Este estudo foi apoiado por uma equipe CIHR concessão CTP # 82946, um CIHR concessão # 102741 MOP, bem como uma cadeira Canadá # 216684 e uma Fundação Strauss. ER foi apoiado por uma bolsa de estudos do canadense do coração &amp; Stroke Foundation.

Oclusão da artéria cerebral transitória Médio (OACM) 1. Procedimento cirurgia (Figura 1) A oclusão da artéria cerebral média transiente (tMCAO) é realizado em 2 - a 3 meses de idade macho C57BL / 6 (22-28g). Este protocolo foi aprovado pelo IRCM cuidados com os animais bioética comitê. Instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min.) Entre cada animal, foram esterilizadas utilizando o esterilizador quente talão (15 seg.) Mesa de cirurgia e outros equipamentos são higienizadas utilizando etanol a 70%. Duas horas antes da cirurgia, os ratos foram analgesized com buprenorfina (0,03 bwip mg / kg). Figura 1A. <ol><li> Profundamente anestesiar ratos com 5% de isoflurano e depois manter a anestesia isoflurano em 2,5%. A temperatura corporal dos ratos é mantida constante durante a cirurgia, com uma almofada de aquecimento. </li><li> Desinfectar a pele e skem etanol com 70% ou Betadine. Desde barbear para liberação cabelo fragmento, microabrasions e inflamação que pode ter impacto na fisiopatologia curso, nós não raspar pele do rato. </li><li> Faça uma incisão na linha média do pescoço e puxe para além dos tecidos moles. </li><li> Sob um microscópio estéreo (Stemi 2000, Zeiss), uma dissecção romba é realizada para expor a traqueia e retrair os músculos para localizar a artéria carótida. </li><li> A artéria carótida comum esquerda (CCA) é cuidadosamente dissecada do tecido circundante e o CCA está temporariamente obstruído por uma sutura temporária (1), usando sutura de seda 5-0 cortada em segmentos de 20 mm. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago. </li><li> Separe a bifurcação da artéria comum esquerda carótida interna (ACI) e artéria carótida externa comum (ECA). Uma sutura permanente (2) é colocada em torno da ECA, como distalmente quanto possível, e um outro fio de sutura temporária ligeiramente apertado (3) é colocado sobre o ECA distal aobifurcação. </li><li> Clipe da ACI esquerda (4) com uma pinça reversa de ação para evitar a hemorragia. Grande cuidado deve ser exercido para não prejudicar o nervo vago. </li><li> Corte um pequeno buraco ECA (5) entre permanentes (2) e temporária (3) suturas. </li></ol> Figura 1B. <ol start="9"><li> Introduzir um 12 mm de comprimento 6-0 silício revestido (cerca de 9 a 10 mm é de silício revestido) de sutura de monofilamento (Doccol Corporation) para a ECA (6), completamente cortado da ECA distal à sutura permanente e inverter a prótese na ICA . A sutura é rigidamente ligada em torno do monofilamento para prevenir hemorragias e as pinças de acção inversa são removidas. </li><li> O oclusor é introduzido para ocluir a origem da MCA no círculo de Willis. Pare de sua inserção em torno de 9-10 mm além da bifurcação do ECA e CCA. A prótese é bloqueado e não pode mais mover-se. Deve ser tomado cuidado para não penetrar na artéria pterigopalatina. A sutura (3) sobre o ECA é tightly amarrado para fixar o monofilamento em posição. </li><li> Fechar a pele com um sistema de fecho Autoclip ferida. </li><li> Injectar 1 mL de solução salina subcutaneamente e coloque ratos sob uma lâmpada de aquecimento de infravermelhos durante todo o período pós-oclusão (60 min). </li></ol> 2. Restauração do fluxo sanguíneo da artéria cerebral média Antes reanesthesia, o neuroscore pode ser verificado para avaliar o sucesso da cirurgia. <ol><li> Anestesiar os ratos, tal como anteriormente descrito e retire os autoclips. </li><li> Abra ligeiramente a sutura (3) sobre o ECA para permitir a retirada monofilamentos e reperfusão sangue. </li><li> Permanentemente amarrar a sutura temporária no ECA para evitar a perda de sangue. O monofilamento é mantido para reutilização. </li><li> Remover a sutura temporária (1) sobre o CCA para permitir a recirculação de sangue. </li><li> Fechar a ferida. Os ratos devem receber um outro 1 ml de solução salina por via subcutânea. </li><li> Colocar os ratos sob a lâmpada de aquecimento infravermelha para 1 hr. Depois de verificar que o animal recupere a mobilidade, o rato é devolvido à sua gaiola e deixadas sob a almofada de aquecimento e toalhas para 72 h. Note-se que apenas a metade da gaiola é colocada sobre a almofada de aquecimento para permitir que os ratos para escolher o seu ambiente. Porque pós-cirúrgica a perda de peso é geralmente observado, alimentos puré é colocado numa placa de Petri, para encorajar a comer. Doze horas após a cirurgia, os ratos receberam uma segunda dose de buprenorfina (0,03 bwip mg / kg). </li></ol> 3. Operação Sham Para as operações de simulação, todos os procedimentos são idênticos, excepto que a prótese não está inserido. 4. Neuroscore Défices neurológicos permitir a avaliação do sucesso de tMCAO apenas após a reperfusão e mais tarde a estimativa do grau de severidade da lesão. Défices neurológicos são pontuados como previamente descrito 5 &lt;/ Sup&gt; e realizada a 1, 24, 48 e 72 horas pós-reperfusão. Uma escala de seis pontos expandida é utilizada: <ul><li> 0: normal. </li><li> 1: ligeira circulando comportamento com ou sem rotação inconsistente quando apanhado pela cauda, ​​&lt;50% de tentativas para girar para o lado contralateral. </li><li> 2: leve consistente circulando,&gt; 50% de tentativas para girar para o lado contralateral. </li><li> 3: consistente forte e imediata circulando, o mouse tem uma posição de rotação por mais de 1-2 segundos, com o nariz quase atingindo sua cauda. </li><li> 4: rotação grave progredindo em embarricamento, perda de andar ou dos reflexos. </li><li> 5: coma ou moribundos. </li></ul> 5. Coloração com violeta de cresilo (Figura 2) Seguindo PBS solução de perfusão, os cérebros são rapidamente congelados em isopentano e armazenados a -80 °C. cérebros de rato pode ser também submetido a perfusão com paraformaldeído a 4% (PFA) em função dos estudos imunohistoquímicos planeadas. Criostáticas-cortes das secções cerebrais coronais (17 um) são executadas. Uma secção de cada 30 é recolhida na mesma lâmina ter uma lesão cerebral representativo. Para a quantificação do volume, duas lâminas são coradas por coloração com violeta de cresilo e um sistema de análise de imagem (Scion Corporation, Frederick, MD) foi usado para avaliar a lesão. O volume da lesão foi calculada em unidades arbitrárias (pixels), e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral de cada secção. Outras lâminas são mantidas a -80 ° C para estudos imuno-histoquímicos. Alternativamente, fixa-PFA cérebro pode ser cortado em 30-50 uM utilizando vibratome e o volume do enfarte medido, tal como recomendado por Han et al. (2009) 6.

<ol>
	<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema,+I:+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area.">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li><li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. r. a. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia.">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li><li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia.">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li><li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+(1st+edition.">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li><li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia.">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li><li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor.">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li><li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke.">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li><li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li><li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion.">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li><li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice.">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li><li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia:+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques.">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesses para divulgar. Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Zeiss, Inc.

Diferentes modelos de AVC têm sido desenvolvidos para imitar efeitos de AVC em pacientes. A escolha do modelo de acidente vascular cerebral depende da questão biológica. O modelo OACM intraluminal imita um dos tipos mais comuns de AVC isquêmico em pacientes e é menos invasiva e mais consistente do que o modelo Tamura 4,7. É um modelo muito interessante para análises de morte neurorepair neuroproteção, e celular. O sucesso do modelo intraluminal depende de muitos factores tais como o sexo do animal, idade e peso, a temperatura, a anestesia e do momento da cirurgia, que têm de ser controladas. As propriedades físicas do oclusor (ponta de diâmetro, comprimento, forma e fexibilidade) são críticos para a consistência da MCAO 4. Aqui, usamos a 12 milímetros de comprimento 6-0 monofilamento revestido com silicone em 9-10 mm da Corporação Doccol. A grande vantagem deste monofilamento é reduzir hemorragia subaracnóidea e porque seu comprimento cobriu todo o ICAcomprimento, o fluxo de sangue residual, que vem das artérias anterior e posterior comunicação do Círculo de Willis e PPA, é impedido e da variabilidade de volume diminui infarto (15% da variabilidade em nossas mãos) 8. A sutura de CCA também diminui a variabilidade do volume de enfarte 9. A extensão da lesão cerebral a seguir tMCAO pode ser avaliada por modos diferentes. Défices neurológicos pode ser medida conforme anteriormente mencionado. No entanto, é difícil ter uma medida eficaz por este caminho. A extensão do enfarte é normalmente realizada por coloração com TTC. Mais recentemente, as técnicas de ressonância magnética também são utilizados, uma tecnologia particularmente interessante para os tratamentos neuroprotectores. Para compreender os mecanismos subjacentes celulares envolvidos no acidente vascular cerebral, tais como neurorepair morte celular, ou a proliferação celular, o estudo de diferentes marcadores por imuno-histoquímica é crítica e muito informativo. Assim, o nosso protocolool de preparações secção cérebro tem a grande vantagem de permitir que estas análises, e minimiza o número de ratos utilizados. Além disso, Tureyen et al. 10 relataram que há uma boa correlação entre a coloração violeta cresil e TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Descrição</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscópio estéreo</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibra-Light Iluminador de Alta Intensidade</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema de Anestesia para isoflurano</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cobertor Aquecimento</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lâmpada de aquecimento de infravermelhos</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra pinça fina, estilo 5</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vannas Tesoura Cutting Edge 3 mm, Reto</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estilo LA-1 e MPF-1 Todas as lâminas lisas</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Negativos pinças de ação, estilo KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Electron Microscopy Sciences</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissecando tesoura 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclip Starter Set</td&gt;<td&gt; Harvard aparelho</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD Autoclip Wound Syst Encerramento., 9mm de comprimento, 100/PK</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sutura 5-0</td&gt;<td&gt; Harvard aparelho</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Material de sutura PDS II monofilamento violeta, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm de comprimento de sutura de monofilamento 6-0 siliconado</td&gt;<td&gt; Doccol Corporação</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agulhas 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</em&gt; Ratos</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

mouse model of intraluminal mcao: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining

AVC é a terceira causa de mortalidade ea principal causa de incapacidade no mundo. Isquêmicos contas AVC por aproximadamente 80% de todos os derrames. No entanto, o tecido trombolítica activador do plasminogénio (tPA) é o único tratamento do acidente vascular cerebral isquémico agudo que existe. Isto levou os pesquisadores a desenvolver diversos modelos de acidente vascular cerebral isquêmico em uma variedade de espécies. Dois grandes tipos de modelos de roedores foram desenvolvidos: modelos de isquemia cerebral global ou isquemia cerebral focal. Para imitar AVC isquémico em doentes, nos quais cerca de 80% AVC trombótico ou embólico ocorrer no território da artéria cerebral média (MCA), a oclusão da artéria cerebral média intraluminal (MCAO) modelo é muito relevante para os estudos de acidente vascular cerebral. Este modelo foi desenvolvido pela primeira vez em ratos por Koizumi et al., Em 1986, 1. Devido à facilidade de manipulação genética em ratinhos, estes modelos têm sido desenvolvidos neste 2-3 espécie. conteúdo &quot;&gt; Aqui, nós apresentamos a MCA transiente procedimento de oclusão em ratos C57/BL6. Estudos anteriores relataram que as propriedades físicas do oclusor como o diâmetro da ponta, o comprimento, a forma ea flexibilidade são críticas para a reprodutibilidade do volume do enfarte 4. Nisto, um monofilamentos de silício comerciais revestidos (Doccol Corporation) foram utilizados. Outra grande vantagem é que este monofilamento reduz o risco de induzir hemorragia subaracnóidea. Usando o estereomicroscópio Zeiss-Stemi 2000, o monofilamento de silicone revestido foi introduzido na artéria carótida interna (ICA), através de um corte da artéria carótida externa (ECA) até que o monofilamento oclui a base da MCA. fluxo sanguíneo foi restaurado 1 hora depois da remoção do monofilamento para imitar o restabelecimento do fluxo sanguíneo após a lise de um coágulo de tromboembólico humanos. A extensão do enfarte cerebral pode ser avaliada primeiro por uma pontuação neurológica e pela medição do volume do enfarte.Ratos isquêmicos isso foram analisados ​​para a sua pontuação neurológica em diferentes pós-reperfusão vezes. Para avaliar o volume de enfarte, a coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) foi geralmente realizada. Aqui, usamos a coloração violeta cresil uma vez que oferece a oportunidade de testar muitos marcadores de críticas por imuno-histoquímica. Neste vídeo, relata o procedimento OACM; pontuações neurológicas e da avaliação do volume de infarto por coloração violeta cresil.

A avaliação neuroscore confirma o sucesso do tMCAO pós-AVC e determina a eficiência do tMCAO de pós-reperfusão. Nas nossas mãos, todos os ratos submetidos ao procedimento intraluminal apresentou pelo menos uma ondulação ligeira consistente (neuroscore 2) e os défices neurológicos são geralmente estáveis ​​até 72 horas. A maioria dos ratos apresentam um leve ondulação consistente (neuroscore 2). Ratinhos mostrando ausência de enrolamento são excluídos do estudo. No entanto, a avaliação neuroscore não permite-nos distinguir entre ratos com um hipocampo feridos e aqueles com um hipocampo intacto. Nenhuma mortalidade foi observada durante o dia da cirurgia, o que sugere que a hemorragia subaracnóidea não ocorreu. Quando a hemorragia subaracnoidea é identificado no rato, este é sistematicamente excluídos da análise. O uso de silício revestido de monofilamento de Doccol Corporation, que é mais suave do que a casa preparados monofilamentos, aumenta o sucesso detMCAO e reduz a hemorragia subaracnóidea. A mortalidade entre 24 horas e 72 horas é de 14% neste modelo, como geralmente reportados por 60 minutos de oclusão. A mortalidade observada é provavelmente devido a um grande volume do enfarte neste estirpe de ratinho. A reprodutibilidade forte lesão foi também observada (desvio padrão é de 15%), o que é muito interessante para estudar moléculas neuroproteção onde o seu efeito (s) poderão ser escondidos pela variabilidade do modelo. Para avaliar a extensão da lesão cerebral após tMCAO, optou-se por utilizar coloração violeta cresil (Figura 2) em vez de TTC a fim de ter uma grande quantidade de materiais para testar marcadores relevantes 6. A extensão da lesão é relativamente consistente. No entanto, percebemos que em alguns ratos, o hipocampo foi ferido (cerca de 30% dos ratos). É interessante notar que a coloração com violeta de cresilo pode ser aplicado até uma semana mais tarde. Na literatura, a percentagem de enfarte cerebral varia de umestudar para o outro. Ela depende da escolha de estirpe de ratinho, a anestesia, a espessura das secções de cérebro, o monofilamento utilizado, ou a coloração utilizado 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esquema da oclusão da artéria cerebral média, utilizando silício revestido monofilamento intraluminal. Um esquema. Simplificado do cérebro de rato e artérias cerebrais mostrando suturas sucessivas e clipe para preparar a introdução de silício revestido de monofilamento. B. A posição de monofilamento através do círculo de Willis é representada. O monofilamento é introduzido via ICA ECA para ocluir a base do MCA ACA, artéria cerebral anterior;. BA, da artéria basilar; CCA, artéria carótida comum; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, carótida externa artery; ICA, interna da artéria carótida; MCA, artéria cerebral média; PCA, artéria comunicante posterior; PPA, artéria pterigopalatina. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representante cortes coronais de cérebro de rato coradas com cresil violeta após 72 horas pós-reperfusão área de infarto. (Principalmente estriado, córtex e áreas cerebrais adjacentes) aparece em branco (imaculada por violeta cresil). O volume da lesão (parte branca, hemisfério direito) foi delimitado e expresso como uma percentagem da área não lesada contralateral (hemisfério esquerdo).

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Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

mouse-model-intraluminal-mcao-cerebral-infarct-evaluation-cresyl

Research

JoVE Journal

Medicine

62.8K visualizações.  Clinical Research Institute of Montreal. O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Vídeo: Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema otimizado para Monitorização de perfusão cerebral no modelo do rato do curso de oclusão da artéria cerebral média intraluminal

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Embolic artéria cerebral média Oclusão (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com homólogos Coágulos de sangue em ratos

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Uma bateria de testes de motor em um Neonatal Rato Modelo de Paralisia Cerebral

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Drug Delivery intraluminal para o Rato Fístula Arteriovenosa endotélio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...