Este trabalho é patrocinado pelo Instituto Lupus Research (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 e NIH UL1-TR00165. Agradecemos ao Dr. Robert P. Kimberly por seu apoio contínuo.

Todos os doadores recrutados para este estudo deu consentimento informado escrito eo estudo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Review Board. 1. HUVEC Cultura Inicial e Subcultura <ol><li> Cultura das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) in vitro em meio de crescimento completo, que é composta de meio basal de células endoteliais (ver Lista de Materiais) suplementado com factores de crescimento de células endoteliais. Nota: Os factores de crescimento utilizados neste estudo incluem: 5 ng / ml de recombinante humano do Factor de Crescimento Epidérmico (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina e 50 ng / mL de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng / mL de Factor de Crescimento de Fibroblastos-básico com heparina (hFGF-B), 20 ng / ml de factor humano recombinante humana Insulin-like Growth ( R3-IGF-1), 1 ug / ml de ácido ascórbico, e 22,5 ug / ml de heparina. O meio completoé preparado inicialmente a 37 ° C e, em seguida, pode ser armazenado a 4 ° C para utilização no prazo de um mês de preparação. </li><li> Para preparar um frasco de células, meio de crescimento completo é adicionada a um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros 2 (1 ml / 5 cm 2) e, em seguida, o balão é deixado a equilibrar a 37 ° C / 5% de CO 2, num incubador humidificado durante , pelo menos, 30 min. HUVEC humana serão semeadas directamente neste frasco de cultura equilibrado a uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. </li><li> Enquanto a mídia está equilibrando, descongelar rapidamente o estoque cryovial HUVEC em banho-maria 37 ° C. Dispersar as células no frasco de armazenamento original por vórtex e, em seguida, adicioná-los directamente para o frasco de cultura contendo o meio de crescimento completo HUVEC pré-equilibrada para atingir uma densidade de 2,500-5,000 células / cm 2. Agite suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células e, em seguida, devolver o frasco para a incubadora. Estas células representam agora a passagem 1 º. </li> &lt;li&gt; Médio deve ser trocado a cada dois dias até que as células são de 70-80% confluentes. </li><li> O HUVECs pode agora ser colhidas a partir do balão de cultura com tripsina / EDTA. O meio de cultura foi aspirado a partir dos frascos de cultura, seguido por uma lavagem com PBS, para remover qualquer proteína residual e de cálcio das células. Uma solução de Tripsina-EDTA a 0,25% é adicionado e dentro de 2-6 min desprendimento de células deve ser evidente, tal como avaliado através de microscopia de luz. </li><li> Quando 90% das células são arredondadas para fora da placa, parar a tripsinização adicionando um volume igual de 2x inibidor de tripsina. Para facilitar a colheita de células, adicionar uma outra quantidade igual de meio de crescimento completo. Transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril. </li><li> Centrifugar as células isoladas a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em 2-3 ml de meio de crescimento completo. Determinar a concentração de células e viabilidade utilizando um hemocitômetro e azul de tripano. </li><li> Para utilizar ªe células para estudo, re-semente adicional 75 centímetros 2 frascos com células a uma densidade de 10.000 células / cm 2 colhidas e vá para o passo 2.2. Alternativamente, as células podem ser congeladas neste ponto para estudos futuros. Para congelamento celular, sedimentar as células por centrifugação a 225 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em FBS contendo DMSO a 10% a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml. A suspensão de células é então transferido para criotubos e armazenou-se a -80 ° C após o congelamento das células em um recipiente de congelamento celular. </li></ol> 2. Preparação HUVEC Camada <ol><li> Uso de congelados HUVECs passagem 2 ª: renascimento e da cultura. Se o uso de células em crescimento activo, siga para o passo 2.2. <ol><li> Descongele o cryovial contendo 2 ª HUVECs passagem do passo 1.8 rapidamente em banho-maria 37 ° C. Células Transferência do cryovial para um tubo de centrífuga de 15 ml estéril e adicionar 10 ml de crescimento medium. </li><li> Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante para remover o DMSO residual. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com meio de crescimento completo e transferência das células para um frasco de 75 cm 2. Adicionar meio de crescimento para um volume total de cerca de 20-25 ml e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Examine visualmente a cultura de células em confluência cada dia com as mudanças de mídia a cada dois dias. Normalmente dentro de 2-4 dias, as células atingem 80-90% de confluência, altura em que estará pronto para a utilização no ensaio de câmara de fluxo. </li><li> Para preparar o prato de cultura que vai ser utilizado na câmara de fluxo (ver secção 5), adicionar 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina e de 0,05% (w / v) de gelatina a de 35 mm de cultura de tecidos e louça pipeta várias vezes para fazer Certifique-se de toda a placa de superfície é revestida. Remover a solução de fibronectina e gelatina excessiva e secar a placa pelo menos durante 30 minutos para optimizar a formação de uma matriz de proteínas. O fsolução ibronectin e gelatina pode ser reutilizada até 10 vezes. </li><li> Colher as células HUVEC do passo 2.2 utilizando tripsina-EDTA como descrito nos passos de 1,5-1,7. Semente 500.000 células em cada tecido revestido cultura prato. Adicionar 2 ml de meio de crescimento em cada placa e incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Permitir que as células crescer até à confluência, como no passo 2.2. As células devem ser inspeccionados visualmente diariamente com alterações médias a cada dois dias. Antes do ensaio de câmara de fluxo, primo da HUVEC com 20 ng ml de TNF-α humana / de 4-6 horas para regular positivamente e estimular a expressão da adesão molecular. </li></ol> 3. Purificada Ligand Coating <ol><li> Desenhar um círculo de 0,5 cm de diâmetro com um marcador ou uma caneta no centro de 35 mm de cultura de tecidos prato. </li><li> Placa 20 ul de 20 ug / ml de proteína A na área marcada. Use a ponta da pipeta para espalhar a proteína A solução para cobrir toda a área dentro do círculo 0,5 centímetros de diâmetro. É importante não tocar ou arranhar a superfície do dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar as proteína-A revestidos 3x placa com 1 ml de PBS (pH 8,0). </li><li> Placa 50 ul 1% de BSA na área demarcada para bloquear a ligação não-específica na placa. Incubar durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar as 3x placa bloqueados com 1 ml de PBS, como no passo 3.3. </li><li> Preparar as soluções de proteínas quiméricas do ligando do receptor de Fc-aderência para revestimento. Nesta experiência, uma solução de ICAM-1/Fc quimera, a 25 ug / ml e uma quimera P-Selectin/Fc a 0,5 ug / ml em PBS (pH 8,0) foi usado. </li><li> Revestir a área marcada com 50 ul de substrato. Incubar durante a noite a 4 ° C. O prato deve ser usada dentro de dois dias e a área de revestimento não devem ser deixadas a secar fora. Adicionar PBS, se necessário, para manter a solução de 50 mL na placa. </li></ol> 4. Separação de neutrófilos (Todos os passos realizados na temperatura ambiente) <ol><li> Após a obtenção do consentimento informado, coleta de sangue por flebotomia participante em umn anticoagulante tubo de coleta de sangue ou vacutainer (EDTA ou heparina). Após a coleta de sangue, diluir a 1:01 sangue com PBS antes da separação. </li><li> Prepare uma de duas camadas Ficoll para separar PBMC e neutrófilos em 50 ml tubos de centrífuga. Primeiro adicione 15 ml de Ficoll pesado (veja Lista de Materiais, ρ = 1,118-1,120), e depois com cuidado a camada 10 ml luz Ficoll (ver Lista de Materiais, ρ = 1,077-1,080) em cima do pesado Ficoll. Deve haver uma fronteira nítida entre o Ficoll luz e camadas de Ficoll pesados. Finalmente, a camada cuidadosamente 25 ml da amostra de sangue diluído no topo do Ficoll luz sem perturbar a camada de Ficoll. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 250 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Nota: O freio de rotor da centrifugadora deve ser desligado para estas rotações para minimizar potencial ruptura da separação de células durante a desaceleração do rotor, no final da centrifugação. Após a centrifugação, as seguintes camadas (de cima para baixo) estão presentes: a camada superior é o seguin plasmawed pela camada de PBMC no topo da camada de Ficoll luz, a camada de neutrófilos com poucas células vermelhas do sangue (RBC) é entre a luz e Ficoll pesada seguido pela camada de Ficoll e pesado GVs na parte inferior do tubo. </li><li> Colheita e transferir a camada de neutrófilos para um novo tubo de 50 ml com uma pipeta de transferência, adicionar PBS a um volume final de 50 ml e centrifugar a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. <ol><li> Após centrifugação, ainda pode haver GVs misturados com os neutrófilos. Aspirar o sobrenadante até à marca de 10 ml. Ressuspender o sedimento de neutrófilos-RBC por agitação suave do tubo (ou um breve vórtice a baixa velocidade) e, em seguida, lavar novamente com 50 ml de PBS. </li></ol></li><li> Após a segunda lavagem, aspirar o sobrenadante. Para remover os glóbulos vermelhos contaminantes, ressuspender as células peletizadas em PBS residual por meio de agitação (ou curto vórtice), adicionar 25 mL de H2O e suavemente vórtice durante 10 segundos para lisar os glóbulos vermelhos. <ol><li> Adicionar 25 ml de NaCl 1,8% e misture imediatamentepor centrifugação a 225 xg durante 10 min à temperatura ambiente. O RBC contaminando agora devem ser lisadas deixando um neutrófilos pellet de células brancas. </li></ol></li><li> Lava-se a pelete de células de neutrófilos com PBS. </li><li> Ressuspender as neutrófilos isolados em meio RPMI com 10% de FBS e determinar a concentração de células em microscópio de luz com um hemocitómetro. </li><li> Ajustar a densidade de células a 500.000 células / ml com meio RPMI completo, 10% de FBS. </li></ol> 5. Fluxo Secção Ensaio de Adesão <ol><li> Monte a câmara de fluxo. Coloque o prato de 35 mm contendo as HUVEC confluentes ou ligandos de receptores de adesão purificadas sobre a mesa de microscópio. Ligue a câmara de fluxo de placas paralelas com bomba de seringa, sistema de vácuo e deixar uma linha aberta para a entrada de neutrófilos. Inserir a câmara de fluxo no topo da placa e fixar o conjunto da câmara de escoamento 13. (Ver Figura 1) </li><li> Inicie o programa de gravação de vídeo no computador conectado to microscópio. Ajustar o campo e foco do microscópio até um campo claro com células HUVEC totalmente crescidas ou um domínio dentro da região de revestimento ligante é visível. </li><li> Usando a bomba de seringa, lave a câmara de fluxo com meio RPMI. Certifique-se de que não há bolhas de ar no interior da câmara ou a linha de entrada de neutrófilos. </li><li> Se desejado, os neutrófilos podem ser preparadas com uma dose baixa (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Isto vai permitir uma correspondência entre o nível basal de activação dos neutrófilos entre diferentes doadores 14. </li><li> Utilizar a bomba de seringa para injectar os neutrófilos para a câmara de fluxo a uma velocidade definida (uma velocidade de 350 mL / min, o que equivale a uma tensão de corte de 1,5 dines / cm 2 é utilizada neste estudo). Grave o vídeo. Porque a adesão de neutrófilos pode ocorrer rapidamente, um vídeo com uma duração de 4-5 minutos é geralmente suficiente para quantificar os eventos de adesão para análise. </li><li> Uma célula aderente é definida como uma célula que se move menos do que um diâmetro da céluladentro de 5 seg em HUVEC ou ligando de superfície revestida 15,16. Contar o número total de células aderentes no campo presente no vídeo gravado utilizando esta regra. Ao gravar vídeos de comprimento semelhantes com neutrófilos de doadores diferentes, pode-se calcular o aderente células / min para comparar as propriedades de adesão entre os diferentes doadores. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo orienta a separação e isolamento de neutrófilos ativados minimamente para a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos sob condições de estresse pura. Adesão de neutrófilos é um processo crítico em inflamação. Porque variantes genéticas em várias moléculas neste processo têm sido demonstrados para predispor ao desenvolvimento de doença auto-imune 1,2, um sistema de ensaio capaz de avaliar quantitativamente humano firme adesão de neutrófilos é necessária. O método descrito neste protocolo permite a determinação cuidadosa e quantitativa do potencial adesiva firme de neutrófilos num ambiente controlado in vitro sob tensão de cisalhamento. Este método permite, assim, a comparação direta de adesão de neutrófilos quantitativa entre indivíduos genotipados para determinar a importância da variação genética em moléculas de adesão 14. Diversas etapas deste método merecem consideração cuidadosa para alcane resultados altamente reprodutíveis e quantitativos. Na preparação de HUVEC, que é fundamental para atingir 100% de confluência de células antes de utilizá-los na câmara de fluxo. Para utilizar as superfícies revestidas com ligando purificado, a área do revestimento de substrato nunca deve ser deixado secar ao evitar a desnaturação do ligando. Além disso, a preparação de neutrófilos humanos é crítico para o sucesso da experiência. As questões fundamentais em isolar os neutrófilos a partir de sangue incluem manipulação suavemente minimizando vórtex para evitar a activação, mantendo as células à temperatura ambiente (isto é, o sangue não deve ser armazenado em gelo e centrifugação passos devem ser realizados à temperatura ambiente) e completando o isolamento e a experiência no menor espaço de tempo possível. Há métodos adicionais de isolamento de neutrófilos que também podem ser utilizados para preparar as células para estes ensaios 17,18. A partir de uma perspectiva prática ensaios, de adesão utilizando neutrófilos humanos recém-isoladas<html> deve ser iniciada dentro de 3-6 horas após a participante flebotomia. Como os neutrófilos são extremamente sensíveis à manipulação, tempos prolongados entre a coleta de sangue e uso podem afetar os resultados do ensaio. Determinação cuidadosa da concentração de células de neutrófilos antes do ensaio de câmara de fluxo é também necessária para alcançar resultados precisos e reprodutíveis. Durante o ensaio de câmara de fluxo, é importante controlar a gravação de vídeo com cuidado para garantir que a velocidade de fluxo é constante e não há nenhuma turbulência durante toda a duração da experiência. As alterações nas velocidades de fluxo ou a presença de turbulência, seria necessário que o experimento ser repetido. Após a experiência, que também é importante para avaliar os neutrófilos restantes microscopicamente para assegurar que os neutrófilos não estão aglomerem. Aglomeração neste ponto que indicaria que os neutrófilos ativados se tornaram o que pode alterar significativamente a densidade de neutrófilos durante o experimento. conteúdo &quot;&gt; A câmara de fluxo cria uma tensão próximo homogénea pura dentro da câmara (τ = 6Qμ / (wh 2), onde Q = caudal, μ = viscosidade dinâmica, e w = largura da câmara de fluxo, h = altura da câmara de fluxo 15). Nos nossos estudos, utilizou-se uma taxa de fluxo de 350 mL / min para a adesão de neutrófilos, o que cria uma tensão de cisalhamento de 1,5 dines / cm 2 (w = 0,25 cm, h = 0,01 cm, a viscosidade da água a 37 ° C (0,007 poise) foi usado como uma aproximação da viscosidade dos meios RPMI). Para uma câmara de fluxo específico, pode-se alterar a taxa de fluxo para atingir diferentes níveis de tensão de cisalhamento para simular diferentes condições fisiológicas. shear stress fisiológico típica em vasos sanguíneos humanos pode varia entre 0,5-5,0 dyne / cm 13,16. Tensão de cisalhamento em outros vasos sanguíneos e outros animais foram listadas na Tabela 1 113,16,19 20. Enquanto o nosso método tem-se centrado no estudo da adesão de neutrophi humanols, este método não se limita aos neutrófilos e pode facilmente ser aplicado a estudos de adesão ou de rolamento de outros tipos de células, com modificações simples. Além disso, os substratos neste método pode ser modificado para fins diferentes. Embora este protocolo é facilmente adaptável a diferentes estudos, existem algumas limitações. O protocolo como implementado aqui requer grande número de células primárias para análise. Isso pode impedir a análise de células primárias de pequenos animais. Além disso, a necessidade de imobilizar ligandos de adesão purificadas numa conformação activa / disponíveis podem limitar a gama de ligantes. A utilização de proteínas de fusão Fc-aumenta grandemente as possibilidades de conseguir a conformação do ligando apropriado sobre a superfície da placa. No entanto, o nosso método não tem uma flexibilidade significativa para permitir a análise quantitativa de eventos de adesão. Estes estudos irão melhorar muito a nossa compreensão de pares receptor-ligante de adesão, bem como a importância da função potencial de variantes genéticasnestas proteínas, na patogénese de doenças humanas.

Variantes genéticas em ambos β 2 integrinas e em ligandos ICAM são reconhecidos agora a ser associada com o desenvolvimento de doença auto-imune 1,2. A determinação das consequências funcionais destas variantes em células derivadas de indivíduos com essas variantes é necessário para a nossa compreensão de como essas variantes contribuir para a patogênese da doença auto-imune. Tais estudos funcionais permitir a determinação dos mecanismos através dos quais ocorrem naturalmente, variantes genéticas moldam a resposta imune na saúde e na doença. No exemplo específico de LES, agora sabemos que as variantes em ITGAM (CD11b) e seu ligante, ICAM-1, associam fortemente com o desenvolvimento da doença 1,2. Porque neutrófilos são críticos em respostas inflamatórias, o estudo quantitativo de adesão de neutrófilos pode fornecer insights sobre como os mecanicistas variantes genéticas em ITGAM / ICAM alterar a inflamação. NeutropHil adesão firme às células endoteliais (CE) é um processo altamente regulado e desempenha um papel essencial na resposta inflamatória 3,4. A adesão firme dos neutrófilos segue rolando neutrófilos inicial e captura no CE e, finalmente, pode resultar em transmigração in vivo. Estes processos envolvem vários tipos diferentes de moléculas de adesão, incluindo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina em células endoteliais e β 2 integrinas na neutrófilos 5-9. Assim, a quantificação cuidadosa de adesão de neutrófilos de doadores com diferentes variantes alélicas de moléculas de adesão será importante para compreender as conseqüências funcionais e patológicas dessas variantes genéticas. O uso experimental de uma câmara de fluxo pode criar um ambiente in vitro, com a tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo de 10-12. De facto, um ensaio de câmara de fluxo acoplado com umbili humanocal de células endoteliais de veia (HUVEC) podem simular o ambiente in vivo de um vaso sanguíneo. Usando este método, é possível estudar as propriedades adesivas celulares globais em direção das células endoteliais. Além disso, o ambiente altamente controlado da câmara de fluxo, também permite a avaliação da ligação de células a ligandos de adesão purificadas, tais como ICAM-1 a fim de facilitar o estudo da interacção receptor-ligando específicas. Apresentamos aqui um método que utiliza um sistema de ensaio de adesão de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas de neutrófilos de sangue periférico humano a HUVEC e a substratos de ligandos purificados. Usando este método com células de doadores que expressam diferentes variantes da molécula de adesão alélicas nos permite avaliar como essas variações genéticas podem alterar humano adesão firme dos neutrófilos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Firme adesão de neutrófilos às células endoteliais desempenham um papel crítico na inflamação na saúde e na doença. O processo de adesão firme dos neutrófilos envolve muitas moléculas de adesão diferentes, incluindo membros da família integrina β 2 e respectivos contra-receptores da família ICAM. Recentemente, de ocorrência natural em ambas as variantes genéticas β 2 integrinas e ICAMs são relatados para ser associada com a doença auto-imune. Assim, a capacidade adesiva quantitativa de neutrófilos de indivíduos com diferentes formas alélicas destas moléculas de adesão é importante para estudar em relação aos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de auto-imunidade. Estudos de adesão dos sistemas de câmara de fluxo pode criar um ambiente com tensão de corte de fluido semelhante ao observado no meio de vasos sanguíneos in vivo. Aqui, apresentamos um método que utiliza um sistema de ensaio de câmara de fluxo para estudar as propriedades adesivas quantitativas de neutrófilos no sangue periférico humanos de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e substratos de ligandos purificados. Com este método, as capacidades adesivas de neutrófilos a partir de doadores com diferentes variantes alélicas de receptores de adesão pode ser avaliada e comparada. Este método também pode ser modificado para avaliar a adesão de outros tipos de células primárias ou linhas celulares.

Exemplos de ligação de neutrófilos para um ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) câmara de fluxo revestida (Figura 2) ou de ligação a um ensaio de câmara de fluxo revestida HUVEC (Figura 3) neutrófilos são mostrados. Como mostrado nas figuras, os neutrófilos continuam a acumular / aderir à superfície revestida ou HUVEC sob condições de fluxo contínuo. Nas nossas condições típicas da experiência, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente aderem à superfície revestida ou HUVEC durante um período de gravação de quatro minutos. No entanto, variantes alélicas das moléculas de adesão de neutrófilos, ou variantes alélicas do substrato (ligando purificado ou HUVEC), poderia alterar substancialmente a adesão de neutrófilos quantitativa 14. Também se avaliou a dependência do tempo de acontecimentos de adesão de neutrófilos observado nos nossos estudos. Enquanto que mantêm as condições de fluxo constante, é possível que as propriedades adesivas das células mudam ao longo do tempo. However, ao longo dos cursos de tempo relativamente curtos em nossos estudos, não observamos diferenças consistentes na taxa de adesão ao longo do tempo. Por exemplo, avaliar a adesão nos pontos de tempo 1-2 minutos em relação a aderência observada entre os 3-4 pontos no tempo mínimo não são consistentemente diferente. É claro que, se as células estão a ser estimulado durante a experiência de adesão, em seguida, as alterações nas propriedades adesivas ao longo do tempo poderia ser esperado. Nos nossos estudos, controlado por isolamento da activação dos neutrófilos induzida por intencionalmente priming as células com baixa dose de fMLP (10 -8 M) durante 10 minutos antes do estudo. As células endoteliais (HUVEC em nossos estudos) também necessitam de ativação antes de upregulate molécula de adesão expressão para melhor adesão firme dos leucócitos. Na ausência de pré-tratamento, as células endoteliais (HUVECs) vai apoiar muito pouca aderência de neutrófilos. Nos nossos estudos, utilizou-se 10 ng / ml de TNF para o tratamento de 4-6 horas antes de utilizar. IL-1β (10 ng / ml) e<html> LPS (0,5-1 ug / ml) também pode ser utilizado para pré-activar as células endoteliais. Importante, as HUVEC não tratada pode ser utilizada como controlo negativo para assegurar que a adesão das células é causada por específico interacções celulares de neutrófilos-endotelial (mediada por receptores). Alternativamente, os anticorpos anti-receptor podem ser utilizados para bloquear os receptores específicos para avaliar a especificidade de adesão. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Configuração câmara Figura 1. Fluxo no palco microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2 tiros de tela de um vídeo de amostra de neutrófilos que aderem a ICAM-1/P-Selectin superfície revestida em momentos diferentes (A:. 0 ponto de tempo, B: 1 ponto min tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: intervalo de 4 min). A concentração de ICAM-1 é de 25 ug / ml e P-selectina é de 0,5 ug / ml. Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / min com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Tiros Figura 3 Tela de uma amostra de vídeo de neutrófilos que aderem à superfície de HUVEC revestidos em diferentes pontos de tempo (A: 0 ponto de tempo, B: 1 min de ponto de tempo, C: 2 min ponto do tempo, e D: Ponto de tempo de 4 min)..Velocidade do fluxo de neutrófilos é de 350 ul / ml, com a densidade de neutrófilos em 500.000 células / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Espécies </td><td > Localização </td><td > Tensão de cisalhamento (dinas / cm 2) </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 11,6 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria branquial </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supra-renal </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Aorta supracelíaco </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Artéria fermoral Superficial </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Vênulas </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primeiros arteríolas </td><td> 40,2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo arteríolas da retina </td><td> 0,001 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Retina primeiros vênulas </td><td> 23,2 </td></tr><tr ><td> Humano </td><td> Segundo vênulas da retina </td><td> 0,43 </td></tr><tr ><td> Cão </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 15,8 </td></tr><tr ><td> Coelho </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 23,3 </td></tr><tr ><td> Rato </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 46,6 </td></tr><tr ><td> Mouse </td><td> Artéria caroid comum </td><td> 64,8 </td></tr><tr ><td> Cão </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 9,8 </td></tr><tr ><td> Coelho </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Rato </td><td> Artéria femoral comum </td><td> 65,9 </td></tr></tbody></table> Amostra estresse Tabela 1. Cisalhamento em diferentes órgãos e espécies diferentes. * Sintetizada a partir de referências 13, 16, 19 e 20.

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Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K visualizações.  University of Alabama at Birmingham.  Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento. 

Vídeo: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...