Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.

A. Síntese e Caracterização de Lipossomas de PDA 4,5,6 Nota 1: Proteger a solução da luz PDA usando embalagem de alumínio em cada recipiente ao longo de todas as etapas experimentais. Nota 2: Dois conjuntos diferentes de solução de lipossoma (B e C) foram preparadas seguinte procedimento A (Síntese e caracterização de lipossomas de PDA). 1. Síntese de N-hidroxi-succinimida Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Para preparar os lipossomas, um ingrediente essencial PCDA-NHS é necessária. Temos sintetizado PCDA-NHS usando seguinte procedimento: </li><li> Adicionar ácido 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hidroxissuccinimida (0,0914 g, 0,786 mmol) e 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (0,144 g, 0,713 mmol ) em CH 2 Cl 2 seco (20 ml). </li><li> Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Cuidadosamente remover o solvente usando rotary evaporador para se obter uma película fina seca. </li><li> Use funil de separação para extrair o resíduo com éter dietílico (25 ml) e água (25 ml) três vezes. </li><li> Seca-se a camada orgânica com MgSO4 (1,0 g) durante meia hora. Filtrar e remover o solvente por evaporação rotativa para se obter um pó branco sólido (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analise composto final sob Ressonância Magnética Nuclear (NMR). </li><li> 1 H RMN (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Preparação do lipossoma 5,6,7 <ol><li> Dissolver PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 em 20 ml de diclorometano. </li><li> Filtra-se a solução com papel de filtro para remover agregados. </li><li> Evapora-se o solvente completamente para se obter uma película fina de monómeros. </li><li> Seca-se a película fina a noite sob vacuum. </li><li> Filme o hidrato com água desionizada (50 ml) para fazer uma solução de lipossomas de concentração desejada (0,65-1 mM). </li><li> Sonicar a suspensão resultante com um sonicador de sonda a 76 ° C durante ~ 18 min. </li><li> Cuidadosamente passar a solução através de um filtro de papel para remover os agregados lipídicos </li><li> Arrefece-se a solução a 4 ° C durante a noite para promover a auto-montagem dos monómeros. A solução final deve ser opticamente transparente. </li><li> Polimerizar os monómeros de auto-montagem diacetileno (lipossomas) por irradiação com 254 nm de radiação UV para ~ 2 min utilizando uma fonte de UV Pen Ray (4,5 mW / cm 2) em ar. </li><li> A solução de lipossoma era estável à temperatura ambiente durante pelo menos duas semanas. A solução foi mais estável quando refrigerado. </li></ol> B. Preparação de Rodamina-tagged albumina sérica bovina (BSA-Rh) lipossomas modificados PCDA 1. A ligação de BSA-Rh para a superfície do lipossoma <ol><li> Dissolve-Rh BSA em PBS buffer (concentração iónica foi de 0,01 M, pH 7,2) para fazer uma concentração final de 1,2 uM de BSA Rodamina-solução. </li><li> Adicionar 2 ml (1,2 ^ M) de BSA-Rodamina a 10 ml de solução de lipossoma preparado no passo A.2. (Ver acima), à temperatura ambiente. </li><li> Reacção clássica para a ligação dos grupos amina do resíduo de lisina de proteínas ao ácido carboxílico activado por NHS grupo foi seguido (Esquema de reacção na Figura 2). NHS-PCDA foi concebido (Figura 2, passo 1) para a ligação covalente de moléculas de proteína com lipossomas utilizando NHS-amina reacções (Figura 2, Passo 2). NHS é um excelente agente de deixar que conduz a reacção de amina do ácido carboxílico na direcção para a frente. O rendimento desta reacção sob condições apropriadas deve ser quantitativa. </li><li> Remoção de livre BSA-Rh: Molhe um Spectra / Por Biotech éster de celulose membrana (CE) (MW C O: 100.000) em w deionizadaater, durante 15 min. Esta membrana é utilizada para a diálise de BSA-Rodamina que não reagiu (peso molecular ~ 66000 Da), em água desionizada. </li><li> Transferir cuidadosamente a solução em que a membrana de diálise. </li><li> Troque a água em 2 horas, 8 horas, 14 horas, 24 horas e 36 horas durante a diálise. </li><li> Recolher a solução final num frasco coberto com folha de alumínio. </li></ol> C. Preparação de SR-diamina e marcado com biotina Lipossomas 1. Em vez de usar DMPC na etapa 2.1, iremos utilizar marcado com biotina-(1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (DOPE-biotina). <ol><li> Siga todos os passos através de 2,2-2,9. </li><li> Em vez de BSA-Rh na etapa B, utilize diamina Sulphorhodamine etiquetado (SR-diamina). </li><li> Siga todos os passos adicionais na B. </li><li> Os lipossomas nesta preparação contida biotina e SR-diamina nas suas superfícies. Os passos subsequentes são semelhantes a A e B (ver acima), com uma única excepção: foi adicionada estreptavidina à solutipara investigar interacções biotina-estreptavidina através de alterações na eficácia da FRET. </li></ol> D. Representante Resultados <img alt="Figura título" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figura título. Um desenho que explica o processo de reacção e de FRET ocorre na superfície do lipossoma (preparado seguindo o passo B). A. Monitorização da ligação da proteína de lipossomas utilizando uma FRET Monitorização da FRET entre Rodamina e lipossomas preparados de PDA no passo B. Os espectros de excitação e emissão de BSA-Rh e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 3A). Nós podemos ver claramente que o espectro de emissão do BSA-Rh coincide com o espectro de absorção de PDA. Isso satisfaz o requisito de ressonância para o mecanismo de FRET. BSA-Rodamina lipossomas marcados, antes e após a polimerização foram analisados ​​com UV-Vé e espectroscopia de fluorescência. Para o doador e aceitador isolada, a eficiência de TERF é altamente dependente da distância dador-aceitador (r) e J 1 (j-valor). A extinção da emissão é observada (Figura 3B) por causa da FRET entre rodamina e PDA, devido ao aparecimento de espectro de absorção electrónica de PDA azul após a fotopolimerização. No nosso caso, FRET eficiência é zero para os lipossomas não polimerizados e rodamina porque J = 0 para lipossomas não polimerizada na região visível. Foram realizadas experiências semelhantes com apenas lipossomas PDA que não continham NHS na sua superfície. Nestes casos, a BSA-Rh não foi marcado na superfície dos lipossomas. Nesse caso, a distância média entre a rodamina e PDA (r médio) era muito maior do que o raio de Forster (R 0 = 2,8 nm). Assim, não observamos uma grande diminuição na intensidade de fluorescência. Esta observação de umalso sugere que a extinção de fluorescência é dominante quando R &lt;2,8 nm. J e R 0 Os valores foram calculados usando as fórmulas seguintes: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6 O coeficiente de extinção (ε) de azul-PDA está no intervalo de 2000-10000 ~ M -1 cm -1 antes da adição de estreptavidina. O coeficiente de extinção de azul-PDA está dependente da condição foto-polimerização. [2] Por exemplo, os valores de £ será maior para uma solução que foi polimerizado um tempo mais longo. Além disso, a auto-montagem dos monômeros diacetileno também pode afetar os valores de £. O calcul Jções levar em conta essas alterações, e refletem mudanças nos coeficientes de extinção PDA devido a biotina-estreptavidina interações moleculares. valores de J são calculados usando absorção PDA experimental e SR-101 dados de emissão. As mudanças nos valores de J são devidas à mudança no espectro de absorção electrónica de PDA a seguir à adição de estreptavidina para a solução (Figura 4C). A unidade de valores de J é M -1 cm -1 nm 4. B. Controlo da FRET com adição de estreptavidina para a biotina marcada com solução de lipossomas Nota 1: Monitoramento das FRET entre Rodamina e lipossomas PDA preparados no passo C acima. Os espectros de excitação e emissão de Sulphorhodamine-tagged diamina (SR-diamina) e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 4A). Não polimerizados e polimerizados biotina lipossomas marcados foram analisados ​​por meio de UV-Vise espectroscopia de fluorescência. A emissão da rodamina (SR-101) é diminuída em cerca de 45% após a polimerização (Figura 4B), sugerindo quenching emissão devido a FRET. Adicionar 40 ul de aliquotas (1 uM) de solução de estreptavidina a 2 ml de solução de lipossoma. Com a adição de estreptavidina para a solução, as variações no valor J é observado (Figura 4C). Como a biotina liga-se a estreptavidina, a intensidade do pico de azul PDA lipossoma (centrado em ~ 645 nm na Figura 1) foi diminuído, enquanto que um aumento do pico de absorção a 540 nm é observada (F igura 1 S). Figura 4D mostra a evolução do FRET eficiência. A eficiência de TERF diminuiu com o aumento da concentração de estreptavidina é também consistente com a nossa previsão. Gravar a emissão SR após cada adição aliquota de 40 ul de estreptavidina. Observou-se um aumento constante na emissão de rodamina, após a adição de streptavidina (Figura 5). Este aumento na emissão de rodamina é devido a uma diminuição do valor J para o espectro de emissão sulfo e espectro de absorvância PDA seguindo as interacções biotina-estreptavidina. Ao nível molecular, as interacções biotina-estreptavidina levar a alterações subtis no comprimento de conjugação eficaz do PDA, que resulta num decréscimo na forma azul-PDA a um termodinamicamente mais estável forma vermelho-PDA 2. Esta é a base das alterações nos valores de J. Interessantemente, as diferenças subtis nas interacções moleculares para covalentemente ou não covalentemente a biotina ligada a lipossomas PDA pode ser sondado com o nosso ensaio de detecção 4. Temos também realizados experimentos de controle e foram monitorizadas a emissão das amostras de controlo sob as mesmas condições experimentais como os de estreptavidina-biotina. As experiências de controlo consistir em: (1) a biotina soluções de lipossomas que continham no seusuperfície foram adicionados uma solução tampão de mesmo volume e concentração, e (2) solução de lipossomas, sem receptores de biotina na sua superfície de estreptavidina foram adicionados mesmo volume e concentração. A intensidade da solução de lipossoma marcado com biotina, após a adição de estreptavidina mostrou intensidade melhorado, mas a intensidade da solução de lipossoma das experiências de controlo (por exemplo, ver Figura 2 S), por outro lado, mostraram uma diminuição na intensidade de emissão. Isto é atribuído à diluição da solução. Essas experiências indicaram claramente que a emissão melhorada da solução foi devido a interacções específicas moleculares. Forster raio (R 0) para o par rodamina e PDA é calculada (Eq.2) ser ~ 2,80 nm. Isto significa que para isolados PDA-rodamina pares, 50% das moléculas de rodamina estado excitado terá a energia transferida para PDA quando r é 2,80 nm. Nós obs<html> erved que, quando a biotina é ligado covalentemente ao esqueleto de PDA, o aumento das emissões foi 2-3 vezes maior do que a de uma forma não covalente a biotina ligada a lipossomas. 4 Estes resultados sugerem fortemente que o sistema proposto é sensível para distinguir diferenças subtis nas interacções no transdutor (ligante entre biotina e bicamada de lipossomas), devido à covalentemente ou não covalentemente ligados receptores ligados a lipossomas. Dependendo das capacidades de digitalização e de aquisição de dados a monitorização de espectrofotómetro e em tempo real (em milisegundos a escala de tempo de segundo) de interacções de proteínas (na espectroscopia de UV-Vis), são possíveis com este sistema de detecção. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Figura Espectros de absorção 1. Dos azuis e vermelhos soluções PDA. (Inset) micrografias ópticas tirada com uma câmera digital. g &quot;/&gt; Figura 2. O esquema reaccional para a síntese PCDA-NHS (passo 1). Reacção do PCDA-NHS para o substituinte de amina de proteínas (passo 2). O passo 2 é a base da ligação do resíduo de lisina de proteínas para o ácido carboxílico da PCDA monómero. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img alt="A Figura 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> Figura 3A. Observada alteração na eficiência de TERF é devido às mudanças no espectro de absorção do PDA. Antes de polimerização, não há sobreposição entre BSA-Rh emissão e absorção de PDA, mas depois de sobreposições de polimerização PDA absorção com BSA-Rh emissão, que é a exigência de FRET. Rodamina é um doador (vermelho) e lipossomas polimerizados PDA actuar como um aceitador (azul). <img alt="A Figura 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figura3B. Espectros de fluorescência do BSA-Rh lipossomas marcados antes (azul) e depois PCDA polimerização (vermelho). Uma grande redução na emissão de rodamina foi observada devido a FRET entre rodamina e PDA. <img alt="A Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> Figura 4A.. Sobreposições espectrais (J) para a mudança de PDA espectro de absorção (azul ou vermelha) e espectro de emissão Sulphorhodamine (laranja) Figura 4A é o espectro representativo para a condição extrema, isto é, quando um excesso de estreptavidina foi adicionado à solução. A Figura 4A mostra uma transformação quase completa azul-a-vermelho PDA, após a adição de um excesso de estreptavidina. Vê-se claramente que J (sobreposição espectral) aumenta com o deslocamento de azul do espectro de absorção no PDA <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> Figura 4B. Espectros de fluorescência antes (azul) e após (red) polimerização de lipossomas. <img alt="A Figura 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Figura 4C Condição para FRET: J. Mudança entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas. <img alt="Figura 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figura 4D. FRET variação da eficiência de entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figura 5. Rodamina espectro de emissão após a adição de alíquotas da solução de estreptavidina a PDA lipossoma. Inserção mostra uma visão ampliada de mudanças de emissão no espectro SR-101.

<ol>
	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) </td><td> GFS produtos químicos </td><td> 3261 </td><td> Sensível à luz </td></tr><tr><td> N-hidroxi-succinimida (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensíveis à umidade </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) </td><td> Chem-impex Internacional </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-tagged Ser Bovinehum Albumina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K visualizações.  Southern Illinois University. Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopia para Monitoramento em Tempo Real de eventos de sinalização em células vivas utilizando biossensores unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imagens em tempo real de plantas Dynamics da superfície celular com variável de ângulo epifluorescência Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoramento em tempo real da aurora quinase Uma ativação usando biosensores de FRET conformacional em células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...