexado à célula <ol><li> Confirme se a célula de interesse para a pipeta atual é corretamentemarcado. Caso contrário, se mover ao microscópio para coincidir com a célula de interesse, com o ponto central vermelho. Marcar a célula pressionando o botão Y, mantendo botão C. Pressione L2, mantendo o botão C para posicionar a pipeta de 200 mM de distância de sua célula atribuído, o microscópio passará automaticamente para a posição correspondente. </li><li> Ajuste a posição da pipeta para que coincida com o ponto vermelho. Ajustar o deslocamento pressionando o botão R1 enquanto pressiona o botão X. pipeta </li><li> Ative o pulso de teste pressionando o botão L1, mantendo o botão X. aproximar lentamente a pipeta para sua célula atribuído. </li><li> Ao observar a formação de uma depressão na superfície da membrana da célula aplicam-se um breve pulso de pressão negativa, premindo o botão Y, mantendo o botão Z para permitir que a pressão aplicada para alcançar a célula. Um potencial de realização de cerca de-65mV deve estabelecida neste ponto pressionando o botão L2, mantendo o botão X. </li></ol></li><li> A configuração de célula inteira<ol><li> Uma vez que um Giga-selo é formado, para cada célula, começa ruptura das membranas pela aplicação de pressão negativa. </li></ol></li><li> Realize gravações <ol><li> Use o sistema de estimulação / aquisição para realizar as suas gravações. Aplicar pulsos ou trens de pulsos em uma célula individual em um tempo e observar as respostas sobre as células restantes para mapear a conectividade entre as células gravadas. </li></ol></li><li> Recede pipetas <ol><li> Uma vez que as gravações terminarem, recuar pipetas lentamente do tecido clicando com o botão direito do mouse no botão de rádio de mesa. Selecione &quot;Recede-&gt; Pipettes 500 mm &#39;para ter as pipetas recuar a uma curta distância ao longo de seus eixos. Observe a deriva no potencial das células (limpar as pontas, aplicando um pouco de pressão positiva pode ajudar). </li><li> Para diminuir pipetas todo o caminho de volta, definir a velocidade de posicionamento para &#39;Fast&#39; e repetir a mesma operação, mas escolha a opção &#39;Todos&#39;. Remover o usadopipetas, deslizando suavemente os headstages e desapertando as pipetas dos respectivos detentores. É útil para evitar torções titulares em suas órbitas pois isso pode interferir muito com a posição da ponta da pipeta. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups.">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network.">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).</li><li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex.">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li><li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense,+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons:+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition.">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li><li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network:+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex.">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li><li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons.">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li><li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition,+excitation+and+bistable+modulation.">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li><li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2.">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li><li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks.">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li><li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single,+Genetically+Targeted+Neurons.">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li><li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points.">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).</li><li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLM+Microscopy:+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators.">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma questão imediata geralmente surge sobre a taxa de sucesso do procedimento foi descrito. Para altas taxas de sucesso preparação é essencial. Pipettes deve ter aberturas de ponta que são adequadas para os seres células gravadas. Filtração da solução intracelular para evitar pipetas entupidos também é importante. São impecáveis, pipetas acabadas de tirar são outra exigência. A distribuição binomial é o modelo mais simples que pode ser usado para entender como essas questões afetam o rendimento final...

A capacidade de gravar e estimular vários sites com precisão micrômetro é extremamente útil para experimentalmente alcançar uma melhor compreensão dos sistemas neuronais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para este fim, mas nenhuma permite a resolução submillivolt conseguida pela técnica de patch-clamp, essencial para o estudo da actividade de sublimiar e potenciais pós-sinápticos individuais. Aqui vamos cobrir o desenvolvimento de um sistema de patch-clamp assistida por computador doze eletrodo destinado a registar simultaneamente e estimular um grande número de células individuais com uma precisão suficiente para o estudo da conectividade neuronal. Embora muitas outras aplicações pode ser concebida para um tal sistema, que se presta especialmente bem para o estudo da conectividade sináptica dado que o número de ligações possíveis dentro de um grupo de neurónios aumenta proporcionalmente ao quadrado do número de neurónios em causa. Por conseguinte, enquanto um sistema com três eléctrodos permite testar oocorrência de até seis ligações e na maioria das vezes a gravação de um único, a gravação doze neurónios permite testar a ocorrência de até 132 ligações e frequentemente mais de uma dúzia de observação (Figura 1). A observação de dezenas de ligações simultaneamente torna possível analisar a organização de redes pequenas e inferir propriedades estatísticas da estrutura de rede que não pode ser de outra forma sondado 1. Além disso, a estimulação precisa de numerosas células também permite a quantificação do recrutamento de células pós-sinápticas 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>SM-5</td>
			<td>Serial protocol used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Till Photonics</td>
			<td>VS 55</td>
			<td>BNC analog output</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Framegrabber</td>
			<td>Data Translation</td>
			<td>DT3120</td>
			<td>SDK used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS 2014</td>
			<td>Serial communication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>InstruTECH</td>
			<td>ITC 1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Library used (.dll)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure valve</td>
			<td>SMC</td>
			<td>SMC070C-6BG-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure sensor</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>24PCDFA6G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane pump</td>
			<td>Schego</td>
			<td>Optimal</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a computer-assisted multi-electrode patch-clamp system

A técnica de patch-clamp é hoje o método mais bem estabelecido para gravar a atividade elétrica dos neurônios individuais ou seus compartimentos subcelulares. No entanto, a realização gravações estáveis, mesmo a partir de células individuais, continua a ser um processo demorado de considerável complexidade. Automação de muitos passos em conjunto com display de informação eficiente pode ajudar muito experimentalistas na realização de um maior número de gravações com maior confiabilidade e em menos tempo. A fim de alcançar as gravações em grande escala que concluiu a abordagem mais eficaz não é de automatizar totalmente o processo, mas para simplificar os passos experimentais e reduzir as possibilidades de erro humano, enquanto que incorpora de forma eficiente a experiência do experimentador e o feedback visual. Com esses objetivos em mente, desenvolvemos um sistema assistido por computador que centraliza todos os controles necessários para uma experiência multi-eletrodo patch-clamp em uma única interface, um commercgamepad sem fio ei ra me nt disponível, durante a exibição de experimento relacionado informação e orientação pistas na tela do computador. Descrevemos aqui os diferentes componentes do sistema que permitiu reduzir o tempo necessário para atingir a configuração de gravação e substancialmente aumentar as chances de gravação com sucesso um grande número de neurónios em simultâneo.

Seguindo os métodos descritos acima, conseguimos realizar a gravação de células inteiras de até doze neurônios simultaneamente, praticamente duplicando o maior número de neurónios em simultâneo, até agora fixada patch. Exemplos de redes de ligações sinápticas directas entre neurónios piramidais gravada na camada V do córtex somatossensorial de ratos são apresentados na Figura 6. A determinação de perfis de probabilidade de ligação como função da distân...

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A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K visualizações.  Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.  Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações. 

Vídeo: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Cultura e Eletrofisiologia de células em NRCC patch-clamp-Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.