Este protocolo descreve um método de revestimento para restringir o crescimento de células endoteliais a uma região específica de uma placa de 6 poços para aplicação de estresse pura usando o modelo de agitador orbital. Uma maneira comum de estudar os efeitos do fluxo no endotélio é cultivar células endoteliais em placas de cultura multi-bem em um agitador orbital. O agitador orbital induz uma onda que gira ao redor do poço.
As células no centro do poço experimentam o tipo de fluxos que se pensa levar à aterosclerose. Células mais próximas do fluxo de experiência de borda que é considerado protetor. As propriedades das células de cada região dependem das tensões que experimentam.
No entanto, há um piso potencial nessa lógica. Células endoteliais liberam mediadores de forma dependente do fluxo. Esses mediadores alcançarão uma concentração uniforme no meio giratório e, portanto, afetarão as células em regiões diferentes daquelas em que foram liberadas.
Isso pode corromper ou esconder verdadeiros efeitos da tesoura no comportamento celular. O efeito não se limita ao sistema de poços rodopiantes. Pode ocorrer mesmo em modelos simples, como a câmara de fluxo de placas paralelas.
Pode ser evitado por células em crescimento em apenas uma parte do sistema. Aqui, descrevemos métodos para permitir a adesão celular apenas no centro ou apenas na borda do poço de redemoinho. Fabricação de módulo de aço inoxidável.
Fabricar o módulo de aço inoxidável a partir de um aço inoxidável grau 316 de acordo com um desenho de engenharia fornecido. Impressão 3D em PDMs. Prepare um modelo CAD 3D de molde de PDMs usando SOLIDWORKS de acordo com o desenho de engenharia fornecido.
Exporte o modelo CAD para um arquivo STL e importe o arquivo STL em Cura 2.6.2. Corte o modelo em camadas com uma velocidade de impressão de 50 milímetros por segundo e densidade de enchimento de 60% Exporte o arquivo como um GCode. Enviei para uma impressora 3D Ultimaker para impressão.
Use ácido polilático como material de impressão. Fundição de anel PDMS. Misture bem a base PDMS e o agente de cura com a razão de 90,9% de base e 9,1% de agente de cura.
Despeje a solução bem misturada no molde impresso em 3D. Remova bolhas em uma câmara de desgaseamento a vácuo. Cure-o por uma hora em um forno de 80 graus.
Deixe o anel PDMS esfriar à temperatura ambiente. Em seguida, remova o anel PDMS curado cuidadosamente do molde. Preparação de 1%Pluronic F-127.
Pese cinco gramas de Pluronic F-127. Despeje em uma garrafa de vidro. Em seguida, adicione cem milhões de água Milli-Q na garrafa de vidro.
Isso dá uma solução F-127 Pluronic de 5%. Certifique-se de que todo o pó Plurônico F-127 está submerso na água. Feche a tampa e autoclave-a usando um programa de ciclo de esterilização líquida.
Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente antes de usar. Adicione 10 mil de solução F-127 plurônica de 5%plurônicos a 40 mil de água Milli-Q autoclavada para fazer 1%pluronic f-127 solução. Realize a diluição em um capô de armário de biossegurança.
Armazene 1% e 5% Pluronic F-127 à temperatura ambiente. Revestimento de placa de 6 poços. Módulo de aço inoxidável autoclave, anel PDMS e pinças antes de usar.
Realize todos os procedimentos subsequentes em um capô BSC e observe técnicas assépticas para garantir a esterilidade. Coloque o anel PDMS em uma pinça de 6 poços. Use a borda externa do anel PDMS para alinhar o anel PDMS concentricamente dentro do poço.
Note que apenas placas de poços não tratadas com cultura de tecido devem ser usadas. Coloque o módulo de aço inoxidável em cima do anel PDMS usando pinças. Insira as pontas do alicate interno de retenção nos porões do anel de retenção.
Aperte o suporte para reduzir o diâmetro do anel de retenção. Coloque-o no 6-well, pressione-o firmemente sobre o módulo de aço inoxidável, e solte o alicate para fixar o anel PDMS no poço. Adicione um mil de cinco microgramas por fibronectina microliter no centro ou na borda do poço, dependendo da região de interesse, através da abertura do anel PDMS e do módulo de aço inoxidável.
Gire a placa para garantir que a solução de fibronectina cubra toda a região de interesse. Incubar por 30 minutos a 37 graus em uma incubadora umidificada sob 95% de ar e 5%de CO2. Remova a solução de fibronectina do poço.
E agora lave duas vezes com PBS. Uma vez feito, remova completamente o PBS do poço. Remova o anel de retenção, o módulo de aço inoxidável e o anel PDMS do poço.
Adicione 1,5 mil de 1%Pluronic F-127 no poço e incubar por uma hora em temperatura ambiente para passar pela superfície não revestida. Remova a solução Pluronic F-127 do poço e lave três vezes com PBS. Uma vez lavado, use o bem revestido imediatamente ou armazene a quatro graus por até duas semanas com a camada de PBS no poço revestido.
Semeadura de células endoteliais. Conte células usando um hemótmetro e sementes 180.000 células em uma placa revestida de 6 poços em 1,5 mil de meio de cultura celular pré-quente. Agite a placa do poço lateralmente para garantir que as células distribuam uniformemente no poço.
Deixe-o em uma incubadora umidificada de 37 graus sob 95% de ar e 5% de CO2 durante a noite. Aplicação de estresse de tesoura usando um agitador orbital. As células devem atingir confluência após três dias de crescimento.
Substitua o meio por 1,9 mil de meio de cultura celular pré-aviso para atingir uma altura de dois milímetros. Coloque uma placa de poço na plataforma de um agitador orbital em uma incubadora umidificada e gire-a a 150 RPM por três dias. Opcional, após dois dias de cisalhamento, citocinas podem ser adicionadas ao meio de cultura celular para investigar a interação entre citocinas e estresse absoluto.
Após o tratamento, tesoura as células por mais um dia. Neste estudo, o TNF-alfa foi utilizado para ativar as células. Realize a análise após três dias de aplicação de estresse de tesoura.
Imagens de microscópio mostram que o Pluronic F-127 impediu a adesão do HUVEC à região sem revestimento de fibronectina. Nenhum HUVEC foi anexado à parte da superfície do poço que não havia sido pré-tratada com fibronectina antes da passivação do Pluronic F-127 após 24 horas, na figura A, e 72 horas, na figura C, de crescimento. Sem a passivação Pluronic F-127, os HUVECs foram anexados à superfície sem fibronectina, 24 horas após a semeadura, na figura B, e são proliferados ainda mais em 72 horas, na figura D.A barra de escala é igual a 500 micrômetros.
A mancha vermelha nuclear mostra a morfologia dos HUVECs, A, no centro, e B, à beira de um poço cheio. A barra de escala é igual a cem micrômetros. A e B também mostram contornos celulares delineados pela imunostaining do ZO-1.
Observe o alinhamento e o alongamento das células na borda, mas não no centro. Não mostra diferença significativa no índice de forma nuclear, indicando arredondamento, entre huvecs cultivados em poços totalmente bem e segmentados foram vistos para HUVECs não tratados ou TNF-alfa. As células eram mais alongadas perto da borda do poço.
A tendência de maior alongamento nos HUVECs tratados com TNF-alfa não foi consistentemente significativa entre os locais. Não foi observada diferença significativa entre poços completos e segmentados em número de densidade de HUVECs A, não tratados e B, TNF-alfa em diferentes locais radiais. Em ambos os casos, havia mais células por unidade na borda do que no centro do poço.
Em conclusão, o método que delineamos aqui permite que você cresça células em apenas uma região do poço giratório ou, de fato, de qualquer sistema de cultura celular baseada em plástico. Isso significa que as células de uma parte do poço que experimentam um tipo de fluxo não são influenciadas por mediadores liberados de células em outra região que experimentam diferentes fluxos. Não só isso, podemos olhar para células cultivadas em uma região com ou sem que as células sejam cultivadas em outras regiões.
Isso permite que os efeitos de tais mediadores solúveis sejam demonstrados. Testar os efeitos do meio condicionado em células ingênuas permite a mesma coisa. Analisando as condições médias, os mediadores podem ser identificados.
