Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Zachary Z. Brown e Jennifer Alleva para o desenvolvimento inicial desta técnica em fase sólida e síntese FL Matthew Parker para discussões úteis. Este trabalho é suportado pela Agência de Redução de Defesa ameaça (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) eo Horst Witzel Award Fellowship suportado por Cephalon, Inc.

1. Instalação <ol><li> A reacção de configuração para a síntese em fase sólida é um polipropileno cartucho de filtro ou reactor de vidro que está ligado por meio da tubagem de polipropileno para um balão fechado filtragem sob vácuo, como mostrado na Figura 1. A reacção pode ser misturado por uma barra de agitação magnética ou fazendo borbulhar azoto através do reactor. </li><li> Um colector de gás ligado a um cilindro de árgon equipado com um tubo de secagem e borbulhador de óleo é também recomendado porque permite que o recipiente de reacção a ser contido sob uma atmosfera inerte e permite a remoção de reagentes a partir de recipientes selados. </li><li> Todas as operações são realizadas em um exaustor e equipamento de proteção individual (óculos de segurança, jaleco e luvas de borracha nitrílica) é necessária. </li></ol> 2. Primeiro a carregar Bis-Peptide Onto Resina <ol><li> Pesar 114 mg de HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g de carregamento, 100 mmol) em 8 mL vaso de reacção e adicionar uma barra de agitação magnética. Tapar o topo da thnavio e com um septo de borracha e de purga do tubo com árgon durante pelo menos 5 minutos. </li><li> Entretanto, a pesar 117,3 mg do composto 1 da Figura 3 (586,63 g / mol, 2eq) e 59,2 mg de 1 - (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) em um tubo de centrífuga de 15 mL descartável e dissolver em 2 mL de diclorometano anidro (DCM). Adicionar 24 ul de 1-metilimidazole (NMI, 80,81 mL / mol, 3eq) à solução e mistura até ficar completamente dissolvida. </li><li> Transferir a solução activado para o vaso de reacção através de uma seringa e deixa-se agitar sob árgon durante a noite (aprox. 10 horas). </li><li> Remover o septo e drenar-se a mistura de reacção. Lavar a resina com DCM (5x) e dimetilformamida (DMF) (5x). Realizar o &quot;teste vermelho de metila&quot;, descrito na seção 10.1 para avaliar o grau de carga de resina. Se a resina permanece vermelho durante o teste de vermelho de metilo, em seguida, os passos de 2,2 e 2,3 deve ser repetido. Uma cor amarela, indicativa de um negativo de teste vermelho de metilo, é preferido;no entanto, uma vez que quaisquer grupos hidroxilo remanescentes será tapado no próximo passo, um resultado ligeiramente positivo (cor de resina laranja claro) pode ser aceitável. </li></ol> 3. A desprotecção da resina Bis-péptido e simultânea Primeiro capping <ol><li> Adicionar 1 mL de DCM para o vaso de reacção, em seguida, adicionar 1 mL de brometo de hidrogénio 33% em ácido acético gota a gota durante 30 segundos (borbulhamento ocorre) e agita-se durante 15 minutos. Escorrer e lavar a resina com DCM (5x), em seguida, repetir processar mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). Neutralizar a resina por lavagem duas vezes com uma solução a 5% v / v de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) em DMF, em seguida, lava-se com DCM (5x) e DMF (5x) novamente. Realizar o &quot;teste de vermelho de metilo&quot; e &quot;teste cloranil&quot; discutido na seção 10.1 e 10.2. Os resultados devem ser negativa para o teste de vermelho de metilo e positiva para o teste de cloranil. </li></ol> 4. Acoplamento Boc / tBu-Protegido funcionalizada Bis-Aminenhum ácido <ol><li> Reintroduzir uma atmosfera inerte para a resina contendo vaso de reacção por lavagem três vezes com DCM anidro, em seguida, anexar um septo e uma linha de árgon. Limpar e lavar o vaso, adicionando mL 1-2 de DCM anidro e deixando agitar por 30 segundos, em seguida, a drenagem do reservatório até que o argônio linha borbulhador começa a subir. Faça isso pelo menos mais uma vez. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,15 M funcionalizado bis-amino ácido (3eq) e 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) em 2 mL de 2:1 DCM: DMF num ensaio à chama secas tubo sob atmosfera de árgon. Adicionar 47 ul de diisopropilcarbodiimida (DIC, 156,6 mL / mol, 3eq) e agita-se durante 90 minutos. </li><li> Adicionar 35 DIPEA uL (174,19 mL / mol, 2eq) em 666 uL de DMF anidro à resina e agita-se durante 5 minutos. </li><li> Transferir o pré-activada de solução de ácido bis-amino para o vaso de reacção através de uma seringa e deixa-se agitar durante a noite. </li><li> Drenar-se a mistura reaccional e lava-se duas vezes com DCM anidro enquanto sob<html> árgon. </li><li> Para promover o encerramento da dicetopiperazina, adicionar uma solução 0,25 M de HOAt (136,11 g / mol, 10eq) e DIC (156,6 mL / mol, 10eq) num 4 mL de 1:1 DCM: DMF e deixa-se agitar sob atmosfera de árgon durante 1 hora. </li><li> Remover o septo e drenar-se a mistura de reacção. Lavar a resina com DCM (5x) e DMF (5x). Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10.2. </li></ol> 5. A desprotecção do Boc / tBu-protegido Ácido Bis-Amino funcionalizado <ol><li> Adicionar 2 mL de uma solução de ácido trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (TIPS) para o vaso de reacção e permitir que ele a agitar durante 1 hora. Escorra e lave a resina para cerca de 30 segundos com DCM (5x), em seguida, repita o processo mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). Neutralizar a resina por lavagem duas vezes com uma solução a 5% v / v de DIPEA em DMF, em seguida, lavar DCM (5x) e DMF (5x) novamente. Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10.2. </li></ol>le &quot;passos&gt; 6. Repita 4 e 5, como desejado para sintetizar alvo bis peptídeo. 7. Funcionalização do Fim Prolidine Bis-Peptide <ol><li> A extremidade prolidine do crescimento bis-péptido pode ser acilado independentemente ou em conjunto através de uma dicetopiperazina. Além disso, este fim pode ser deixado protegido, o qual será clivado último, obtendo-se o aminoácido livre. Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10,2 para avaliar a eficiência de acoplamento. </li></ol> 8. A desprotecção de Fmoc e acilação do Fim Quaternário do Bis-Peptide <ol><li> Uma solução de 2 ml de piperidina a 20% em DMF é adicionada ea reacção é misturada durante 20 minutos. Escorrer e lavar a resina com DMF (5x), em seguida, repita o processo mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li><li> Preparar uma solução de 0,15 M de aminoácido (3eq) em 2 mL de N-metilpirrolidona (NMP) com 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) e 104,5 DIPEA uL (174,19 mL / mol, 6eq) e misturar bem. Adicionar à vaso de reacção e agita-se durante 6 horas. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li></ol> 9. Remover o grupo Boc da resina de Ligação de aminoácidos e Cleave a partir de resina <ol><li> Adicionar 2 mL de uma TFA 1:1: solução DCM para o vaso de reacção e deixa-se agitar durante 30 minutos. Escorrer e lavar a resina com DCM (5x), em seguida, repetir processar mais uma vez. </li><li> Lavar e drenar a resina durante 30 segundos com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li><li> Adicionar 2 mL de uma solução de DIPEA a 10% em DMF anidro e deixa-se agitar de 24-48 horas. </li><li> Colete mistura de reacção em pré-pesado balão de fundo redondo. Transferir 30 uL desta solução a 450 uL de THF em um frasco de LC-MS e submete para análise. Lava-se a resina com alíquotas adicionais de DMF e recolher para o balão de fundo redondo, em seguida, remover o solvente sob vácuo. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificação de Bis-Peptide <ol><li> Dissolver em bruto bis-péptido numa quantidade mínima de sulfóxido de dimetilo (100-250 uL) e transferência para HPLC de inserção do frasco. Inserto lugar em amostrador automático de HPLC semi-prepitive sistema (Hewlett Packard 1100 Série) equipado com um MS Prep XTerra C18 5 micrómetros coluna milímetros 7.8x150 e um circuito 100 de injecção uL. </li><li> Executar múltiplas injecções de 50 ul da amostra, utilizando um programa de gradiente de acetonitrilo 5-95% em água com 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos enquanto monitorando a 274 nm. Recolher o pico do produto num tubo de centrífuga de pré-pesado descartável e congelar seca utilizando um liofilizador. Devem ser tomadas precauções com a primeira execução como uma ligeira mudança no tempo de retenção do pico em comparação com LCMS analíticos é tipicamente observado. </li></ol> 11. Métodos de Avaliação <ol><li> METHYL TEST RED 7: Remover ~ 1 mg de resina seca através de uma pipeta descartável e enxaguar em 4 mL vaso de reacção. Adicionar uma solução de 20 mg de vermelho de metilo, 50 N ul, N&#39;-diisopropilcarbodiimida (DIC), e 5 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) em 500 uL DCM anidro e agita-se durante 5-10 min. Escorra e lave resina com DCM até que o filtrado se torne incolor. Indicação positiva é as pérolas de resina restantes laranja ou vermelha. </li><li> Cloranil ENSAIO 12: Transferência ~ 1 mg de resina seco para um pequeno frasco através de uma pipeta descartável. Adicionar 3 gotas de ambos cloranil mM um 0,8 em solução de DMF e acetaldeído 2% em solução de DMF e deixar repousar à temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Indicação positiva é a resina, transformando azul / roxa. </li><li> Teste de activação TRAP: compostos activado durante a síntese pode ser avaliada através da transferência de uma pequena quantidade (uL 5-10) da solução activada para uma espectrometria de massa de cromatografia-líquida (LC-MS) frasco contendo 50 uL de pirrolidina. Misture com a mão por alguns segundos (solutiem deve tornar-se amarela), em seguida, dilui-se com 450 ul de tetra-hidrofurano (THF) e submete para LC-MS análise. </li><li> ANÁLISE LC-MS: O produto final e intermediários activados podem ser avaliados através de uma série HP 1200 sistema LC-MS equipado com um Xterra Waters C18 MS 3,5 uM 4,6 mm x 150 mm coluna e um sistema de gradiente de acetonitrilo 5-95% em água com 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos. </li></ol> 12. Os resultados representativos Um exemplo de ambos em bruto (Figura 4) e purificado (Figura 5) vestígios LCMS são fornecidos. Rendimento purificadas de cerca de 10% são esperados utilizando os métodos descritos acima. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama do conjunto experimental para síntese em fase sólida. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclatura relevante de Bis-aminoácidos / Bis-peptídeos. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema de síntese geral. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> A Figura 4a. HPLC de rastreamento do produto bruto em 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. MS Espectro de pico de produto bruto. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC Rastreamento de produto purificado em 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. Espectro de MS purificada Product Pico.

<ol>
	<li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (1989).</li><li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides.">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li><li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-Programmable+Macromolecules.">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li><li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids.">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li><li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues.">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li><li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports.">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li><li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis.">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li><li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation.">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li><li>Plas, S. E. V. a. n. d. e. r., Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs:+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC.">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li><li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides.">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).</li><li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase.">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A abordagem sintética aqui apresentada fornece um método para a síntese de bis-funcionalizados péptidos a partir de bis-amino blocos de construção de ácido usando comuns em fase sólida técnicas de síntese de péptidos. A síntese destes monômero &quot;Pro4&quot; blocos de construção de trans-4-hidroxiprolina 3 é altamente escalável e foi concluída com êxito para o palco hidantoína em mmol 600 (234 g) escala (não publicado). Uma vez que os monómeros são dadas, a utilização de técnicas de fase sólida proporciona um método mais rápido de bis-péptido síntese do que a nossa metodologia solução de fase corrente 4, eliminando a necessidade de reacção de trabalho-ups e purificações intermédios. O desafio primário na síntese em fase sólida é diagnosticar o progresso sintético e resolução de problemas uma vez que não intermediários são isolados. Isto levou ao desenvolvimento de muitos testes colorimétricos incluindo aqueles para identificar se aminas livres (o teste de Kaiser 10) ou livre HydroxYLS (Metil Teste vermelho 7) estão expostos na resina. Infelizmente, o comumente usado teste de Kaiser 10 não é geralmente aplicável no nosso síntese em fase sólida, devido à utilização quase exclusiva de aminas secundárias ou aminas ligados a um carbono quaternário. Outras opções para avaliação de resina HMBA incluem clivagens teste usando um nucleófilo como hidrazina 11, clivagem Fmoc quantitativa monitorado por UV / Vis 1,11, e captura e análise de compostos de entrada ativados. Outra questão ignorado no síntese em fase sólida é a natureza repetitiva de passos sintéticos exigidas pelo operador. Com isto em mente, os autores recomendamos fortemente o uso de uma planilha ou lista de verificação quando efectuar qualquer manual de síntese de peptídeos em fase sólida. A dificuldade na utilização de bis-péptidos em fase sólida para a síntese em comparação com comuns α-aminoácidos inclui o potencial para acoplamentos mais difícil devido à Hin estéricoDrance, a necessidade de fechos em resina-dicetopiperazina, e deprotections simultâneas (Boc / tBu; Cbz / tBu). Outra dificuldade reside na obtenção de libertação quantitativo a partir da resina usando este &quot;fecho de segurança&quot; método quando comparado com meios mais convencionais. Com esses fatores em mente, é muito possível que uma maior otimização desse método pode ser alcançado e os esforços atuais estão em andamento em nosso grupo para melhorar o método aqui apresentado.

<table border="1"><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Carcinogênico </td></tr><tr><td> DCM anidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Carcinogênico </td></tr><tr><td> Brometo de hidrogénio 33% em ácido acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Tóxico, Corrosive, Fumes quando aberto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> DMF anidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DICAS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> Vermelho de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Inflamável, peróxido, Toxic Formando </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Pescador </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> Vasos de reacção SPPS </td><td> Graça </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Série 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Série 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using "safety catch" methodology

Em 1962, RB Merrifield publicado o primeiro procedimento em fase sólida utilizando síntese de péptidos como uma nova via para sintetizar eficientemente péptidos. Esta técnica rapidamente mostrou-se vantajoso em relação ao antecessor fase de solução em termos de tempo e trabalho. Melhorias relativamente à natureza do suporte sólido, os grupos protectores utilizados e os métodos de acoplamento utilizados nos últimos cinco décadas têm só aumentou a utilidade do sistema original Merrifield. Hoje em dia, a utilização de uma protecção Boc-base e base / estratégia resina nucleófilo clivável ou Fmoc de protecção de base e da estratégia resina acídica clivável, iniciada por RC Sheppard, são mais comumente utilizado para a síntese de péptidos 1. Inspirado por estratégia sólida de Merrifield suportado, nós desenvolvemos uma Boc / terc-butil estratégia de síntese de fase sólida para a montagem de funcionalizados bis-péptidos 2, que é aqui descritos. A utilização de síntese em fase sólida em comparação tO metodologia de solução de fase não é apenas vantajoso em termos de tempo e de trabalho, tal como descrito por Merrifield 1, mas também permite que uma maior facilidade na síntese de bis-peptídicos bibliotecas. A síntese que demonstram aqui incorpora uma fase de clivagem final que utiliza um de dois passos &quot;fecho de segurança&quot; mecanismo para libertar o funcionalizado bis-péptido a partir da resina por formação de dicetopiperazina. Bis-péptidos são rígidas, espiro-escada com oligómeros de bis-aminoácidos que são capazes de posicionar a funcionalidade de uma forma previsível e projetáveis, controlada pelo tipo e estereoquímica das unidades monoméricas e da conectividade entre cada monómero. Cada ácido bis-amino é um estereoquimicamente puro, andaime cíclico que contém dois aminoácidos (um ácido carboxílico com um α-amina) 3,4. Nosso laboratório está atualmente investigando o potencial de funcionais bis-peptídeos em uma ampla variedade de áreas, incluindo catálise, interações proteína-proteína e nanomaterials.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology at JoVE.com

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

A síntese de péptidos em fase sólida eficiente de um trímero bis péptido-funcionalizado utilizando um &quot;fecho de segurança&quot; procedimento de clivagem a partir de resina de HMBA é descrito.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

24.4K visualizações.  Temple University. A síntese de péptidos em fase sólida eficiente de um trímero bis péptido-funcionalizado utilizando um "fecho de segurança" procedimento de clivagem a partir de resina de HMBA é descrito.

Vídeo: Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Otimização da Reação UGI Usando Síntese Paralela e manipulação de líquidos Automated

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, Rhizoctonia bataticola. In the literature, comprehensive and detailed step-by-step protocols on disease assays are sparse. This article provides complete details on the steps involved in setting up a blotting paper technique for quickly screening genotypes for resistance to DRR. The blotting paper technique is easy and less expensive. Another method, based on the sick pot approach, is a mimic of natural infection and can be applied to study the interacting components&#8212;plant, pathogen, and environment&#8212;involved in the disease triangle.
Moreover, in nature, DRR occurs mostly in rainfed chickpea cultivation areas, where soil moisture recedes as crop growth advances. Drought stress is known to predispose chickpea plants to DRR disease. Pathomorphological and molecular understanding of plant-pathogen interaction under drought stress can pave the way for the identification of elite DRR-resistant varieties from the chickpea germplasm pool. This article provides a stepwise methodology for the preparation of a sick pot and subsequent disease assay. Overall, the information presented herein will help researchers prepare R. bataticola fungal inoculum, maintain this pathogen, set up the blotting paper technique, prepare sick culture and sick pot, and assess pathogen infection in chickpea plants.

This study presents methodologies to study the pathomorphological and molecular mechanisms underlying chickpea&#8211;Rhizoctonia bataticola interaction. The blotting paper method is useful to rapidly study chickpea genotype responses, while the sick pot-based method can be used to simultaneously impose drought and R. bataticola infection and screen for tolerant genotypes.

Ensaios da doença de podridão de raízes secas no grão-de-bico: uma metodologia detalhada

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring systems is challenging. An efficient methodology to synthesize these compounds was recently published that described the solid phase synthesis in four steps rather than the previously reported five steps. The advantage of this shorter synthesis is the elimination of the use of toxic reagents. Low-loading Regenerating Michael (REM) linker-based resin was found to be crucial in the synthesis as high-loading versions prevented the addition of reagents containing bulky phenyl and aromatic side chains. The colorimetric 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used to examine the cytotoxicity of micromolar concentrations of these novel spirocyclic molecules in vitro. MTT is readily available commercially and produces relatively fast, reliable results, making this assay ideal for these spirocyclic heterocycles. Orthogonal ring structures as well as furfurylamine (a precursor in the synthesis method containing a similar 5-member ring motif) were tested.

Here, we describe a bioassay using 3-(4&#8242;,5&#8242;-dimethylthiazol-2&#8242;-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) to test previously synthesized spirocyclic oximes.

Síntese Espirocíclica Funcionalizada de Heterociclos e Ensaio de Citotoxicidade

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...