Os autores agradecem Dan Bess da Sigma-Aldrich para apresentar o vídeo. Agradecemos também a Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, e Eleanor Williams para os seus resultados e contribuições para o projeto de síntese, de construções de FSL e determinar a atividade biológica.

O protocolo a seguir descreve o procedimento genérico para a inserção de construções FSL (Figura 1) em membranas biológicas. Para simplificar o protocolo só se referem às células (kodecytes), que estão em uma concentração de 100%. No entanto, as células termo é intercambiável com virions (kodevirions) ou organismos ou estruturas celulares e sua concentração em solvente não é importante, desde que seja sempre consistente entre os testes, controles e experimentos. Com os glóbulos vermelhos do volume globular é tipicamente 80%, mas com virions, embriões e outras células é normalmente menos de 1%. O método é muito robusto e irá produzir membranas modificado quando usado por qualquer de suas variações, mas refinamento será necessário para otimizar e padronizar o grau de modificação necessária para aplicações específicas. 1. Preparação de FSL Constrói <ol><li> Para preparar o FSL construir reconstituir solução estoque primeiro o produto FSL seca (Tabela 1) pela adição de 1,0 mL de diluente (ou conforme especificado na bula do produto) para o frasco do produto. Brevemente sonicate (30 segundos). Isso irá preparar uma solução de 1mg/mL, que pode ser aliquotado em 100 mL recipientes esterilizados e armazenados a 2-8 ° C por até uma semana, ou congelado por até 3 meses. </li><li> Para preparar a trabalhar FSL construir soluções para a inserção, pouco antes de usar brevemente sonicate (30 segundos) a solução estoque de homogeneizar qualquer micelas. Diluir a construir FSL em tampão (de preferência que não contenham lipídios ou material altamente hidrofóbicas) para a concentração necessária ou em uma faixa, se desejar. </li></ol> Notas: <ol><li> FSL constrói normalmente inserem em células em meios contendo lipídios, mas geralmente exigem tanto quanto um 50X concentrações mais altas de trabalho do que se FSL em PBS ou meio de lipídios outros livres. </li><li> As diluições faixa de trabalho vai depender da aplicação, a sensibilidade do método de detecção, o tipo de FSL construir, eo grau de modificação necessária. Tipicamente, a faixa de diluição será entre 10-500 mg de FSL por mL de diluente para construções de carboidratos FSL e 100-100 mg / mL para outras construções FSL, como fluoróforos e biotina. </li><li> Se preparando diluentes inserção contendo várias FSL construir, basta adicionar as construções juntos no mesmo diluente em sua concentração normal de trabalho. Se uma construção é a concentração muito mais elevada do que outro, algum ajuste (aumento) de concentração pode ser necessário para o menor construir. Alternativamente construções podem ser adicionados seqüencialmente, de preferência com a maior concentração construir primeiro lugar, seguido pelo menor. </li><li> Concentrações FSL construir acima de 1000 mcg / mL podem apresentar quantidades significativas de lipídios na membrana celular, e pode mudar a forma da célula ou torná-lo mais suscetível à lise. </li><li> FSL construir soluções de trabalho deve ser armazenado a 2-8 ° C e utilizada dentro de poucos dias. </li><li> Constrói FSL pode ser diluído em água, mas terá reduzido estabilidade e deve ser utilizado dentro de horas. Se a bula especifica água como diluente reconstituição, o produto no frasco também irá conter sais (conforme especificado na bula). </li></ol> 2. Inserção da FSL Construct (s) em Membranas <ol><li> Primeiro lave as células para FSL livre modificação de lipídios não ligado por centrifugação e usar PBS ou lipídios mídia celular livre como solução de lavagem. </li><li> Pacote de células ou suspender em 100 mL de diluente. </li><li> Simultaneamente preparar controles que, idealmente, deve ser ambas as células não modificadas (incubadas com PBS, em vez de solução FSL) e / ou células modificadas com um benigna, mas relacionadas FSL construir. </li><li> Adicionar 100 mL de uma diluição adequada de FSL solução (contendo um ou mais construções FSL) para as células e incubar por 1-2 horas a 37 ° C. Um resultado semelhante pode ser obtido por seis horas de incubação a 25 ° C ou durante a noite (18 horas) a 4 ° C - mistura é recomendada a cada poucas horas se suspensões de células pesados ​​são usados. </li><li> Wash (opcional) duas vezes com PBS ou mídia para remover quaisquer construções livres FSL e preparar uma suspensão apropriado. </li></ol> Notas: <ol><li> O diluente usado para suspender as células podem ser meios de cultura celular, PBS, soluções de armazenamento de células, etc, mas de preferência sem lipídios (por exemplo, soro fetal bovino) ou detergentes (por exemplo, TWEEN). </li><li> Volumes diferentes (de 100 mL) ratios (que 1:1 células / solução FSL) ou condições de incubação de tempo e temperatura podem ser utilizados desde a mesma proporção, concentração e volume são usados ​​para obter resultados reprodutíveis. </li></ol> 3. Manipulação e visualização <ol><li> Uma vez que o processo de modificação FSL foi concluída a kodecytes pode ser armazenado a 4-8 ° C em lipídios mídia livre ou usado. </li><li> Kodecytes e kodevirions geralmente se comportam da mesma como células sem modificações / virions e pode ser handled e visto sob sistemas de testes normal (microscopia, sorologia, citometria de fluxo, etc). Eles geralmente não têm requisitos especiais, exceto para evitar a solventes / detergentes / lipídios que podem eluir as construções de lipídios das membranas. </li></ol> Notas: <ol><li> Constrói permanecerá na membrana das células inativas, como glóbulos vermelhos, se armazenado em lipídios mídia livre para a vida da célula. Em células com membranas ativa as construções serão internalizadas e metabolizada, a uma taxa dependente da atividade da membrana celular. </li><li> Células mortas geralmente contêm altos níveis de construções FSL, o que pode ser usado para separar as células não viáveis ​​de células viáveis. </li><li> Se kodecytes são armazenadas (ou usado in vivo) em lipídios contendo media / ambientes, tais como soro / plasma construir o lentamente saem da membrana por um período de horas ou dias, dependendo da temperatura e concentrações de lipídios / composições. </li></ol> 4. Resultados representativos: <ol><li> Os resultados representante seguintes dependem da construção usados ​​(Tabela 1), a sua concentração e inserido a sensibilidade e especificidade relativa do sistema de detecção (s). Em geral todas as construções FSL irá inserir nas células após 1 hora, mas as condições ideais precisam ser estabelecidas para cada situação. </li><li> Constrói FSL pode ser usado para rotular o exterior de uma variedade de células vivas 3-9,11,14. Nos exemplos mostrados na Figura 2 embriões em estágios diferentes foram usados ​​(como são frágeis uma célula), mas outras células (Figura 3) ou virions envolvida (Figura 4) também podem ser rotulados. FSL-Fluoresceína permite a rotulagem direta de superfícies (Figuras 2-4), enquanto FSL-biotina e outras construções FSL pode exigir a utilização de um sistema de detecção secundário (normalmente avidina / anticorpos / lectinas) para mostrar a sua presença (Figuras 5) . </li><li> Marcadores de grupos sangüíneos, da especificidade humana ou animal pode ser anexado às células, incluindo células vermelhas 4-9 (Figura 6). Como a quantidade de FSL construir em um kodecyte é controlável e reprodutível 4-6, kodecytes para quantificação de anticorpos pode ser feita (Tabela 2 e Figura 6). A verdadeira fonte de células não é importante, eles podem ser qualquer espécie, ou mesmo da mesma origem como fonte de anticorpos, garantindo assim a antígeno apenas incompatível é o instituído pela FSL 7,8 (Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabela 2" /> Tabela 2. Representante reações sorológicas de três diferentes FSL-A (tri) kodecytes células vermelhas testado contra diluições de anticorpo monoclonal anti-A. A solução 50 mM de FSL-A (tri), quando incubados com igual volume de células vermelhas produzidas grupo O forte Um células antígeno positivo, o que pode ser detectado por uma diluição 1:512 de anticorpos monoclonais anti-A. A 5 - e 10 vezes menor FSL-A (tri) soluções produzidas kodecytes com o grupo menos sangue A expressão do antígeno. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL construir visão geral" /> Figura 1. FSL visão geral construir. Como uma flor constrói FSL consiste em três componentes principais. O chefe funcional (F) no caso da construção FSL pode ser uma variedade de diferentes grupos biologicamente funcionais, um espaçador (S) para a indução de espaçamento de F longe da membrana, melhorar a dispersão de água e ser não-reativo com soro, enquanto os lipídios diacyl permite a construção de espontaneamente incorporar em superfícies. (I) FSL-GB3 com um grupo de sangue Gb 3 (ou P k) trissacarídeo Galα4Galβ4Glcβ epítopo. (II)-A FSL (tri), com um grupo sanguíneo A epítopo trissacarídeo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceína. (IV) FSL-biotina com uma porção única F biotina. O grupo funcional de estruturas em I-III são conjugados a um derivado ativado adipato de dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), enquanto o espaçador da estrutura IV é carboxymethylglycine-adipato base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-Fluoresceína rotulados embriões murinos" /> Figura 2. FSL-Fluoresceína rotulados embriões de camundongos. Todas as imagens são de embriões vivos que foram rotulados quando sua zona pelúcida (ZP) estava intacta (ie a construção FSL passaram pela ZP para rotular o embrião no interior). Imagens I-IV são de ZP-livre embriões liberados de suas ZP com ácido rotulagem pós tyrodes com FSL-fluoresceína. Coloração idêntica ocorre independentemente de embriões foram FSL modificado com ZP intacta ou livre ZP. Embriões são diretamente rotulados com FSL-fluoresceína, pela 2 horas 37 ° C no soro método de meios de cultura livre de células, lavadas e, em seguida, visto sob microscopia de fluorescência. (I) ZP livre embrião de duas células de camundongos, mostrando também a coloração do corpo clássico intensa polar. (II-III) ZP livre quatro células e oito embriões de células de camundongo, ambos mostrando coloração sombria das células que são outside avião o microscópio de foco. (IV) ZP livre embrião de 16 células de camundongos. (V) ZP intacta embriões murinos blastocisto (d4-d5) onde ambos embrião e zona são rotulados. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluoresceína e zebrafish" /> Figura 3. FSL-Fluoresceína e zebrafish 14. (I) Microangiography em 52 larvas de peixe-zebra hpf (horas fecundação post) injetado diretamente na circulação com FSL-fluoresceína. A vasculatura zebrafish é manchada. (II) FSL-Fluoresceína heterogêneo Zebrafish células de rim de tecido (ZK kodecytes) foram criados ex vivo, em seguida, micro-injetado na circulação de um 52 Zebrafish destinatário hpf. Observações in vivo do kodecytes ZK foram feitas duas horas após a injeção por imagem do vasculatura sob fluorescência com o tempo de lapso de microscopia. É mostrado um quadro de vídeo com grandes células lento ou imóvel (indicado por setas laranja) e rápido células em movimento (imagens desfocadas devido ao movimento - indicado por setas verdes). Rotulagem permite em tempo real na observação in vivo do comportamento e da biodistribuição kodecytes ZK. (III) a absorção oral de FSL-Fluoresceína alcançado por imersão em embriões do zebrafish FSL-Fluoresceína contendo mídia para até 5 dias. Lavar roupa foi alcançado através da transferência de embriões em meios que não contenham construções FSL (pelo menos 6 horas é necessário, mas pode ser por vários dias). (IIIa) microscopia de campo brilhante do zebrafish FSL-Fluoresceína tratados correspondente à imagem ao lado de fluorescência (IIIb). O fluoresence foi localizado preferencialmente no trato intestinal. Coloração não foi observada em embriões controle sem tratamento (IVa e IVb). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-Fluoresceína à rotulagem dos virions" /> Figura 4. Rotulagem FSL-Fluoresceína de virions 10 VSV e H1N1. (I) vírus da estomatite vesicular (VSV) foi diretamente rotulados com 10 mg / ml FSL-Fluoresceína por 2 horas a 37 ° C, seguido de fixação com paraformaldeído 4% e, em seguida, citometria de fluxo. Nenhuma purificação do kodevirion VSV pós FSL rotulagem era necessário. (II) A citometria de fluxo de porcos infectados com células testiculares humana A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions rotulados com FSL-fluoresceína. Células não infectadas são vistos como a linha preta, enquanto a fusão do kodevirion H1N1 com os resultados ST células em uma célula fluorescente (linha vermelha). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotina células marcadas" /> Figura 5. FSL-biotina células marcadas e visualização posterior via avidina rotulados 7,8. Todas as células foram marcadas com FSL primeiro-biotina por 1 hora a 37 ° C, lavado em seguida, reagiu com fluoróforo rotulados avidina, lavados e úmidos montadas para microscopia de fluorescência. (I) Compilado imagem confocal de um blastocisto de embriões de camundongos. (II) fatia Central confocal do embrião a partir da imagem anterior. (III) Live espermatozóides móveis humano - indefinição ocorre como conseqüência de seu movimento. (IV) Fixo (inserção pós paraformaldeído 4%) espermatozóides humanos. (V) de eritrócitos humanos. (VI) Fixo (4% paraformaldeído pré-inserção) RL95 carcinoma endometrial humano. (VII) não fixadas RL95 linha celular humana endometrial carcinoma. (VIII) Biotina RBC kodecytes observada em uma amostra de sangue colhida 2 horas após a infusão intravenosa de kodecytes com (VIIIa), representando um campo visto sob microscopia de luz while (VIIIb) é o mesmo campo visto sob fluorescência, identificando os dois kodecytes presentes no campo de vista. Cálculo do rácio de kodecytes às células sem rótulo pode ser usado como um indicador de sobrevivência. (IX) Live humana kodecytes biotina endometrial visualizada por ligação a contas avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Carboidratos para adicionar marcadores grupo sanguíneo para o perfil sorológico" /> Figura 6. FSL-Carboidratos para adicionar marcadores grupo sanguíneo para o perfil sorológico. (I) Human kodecytes células vermelhas Galili foram criados com um conjunto de concentração FSL-Galili (500 mcg / mL) e testadas contra diluições de soro humano. Eritrócitos humanos não ocorrem naturalmente com o antígeno Galili xenoantigen. Kodecytes tal pode ser usado para níveis quantitativos de anticorpo no soro. Neste exemplo, o doador foi determinada a ter um título de anti-Galili de 1:32. (II) Ao criar kodecytes com diminuição dos níveis de FSL (&quot;títulos de antígeno&quot;), um nível ideal de antígeno para detectar anticorpos pode ser determinado (neste exemplo Le a). As células podem ser criados apenas para dar um resultado positivo quando o nível de anticorpos excede um título específico. O nível de FSL antígeno necessária para dar um resultado positivo depende da qualidade e do nível de anticorpo a ser detectado. Para antígenos de carboidratos, uma solução FSL de 100 mcg / ml costumam resultar em uma forte reação positiva. (III) Human grupo de células vermelhas O foram modificados para ter um nível específico de Uma formigaigen (padronizado A kodecytes), e usado para quantificar de forma precisa e reproduzível anti-A no soro humano. Neste exemplo o anti-A título no soro testado O grupo é 1:32 e as kodecytes foram preparadas a partir do doador próprios glóbulos vermelhos. (IV) do grupo sanguíneo A e B antígenos simultaneamente inserido em um grupo O único amostra de células vermelhas são usadas para criar um kodecytes B fraco fraco. Estes kodecytes pode ser usado para fins de controle de qualidade ABO. Este resultado mostra a análise de um formulado especificamente kodecyte B Um fraco fraco testado contra os reagentes anti-A e anti-B e dá esperava reações fracas.

<ol>
	<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles.">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li><li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+synthetic+peptidolipids,+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells.">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, 194A-194A (2008).</li><li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes.">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li><li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids.">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, 180-180 (2008).</li><li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use.">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model.">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes.">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antibody+screening+cells,+MUT+Mur+kodecytes,+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes.">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li><li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions.">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, (2011).</li><li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+(FSL)+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses.">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, 199-199 (2010).</li><li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms.">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li><li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-Spacer-Lipid+(FSL)+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens.">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, 235-235 (2010).</li><li>Lan, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).</li></ol>

Deborah A. em branco e Stephen M. Henry são funcionários e acionistas da Kode Biotech limitada ao detentor da patente da tecnologia Kode. Dan Bess é um funcionário da Sigma-Aldrich, que patrocinou a produção deste vídeo-artigo.

Células modificando e virions com construções FSL é uma técnica muito simples e robusto 3-11. Para descrever e distinguir FSL construir células modificadas e virions a partir de células não modificado, eles são chamados kodecytes e kodevirions respectivamente 60-10, mas somente quando o grupo apresentou funcional pode ser mostrado para estar presente em sua membrana. Quando kodecytes são feitos com diferentes concentrações de construções FSL, eles podem ser referidos pela concentração da solução de construir FSL usado para criá-los, por exemplo, 15 mcg / mL A kodecytes, ou se mais de um FSL é usado, então, um termo combinados, por exemplo, A + biotina kodecytes 7,8. Quando as células diferentes podem ser comparados, incluindo o tipo de célula na descrição é recomendado, por exemplo, de células vermelhas kodecytes biotina ou kodecytes biotina endometrial 7,8. Embora o processo de inserção é muito robusto e de inserção (embora com taxas diferentes) ocorrerá em um amplo intervalo de temperatura 4-37 ° C e dentro de minutos a horas, para obter o controle de inserção reprodutíveis estrita de tempo de contato, temperatura, concentração FSL ( incluindo a formulação de diluente), e, em menor grau de concentração de células são obrigatórios. Até à data, todas as construções FSL pode ser usado para modificar as células através da mesma técnica 4-11, no entanto espera-se que certas condições serão mais favoráveis ​​para o fluxo de trabalho e / ou os requisitos ótimo manuseio das células / virions a ser modificado . A concentração FSL exata para alcançar o efeito desejado precisa ser determinado pelo usuário 4. A FSL resultante construir células modificadas / virions geralmente pode ser usado da mesma maneira como uma célula sem modificações / virion em sistemas biológicos ou analítica 4-11. Como as construções FSL eluir lentamente a partir de superfícies modificada quando em contato com soluções de lipídios 7,8, ou ser consumido por células ativas 11, estas questões devem ser consideradas com relação ao nível de sinal ou atividade obtidos ao longo de períodos de tempo. Kodecytes pode ser fixo (por exemplo, glutaraldeído / formol) após a inserção, desde que o fixador não contém lipídios eluidor de solventes eo grupo funcional é compatível com o fixador. Alternativamente células fixas podem ser modificadas com construções FSL. Além da modificação da superfície das células e virion constrói FSL também pode ser infundido diretamente na circulação de animais de laboratório causando na modificação in vivo de células circulantes 7 e para inibir vírus 12, toxinas, 12 e anticorpos 7. FLS construções também foram usadas para decorar lipossomas e podem ser impressos em superfícies de papel 13, onde se imobilizar, e pode então ser usada em ensaios de diagnóstico. A capacidade de facilmente modificar células vivas com uma gama crescente de construções FSL deve provar ser uma pesquisa útil e ferramenta de desenvolvimento para o estudo da biologia superfície da célula.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Construções disponíveis comercialmente FSL descrito neste artigo.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

A capacidade de modificar / visualizar superfícies biológicas, e depois estudar a célula modificada / virion em uma gama de in vitro e in vivo ambientes é essencial para ganhar mais conhecimentos sobre a função de moléculas específicas ou a entidade inteira. Estudos de modificação da superfície biológicos são geralmente limitados a engenharia genética do organismo ou a ligação covalente de metades químicos para a superfície da célula 1,2. No entanto, estas técnicas tradicionais expor a célula de reagentes químicos, ou que exigem manipulação significativa para alcançar o resultado desejado, tornando-pesado, e eles também podem inadvertidamente afetar a viabilidade / funcionalidade da célula modificada. Um método simples para harmlessly modificar a superfície de células é necessário. Recentemente uma nova tecnologia, Tecnologia Kode lançou uma série de construções de novas constituído por três componentes: um grupo cabeça funcional (F), um espaçador (S) e uma cauda de lipídios (L) e são conhecidos como Função-Espaçador Lipid ou FSL constructs3. O espaçador (S) é selecionada para fornecer uma construção que é dispersível em água, ainda assim de forma espontânea e estável incorporar em uma membrana. FSL construir metades funcional (F) até agora incluem uma gama de sacarídeos incluindo grupo sanguíneo relacionados determinantes, ácidos siálicos, polissacarídeos de ácido hialurônico, fluoróforos, biotina, radiolabels, e uma variedade de peptídeos 3-12. FSL construções têm sido usados ​​em embriões modificando, espermatozóides, peixe-zebra, células epiteliais / endometrial, as células vermelhas do sangue, e virions para criar sistemas de controles de qualidade e painéis de diagnóstico, para modificar a adesão celular / interação / separação / imobilização, e para in vitro e in vivo de imagens de células / virions 3-12. O processo de modificar células / virions é genérica e extremamente simples. O procedimento mais comum é a incubação de células (em lipídios mídia livre) com uma solução para FSL constrói por 1-2 horas a 37 ° C 4-10. Durante a incubação, a FSL constrói espontaneamente incorporar na membrana, eo processo está completo. Lavagem é opcional. Células modificadas por construções de FSL são conhecidos como kodecytes 6-9, enquanto virions são kodevirions 10. FSL constrói como infusões diretos e kodecytes / kodevirions têm sido utilizados em modelos animais experimentais 7,8,10. Todos os kodecytes / kodevirions parecem manter a sua vitalidade normal e funcionalidade ao ganhar a nova função da fracção F 7,8,10,11. A combinação de dispersão em meios biocompatíveis, incorporação espontânea em membranas celulares, e baixa toxicidade aparente, faz FSL construções valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo de células e virions.

Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.

FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

fsl-constructs-simple-method-for-modifying-cellvirion-surfaces-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K visualizações.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.

Vídeo: FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biologia

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Um método HPLC Lectin enriquecer Peptídeos seletivamente glicosilada de Complexo Amostras Biológicas

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering Construções recombinação homóloga em<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.