Nosso protocolo pode ser usado para determinar eventos dinâmicos espaçais e temporais durante a mitose, e também pode ser usado para visualizar os efeitos dos reguladores mitóticos em tempo real. O uso de imagens de cores duplas permite uma análise simultânea de dois marcadores moleculares. Por exemplo, podemos visualizar os microtúbulos do fuso mitótico e a estrutura do núcleo cinético dos cromossomos replicados.
Para induzir a expressão de proteína fluorescente, quatro dias após o tratamento de interferência do RNA, expõe as células transfetizadas do promotor de metallo-timanina indutíveis a uma concentração final de 500 sulfato de cobre micromolar por 24 a 36 horas. Para preparar as células de expressão da proteína fluorescente para imagens, transfira as células para um tubo estéril de 15 mililitros e, após a contagem, sedimente as células por centrifugação. Resuspend a pelota em SIM fresco, 25 graus Celsius aquecido, complementado com 10% FBS, em duas vezes 10 a 6 células por concentração mililitro, e tratar as células com sulfato de cobre de 500 micromolar adicionais.
Em seguida, adicione 200 a 500 microlitros de células a um poço de uma câmara celular multi-bem viva, e coloque a câmara em um estágio de microscópio fluorescente invertido. Enquanto as células estão se instalando na câmara, abra o software de imagem de células ao vivo e clique em novo e experimento. Para inserir um loop de lapso de tempo sobre o qual as imagens serão tiradas, clique no ícone de loop de lapso de tempo.
Defina o intervalo em segundos e divida o comprimento total do experimento desejado em segundos pelo intervalo para definir o número de ciclos. Permita que o loop se repita durante o período de tempo total desejado. Para inserir uma verificação de foco infravermelho para manter o foco do objetivo, clique no ícone move XY e selecione compensação de deriva Z para adicionar uma etapa de compensação de deriva Z dentro da camada de loop de lapso de tempo.
Para permitir a aquisição de uma imagem de vários canais, clique no ícone de grupo de vários canais para adicionar uma camada de grupo de vários canais e clique no ícone adicionar um loop de pilha Z para adicionar uma camada de loop de pilha Z. Em seguida, defina o tamanho da etapa desejada e o número de fatias, e defina a exposição de cada canal o mais baixo possível para minimizar o branqueamento de fotos. Para imaginar uma divisão celular, selecione um objetivo de imersão de óleo 40 ou 60 vezes, e o canal mCherry florescence, e alinhe o objetivo ao longo da parte superior ou inferior do poço.
Em seguida, afaste-se do divisor de poços verticais para evitar interferências na etapa de compensação de deriva Z. Localize uma célula ou células no final da fase G2 ou no início da fase M, e clique no botão de visualização ao vivo para começar a visualizar células na tela do software. Encontrar células apropriadas na transição G2 para M é a chave para a imagem de uma divisão celular.
Localize uma célula com um núcleo intacto e exatamente dois centrossomos para melhores resultados. Usando o botão de foco fino do microscópio, concentre-se nas células de interesse e clique em encontrar deslocamento para definir a verificação de foco infravermelho. Clique em iniciar o programa de imagem de lapso de tempo e selecione o canal desejado e ajuste as intensidades médias dos pixels para ajustar os histogramas conforme necessário, para visualizar claramente as células de interesse.
Verifique as células após 15 a 20 minutos para confirmar que o rompimento do envelope nuclear ocorreu, como determinado pelo desaparecimento do local redondo e escuro refratado perto do centro da cela. Após mais 15 a 20 minutos, verifique se ocorreu o início da anfáfase. Em seguida, pare o programa e salve o arquivo.
Para determinar a quebra do envelope nuclear ao tempo de início da anfáfase, clique no botão de enquadraçamento para determinar a hora da quebra do envelope nuclear e o tempo de separação inicial do cromossomo em minutos, e subtraia o tempo de quebra do tempo de início para obter a quebra do envelope nuclear para o tempo de início da anafase para uma determinada célula. Em seguida, continue procurando células pré-divisórias para obter múltiplas extremidades para uma determinada condição por até 12 horas a partir do assentamento inicial. As células que estão prestes a se dividir podem ser alvo da presença de dois centrosmos e um núcleo intacto, como indicado pela luz refratada e uma mancha mais escura dentro da célula quando vista no canal alfa tubulina.
A quebra do envelope nuclear pode ser visualizada através do desaparecimento desta mancha escura, resultando na coloração uniforme do citoplasma. Após a quebra do envelope nuclear, o tempo que cada célula leva para formar o fuso e para o Congresso e segregar os cromossomos pode ser medido observando os pontos de tempo desses eventos relativos à quebra de envelopes nucleares. O tratamento com RNA duplamente encalhado direcionado contra o shortstop, uma proteína de interligação de microtúbulos actina suspeite de afetar a dinâmica do ciclo celular resulta em um atraso mitótico significativo.
Este tratamento resulta em um atraso significativo, com muitas células prendendo na metafase e nunca transitando para a anáfase durante todo o experimento de imagem de duas a três horas. O co-tratamento com RNA de dupla rega contra tiro e acordo bruto, um componente importante deste ponto de verificação, leva a uma supressão do fenótipo de prisão, resultando em quebra de envelope nuclear para tempos de anafase semelhantes às células controladas e não tratadas. Certifique-se de selecionar células apropriadas, e não perca tempo com células de imagem que não começam a divisão.
Se uma célula não começar a se dividir em 20 minutos, encontre outra célula. Os pesquisadores podem seguir esse procedimento para ajudar a identificar novos reguladores mitóticos, ou possivelmente novos compostos secos que afetam eventos específicos na divisão celular.
