Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional – Projeto SINGING PLANT (nº. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Este projeto recebeu financiamento através do projeto MSCA4Ukraine (ID 1233580), que é financiado pela União Europeia. Somos gratos a Lenka Sochurkova pelo design gráfico da Figura 1.

1. Preparação do meio
<ol><li>Preparar o meio de cultivo misturando 0,75 g de gelificante com 50 mL de água deionizada estéril em um frasco de vidro para atingir uma concentração de 1,5% (p/v) para uma placa de Petri (120 x 120 x 17 mm). Agite suavemente a mistura e, em seguida, aqueça-a no micro-ondas até ferver para dissolver o agente gelificante (a solução torna-se clara).</li>
	<li>Deixe o meio arrefecer até 58-60 °C antes de prosseguir para os passos seguintes. Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação.</li>
	<li>Use placas de Petri com bordas à prova de luz para evitar reflexão excessiva de luz actínica e alta autofluorescência de fundo durante as medições. Para isso, aplique fita adesiva preta (ou outros meios disponíveis) para cobrir todos os lados da placa de Petri vazia (Figura 2).</li>
	<li>Realizar a esterilização da(s) placa(s) após a aplicação da fita por irradiação com lâmpada germicida UV por 20-30 min.</li>
	<li>Se o experimento envolver tratamento químico (ou seja, estressores abióticos/bióticos, hormônios vegetais e/ou reguladores de crescimento, etc.), adicione a quantidade apropriada de produto químico correspondente diretamente ao meio. Esteja ciente de uma estabilidade química escolhida que está sendo adicionada ao meio (por exemplo, se o produto químico não for termoestável, adicione ao meio quando ele for resfriado antes de despejá-lo na placa). Misture bem o meio agitando para garantir uma distribuição uniforme do produto químico.</li>
	<li>Evite a iluminação das placas para a luz UV depois que a mídia é derramada (levaria à produção de radicais de oxigênio que poderiam interferir no experimento).</li>
	<li>Despeje o meio preparado na(s) placa(s) de Petri quadrada e deixe o meio solidificar à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Esterilização da superfície das sementes e condições de crescimento das plantas
<ol><li>Obter a quantidade necessária de sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 da calha (10-20 mg) e adicioná-la a um tubo de microcentrífuga de 2 mL. NOTA: Nenhuma modificação específica é necessária ao trabalhar com diferentes linhas de Arabidopsis (linhas de ecótipo/mutantes). A revisão da grade de serragem e as etapas de medição devem ser realizadas para outras espécies vegetais, levando-se em consideração a diferença no tamanho das sementes, na taxa de germinação e no tamanho das plântulas.</li>
	<li>Esterilizar superficialmente as sementes de Arabidopsis adicionando etanol a 70% ao tubo por 2 min. Agite suavemente os tubos durante a esterilização.</li>
	<li>Remova o etanol pipetando cuidadosamente, tomando cuidado para não perder nenhuma semente. Lave as sementes adicionando água estéril ao tubo por 5 min para remover qualquer etanol residual (agite suavemente os tubos durante o período de lavagem).</li>
	<li>Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.</li>
	<li>Enxaguar novamente as sementes 2x com água estéril, conforme descrito na etapa 2.3, para garantir que estejam livres de quaisquer características de etanol. Deixe as sementes sedimentarem para o fundo do tubo por gravidade, retire a água restante.</li>
	<li>Adicione um volume igual de água estéril ao tubo que contém as sementes para criar uma suspensão de água de sementes.</li>
	<li>Utilizar uma grade de semeadura para distribuir uniformemente a suspensão de água de semente do genótipo dado nas áreas selecionadas da placa média (Figura 2 e Figura Suplementar 1). Distribuir as sementes (aproximadamente 30-40) em fileiras em cada área utilizando uma ponta de pipeta larga.</li>
	<li>Deixe a água secar nas áreas de sementes por cerca de 30 min, mantendo a(s) placa(s) aberta(s) em uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Sele a placa com fita adesiva de micropore e envolva-a com papel alumínio.</li>
	<li>Estratificar as sementes por 3 dias a 4 °C no escuro para, dependendo do ecótipo utilizado, superar a dormência e/ou promover uma germinação uniforme.</li>
	<li>Transferir a placa com sementes estratificadas para luz branca (150 μmol/m2/s) por 1 h para induzir a germinação (desembrulhar a folha apenas para o tratamento leve).</li>
	<li>Após o tratamento com luz, envolver a placa com papel alumínio para proteger as sementes da luz e colocá-la na posição vertical em uma câmara de crescimento e cultivar por 4 dias no escuro a 21 °C.</li>
</ol>3. Medição e análise da fluorescência da clorofila
<ol><li>Ligue o sistema iReenCAM e certifique-se de que o sistema está pronto e configurado corretamente no software do servidor PS iniciado automaticamente (por exemplo, se houver espaço de armazenamento suficiente para os dados do experimento, se a câmera de fluorescência estiver conectada ao PC, etc.).</li>
	<li>Ative o software Scheduler para criar o plano experimental para a medição clicando em Experimentos > Novo Experimento. Forneça um nome descritivo para o experimento e preencha os detalhes (descrição).</li>
	<li>Defina as ações necessárias para o experimento clicando em Adicionar ação , o que levará ao cronograma de ações experimentais. NOTA: A palavra ação aqui significa realizar um experimento completo (ou seja, incluir todas as etapas necessárias para realizar uma medição de placa).</li>
	<li>Especifique as condições para uma única medição redonda (ou seja, o comprimento do período de luz/escuridão).</li>
	<li>Ao clicar em Gerar Lista , defina os intervalos de tempo entre as rodadas de medição. Escolha o horário em que a rodada começará e terminará (4 h no total) e os intervalos entre as rodadas (na configuração atual, uma rodada a cada 2 min).</li>
	<li>Clique em Gerar e verifique se o período de tempo e os intervalos entre os impulsos de luz estão corretos, verificando a lista gerada no lado esquerdo da tela.</li>
	<li>Escolha o protocolo de medição (Figura 2 Suplementar). Salve todas as modificações no banco de dados para referência futura.</li>
	<li>Pouco antes do início da medição, use luz verde de baixa intensidade (ver Tabela de Materiais) dentro da sala escura e ajuste o nível da prateleira dentro da câmara de medição ou execute outras etapas de preparação antes de remover a folha da placa de Petri. Em seguida, desligue a luz e transfira as placas para a câmara de medição na escuridão completa.</li>
	<li>Retire cuidadosamente a folha de alumínio que cobre a placa de Petri que contém as mudas de 4 dias de idade. Coloque a placa de Petri horizontalmente dentro da câmara de medição do dispositivo. Dentro da câmara, induzir pulsos de luz actínica, e realizar imagens de acordo com o plano de experimento (ações) definido nas etapas 3.1-3.7. OBS: É fundamental evitar qualquer iluminação das placas com mudas antes de colocá-las na câmara de medição. A manipulação com a placa com as plântulas etioladas deve ser realizada na sala/câmara escura (para um possível arranjo experimental ver Figura 3 Suplementar).</li>
</ol>4. Extração e análise dos dados
<ol><li>Depois de concluir a medição, abra o experimento correspondente no software do analisador.</li>
	<li>Para analisar a fluorescência das mudas, gere dois tipos de máscaras - uma máscara áspera (bandeja) que cobre a área onde as mudas estão localizadas, e uma máscara precisa (planta) que cobre apenas o tecido de interesse (tipicamente cotilédones).</li>
	<li>Gere uma máscara de bandeja clicando na opção Criar novo tipo de bandeja . Atribua os nomes de genótipos apropriados às respectivas áreas na imagem da placa.</li>
	<li>Para atribuir genótipo, escolha um número de imagem em Round e clique em Load Image na parte superior da tela. A imagem da placa será mostrada na tela. Ao clicar em qualquer um dos conjuntos de botões que representam diferentes ferramentas de desenho de formas (Figura Suplementar 4), entre no Novo Modo de Forma que permite desenhar a área de interesse na imagem da placa. Escolha as áreas necessárias (por exemplo, diferentes genótipos na placa) e forneça sua nomenclatura apropriada.</li>
	<li>Clique em Esc para sair do modo de forma. Salve a máscara de bandeja gerada (depois de fornecer um nome para ela) clicando em Armazenar Tipo de Bandeja.</li>
	<li>Volte uma etapa e aplique a máscara que foi gerada nas etapas anteriores selecionando seu nome na opção Alterar por tipo de bandeja .</li>
	<li>Para gerar máscara de planta com alta precisão, utilize a imagem adquirida após 180 min de medição (round 91) para definir o valor mínimo de intensidade do sinal de fluorescência, possibilitando a subtração do ruído de fundo. Para isso, remova o tick do Auto Threshold e defina um Limite Manual em 0 (Figura 4 Suplementar).</li>
	<li>Clique em Visualizar para garantir que a máscara da bandeja cubra todas as áreas necessárias (genótipos) na imagem da placa. Para isso, escolha a rodada 91 e clique em Atualizar visualização.</li>
	<li>Entre no menu Executar clicando em Executar. Execute a análise exclusivamente para a rodada 91, colocando um tick apenas na rodada 91. Em seguida, escolha o caminho de saída e clique em Iniciar análise.</li>
	<li>Após a conclusão da análise, o menu Concluir será aberto automaticamente. Escolha a rodada executada (será a única) dos experimentos e clique em Alternar Analisador para Dados Analisados para exportar os dados para este ponto de tempo específico (rodada 91).</li>
	<li>Extraia o arquivo .xsel do arquivo exportado, pois esse arquivo contém as informações essenciais da máscara de planta clicando no ícone Abrir Parte de Exportação .</li>
	<li>Reabra o experimento clicando no ícone Abrir Parte de Análise Local . Entre no menu do Construtor de Máscaras novamente, clique em Carregar Imagem, escolha a rodada 1 e, em seguida, Carregar do Arquivo no canto superior direito da tela e carregue o arquivo .xsel extraído anteriormente. A imagem da placa será mostrada com a máscara da bandeja aplicada.</li>
	<li>Salve a máscara clicando em Armazenar Tipo de Bandeja e aplique-a selecionando seu nome na opção Alterar por Tipo de Bandeja .</li>
	<li>Gere a máscara de planta ajustando o limiar de intensidade do sinal de fluorescência. Aumente o valor de Limiar Manual até que a máscara gerada no menu Visualizar se ajuste perfeitamente à ROI (por exemplo, cotilédones) em cada um dos genótipos (Figura Suplementar 4). Verifique se a máscara se encaixa em todas as rodadas das medidas rolando ao longo das rodadas (verificar o posicionamento adequado da máscara nas rodadas 1, 61 e 121 deve ser suficiente) no menu Visualização .</li>
	<li>Realizar a análise para todas as rodadas de medição e exportar dados. NOTA: O arquivo de saída inclui valores de fluorescência de clorofila de um determinado genótipo para cada ponto de tempo, permitindo a construção de gráficos de escolha e facilitando a avaliação estatística adicional.</li>
</ol>

Imagem de alta resolução da biossíntese de clorofila em mudas de Arabidopsis

<ol>
	<li>Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomorphogenesis.">Photomorphogenesis.</a> Arabidopsis Book. 10, e0147 (2012).</li><li>Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+chlorophyll+biosynthesis--the+challenge+to+survive+photooxidation.">Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation.</a> Cell. 86 (5), 703-705 (1996).</li><li>Heyes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocatalysis+as+the+'master+switch'+of+photomorphogenesis+in+early+plant+development.">Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development.</a> Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).</li><li>Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+extraction+methods+that+prevent+the+artifactual+conversion+of+chlorophyll+to+chlorophyllide+during+pigment+isolation+from+leaf+samples.">Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples.</a> Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).</li><li>Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+estimation+of+chlorophyll+a,+b+and+carotenoid+content+by+deconvolution+of+the+absorption+spectrum+and+new+simultaneous+equations+for+chl+determination.">Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination.</a> Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).</li><li>Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+chlorophyll-a+and+chlorophyll-b+by+simultaneous+multicomponent+spectrophotometry.">Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry.</a> Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).</li><li>Balakhonova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ireencam:+Automated+imaging+system+for+kinetic+analysis+of+photosynthetic+pigment+biosynthesis+at+high+spatiotemporal+resolution+during+early+deetiolation.">Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation.</a> Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).</li><li>Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+chlorophyll+formation+in+relation+to+structural+changes+in+chloroplasts.">The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts.</a> Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).</li><li>Reinbothe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+biosynthesis:+Spotlight+on+protochlorophyllide+reduction.">Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction.</a> Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).</li><li>Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+arabidopsis+thaliana.">Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana.</a> Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).</li><li>Wang, Y., Folta, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+green+light+to+plant+growth+and+development.">Contributions of green light to plant growth and development.</a> Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).</li><li>Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+plants+and+algae.">Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae.</a> Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).</li><li>Pipitone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+analysis+reveals+two+distinct+phases+of+chloroplast+biogenesis+during+de-etiolation+in+arabidopsis.">A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis.</a> eLife. 10, e62709 (2021).</li><li>Stirbet, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relation+between+the+kautsky+effect+(chlorophyll+a+fluorescence+induction)+and+photosystem+ii:+Basics+and+applications+of+the+ojip+fluorescence+transient.">On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient.</a> J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).</li><li>Kupper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ojip+chlorophyll+fluorescence+kinetics+and+q(a)+reoxidation+kinetics+by+direct+fast+imaging.">Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging.</a> Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).</li><li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation.">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li><li>K&#243;sa, A., Preininger, &. #. 2. 0. 1. ;., B&#246;ddi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+deficiency+hinders+etioplast+development+in+stems+of+dark-grown+pea+(pisum+sativum)+shoot+cultures.">Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures.</a> Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+method+to+estimate+the+chlorophyll+content+of+arabidopsis+seedlings.">A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings.</a> Plant Met. 13 (1), 26 (2017).</li><li>P&#233;rez-Patricio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+method+for+estimating+the+chlorophyll+contents+in+plant+leaves.">Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves.</a> Sensors. 18 (2), 650 (2018).</li><li>Spyroglou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+models+as+a+tool+for+comparing+groups+of+time+series+in+plant+sciences.">Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences.</a> Plants (Basel). 10 (2), (2021).</li><li>Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapyrrole+metabolism+in+arabidopsis+thaliana.">Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145 (2011).</li><li>De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+hormonal+regulation+of+plant+growth+and+development.">Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development.</a> Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).</li><li>Liu, X., Li, Y., Zhong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+light+and+plant+hormones+in+the+control+of+arabidopsis+seedling+chlorophyll+biosynthesis.">Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis.</a> Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).</li></ol>

Z.B. e K.P. são funcionários da PSI e Martin Trtilek é CEO e proprietário da empresa PSI que produz o iReenCAM. Todos esses autores estiveram envolvidos no desenvolvimento do instrumento conforme descritoanteriormente7.

Etapas críticas do protocolo e solução de problemas - sem luz e cuide da máscara Como destacado diretamente na descrição do protocolo acima, evitar até mesmo as quantidades residuais de luz, tanto durante o cultivo de mudas de plantas etioladas ou pouco antes de iniciar o protocolo, é de fundamental importância11. Em nossa configuração, usamos uma câmara escura dedicada localizada no phytotron walk-in e separada do resto do phytotron com porta giratória à prova de...

A desetiolação representa a fase mais dramática do ciclo de vida das plantas, caracterizada por uma série de alterações morfológicas e rearranjo completo do metabolismo vegetal (de hetero para autotrópico)1. A biossíntese de clorofila é uma característica da desetiolação induzida pela luz em plantas e um processo muito dinâmico. A formação de clorofila a partir de protoclorofilida precursora produzida no escuro deve ser fortemente coordenada para evitar danos causados por subprodutos reativos2. A redução do protoclorofilide a clorofilida é catalisada por protoclorofilídeos oxidorredutases (PORs) dependentes de luz, enzimas únicas ativadas diretamente pela luz. A reação é muito rápida, ocorrendo da ordem de ms as 3, levando ao acúmulo reconhecível de clorofila em poucos minutos após a irradiação das plântulas etioladas 4,5,6. É necessário mais tempo (de horas a dias) para que a biogênese dos cloroplastos estabeleça um aparelho fotossintético totalmente funcional3.
Existem vários métodos para analisar o teor de clorofila, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou espectrofotometria. Usualmente, essas técnicas exigem a destruiçãodo tecido vegetal4,5,6, restringindo a determinação de alterações nos níveis de clorofila ao longo do tempo. Métodos que permitam o estabelecimento de cinética não invasiva da clorofila podem abrir uma nova perspectiva para o estudo de plantas em diversos aspectos, desde questões fundamentais de pesquisa, como a análise do processo de síntese de clorofila no tempo e no espaço, até aplicações mais práticas, como a avaliação da tolerância ao estresse ou do efeito de bioestimulantes sobre a cinética da clorofila. Diante disso, foi introduzido um sistema de monitoramento da formação de clorofila, o iReenCAM7. Ele incorpora uma câmera CCD, filtros de emissão, fontes de luz e uma tubulação para análise automatizada de fluorescência (Figura 1). A principal característica do dispositivo desenvolvido é a alta resolução espacial e temporal, desempenho superior nos parâmetros utilizados nas abordagens atuais, sensibilidade e especificidade suficientes quando comparado aos métodos analíticospadrão7.
O procedimento não-invasivo aqui descrito requer reagentes mínimos e compreende etapas simples, permitindo obter um perfil cinético de clorofila em mudas vivas de Arabidopsis durante estágios muito iniciais de desetiolização. O protocolo pode ser útil para o estudo de processos altamente dinâmicos de síntese de clorofila influenciados pelo número de fatores, tanto exógenos (sal, seca, bioestimulantes, metais pesados, etc.) quanto endógenos (tipicamente associados a alterações na atividade gênica) na origem, sem a necessidade de desprendimento de qualquer tecido vegetal, evitando assim estresse adicional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-benzylaminopurine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>B0904.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z691577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana Col-0 seeds</td>
			<td>NASC collection</td>
			<td>N1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation chamber</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethilsulfoxid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>042780.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iReenCAM device</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>custom made/prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305170-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow box</td>
			<td>UniGreenScheme</td>
			<td>ITEM-31156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch</td>
			<td>3M Science. Applied to Life</td>
			<td>7000006085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M Science. Applied to Life</td>
			<td>7100225115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osram lumilux green l18w/66</td>
			<td>Ovalamp</td>
			<td>200008833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z617679-240EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1000 &#956;L, Axygen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYT1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Plant Screen Data Analyzer software</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>delivered as a part of the iReenCAM</td>
		</tr>
	</tbody>
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non-invasive assay for chlorophyll biosynthesis kinetics determination during early stages of arabidopsis de-etiolation

A biossíntese de clorofila é uma marca da desetiolação, uma das fases mais dramáticas do ciclo de vida das plantas. O processo rigidamente controlado e altamente dinâmico de biossíntese de clorofila é desencadeado durante a mudança do escuro para a luz em plantas com flores. No momento em que as plântulas etioladas são expostas aos primeiros vestígios de luz solar, a rápida conversão (em ordem de segundos) de protoclorofilida em clorofilida é mediada por complexos proteicos únicos que aceitam a luz, levando através de etapas metabólicas subsequentes à produção de clorofila totalmente funcional. As técnicas padrão para análise do teor de clorofila incluem a extração de pigmentos de tecidos vegetais destacados, o que não se aplica ao estudo de processos tão rápidos. Para investigar a cinética da clorofila in vivo com alta acurácia e resolução espaço-temporal nas primeiras horas após a desetiolação induzida pela luz, um instrumento e um protocolo foram desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento detalhado desenhado para quantificação estatisticamente robusta de clorofila nos estágios iniciais da desetiolação de Arabidopsis .

De-etiolation represents the most dramatic phase in the plant life cycle, characterized by a number of morphological changes and complete rearrangement of plant metabolism (from hetero- to auto-tropic)1. Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of light-induced de-etiolation in plants and a very dynamic process. Formation of chlorophyll from dark-produced precursor protochlorophyllide must be tightly coordinated to avoid damage due to reactive byproducts2. The protochlorophyllide reduction to chlorophyllide is catalyzed by light-dependent protochlorophyllide oxidoreductases (PORs), unique enzymes activated directly by light. The reaction is very fast, taking place in the order of ms to s3, leading to recognizable chlorophyll accumulation within minutes after etiolated seedling irradiation4,5,6. More time (from hours to days) is required for chloroplast biogenesis to establish a fully functional photosynthetic apparatus3.
Various methods exist to analyze chlorophyll content, including high-performance liquid chromatography (HPLC) or spectrophotometry. Usually, these techniques demand the destruction of plant tissue4,5,6, restricting the determination of changes in chlorophyll levels over time. Methods allowing non-invasive chlorophyll kinetics establishment may open a whole new perspective to study plants in diverse aspects ranging from fundamental research questions, such as analyzing the process of chlorophyll synthesis in time and space, to more practical applications, such as assessment of stress tolerance or effect of biostimulants on the chlorophyll kinetics. Considering this, we introduced a system for monitoring chlorophyll formation, iReenCAM7. It incorporates a CCD camera, emission filters, light sources, and a pipeline for automated fluorescence analysis (Figure 1). The main feature of the developed device is high spatial and temporal resolution, outperforming in the parameters used in current approaches, and sufficient sensitivity and specificity when compared with standard analytical methods7.
The non-invasive procedure described here requires minimum reagents and comprises simple steps, allowing to obtain a chlorophyll kinetics profile in living Arabidopsis seedlings during very early stages of de-etiolation. The protocol can be useful for the study of highly dynamic process of chlorophyl synthesis influenced by number of factors, both exogenous (salt, drought, biostimulants, heavy metals, etc.) and endogenous (typically associated with changes in the gene activity) in origin without a need to detach any plant tissue, thus avoiding additional stress.

Autor em destaque: medição não invasiva de alta resolução da síntese de clorofila durante o desestiolamento

Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Chlorophyll synthesis is a highly dynamic process. Therefore, the ability to measure it with high time and spatial resolution is necessary. We are proposing a highly accurate method that allows us to trace chlorophyll synthesis in vivo during the first hours of de-etiolation.Normally, chlorophyll is measured by high performance liquid chromatography or spectrophotometry. Also, new optical methods are being proposed for chlorophyll measurement. Chlorophyll synthesis is a very fast process that is triggered by minute traces of light in order of seconds.Recent approaches are mostly invasive, require tissue disintegration, making it difficult to accurately quantify the highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis as sufficient time resolution, We were able to determine chlorophyll kinetics in living etiolated seedlings after the first pulse of light, and during the next four hours with high time and spatial resolution. The high precision and statistical robustness of our approach allowed us to study the effects of various factors during individual stages of de-etiolation. It is a non-invasive method with high accuracy and spatial resolution, opening new opportunities for further research, including studies of the possible impact of stress or biostimulants.Thanks to its relatively high throughput, it can also be used in forward genetics to clarify the highly complex process of plant de-etiolation.

O resultado típico obtido usando o procedimento recém-desenvolvido em mudas de Arabidopsis desetioladas de 4 dias de idade do tipo selvagem (WT), ecótipo Columbia-0 (Col-0) é mostrado na Figura 3. Sob condições de controle (meio MS suplementado com DMSO), a curva biossintética da clorofila inicia-se com uma explosão inicial da síntese de clorofila, na qual o pool de protoclorfilídeos sintetizado durante a fase escotomorfogênica do crescimento é rapidamente convertido em ...

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Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

A síntese de clorofila é um processo altamente dinâmico. Portanto, a capacidade de medi-lo com alta resolução temporal e espacial é necessária. Estamos propondo um método altamente preciso que nos permite rastrear a síntese de clorofila in vivo durante as primeiras horas de desetiolização.Normalmente, a clorofila é medida por cromatografia líquida de alta eficiência ou espectrofotometria. Além disso, novos métodos ópticos estão sendo propostos para a medição da clorofila. A síntese de clorofila é um processo muito rápido que é desencadeado por minúsculos traços de luz na ordem de segundos.Abordagens recentes são em sua maioria invasivas, requerem desintegração tecidual, dificultando a quantificação precisa do processo altamente dinâmico de biossíntese de clorofila como resolução temporal suficiente, Conseguimos determinar a cinética da clorofila em plântulas vivas etioladas após o primeiro pulso de luz, e durante as quatro horas seguintes com alta resolução temporal e espacial. A alta precisão e robustez estatística de nossa abordagem nos permitiu estudar os efeitos de vários fatores durante estágios individuais de desetiolação. É um método não invasivo, com alta acurácia e resolução espacial, abrindo novas oportunidades para novas pesquisas, incluindo estudos sobre o possível impacto do estresse ou de bioestimulantes.Graças ao seu rendimento relativamente alto, ele também pode ser usado em genética avançada para esclarecer o processo altamente complexo de desetiolação de plantas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

459 visualizações.  Masaryk University. A síntese de clorofila é um processo altamente dinâmico. Portanto, a capacidade de medi-lo com alta resolução temporal e espacial é necessária. Estamos propondo um método altamente preciso que nos permite rastrear a síntese de clorofila in vivo durante as primeiras horas de desetiolização.Normalmente, a clorofila é medida por cromatografia líquida de alta eficiência ou espectrofotometria. Além disso, novos métodos ópticos estão sendo propostos para a medição da clor...

Vídeo: Autor em destaque: medição não invasiva de alta resolução da síntese de clorofila durante o desestiolamento

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.