Ringraziamo Philipp Denninger aiuto con video di preparazione e Bhavna Chaudhuri per la fornitura di linee di piante che esprimono FRET sensori. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti della National Science Foundation (MCB 1.021.677), il Dipartimento dell&#39;Energia (DE-FG02-04ER15542) al WBF, il National Institutes of Health, e la Howard Hughes Medical Institute a SRQGG è stato sostenuto da un lungo EMBO termine borsa di studio. MM è stato sostenuto dalla Alexander von Humboldt Foundation.

Nota: eseguire tutte le fasi fasi preparatorie in condizioni sterili. 1. Preparazione del Coni in plastica per germinazione dei semi <ol><li> Riempire a 10 centimetri capsula Petri con terreno di coltura contenente 1% di agar a uno spessore di 5 mm. Usiamo un punto di forza un mezzo modificato Hoagland media 4, ma la composizione media dovrebbe essere scelto in base alle singole esigenze sperimentali. </li><li> Mentre il mezzo è ancora liquido, utilizzare una pipetta multicanale per riempire puntali 10 microlitri con 5 microlitri di terreno dalla piastra di Petri. </li><li> Conservare le punte piene nella casella di punta della pipetta fino a quando il terreno è solido, quindi tagliare a 4 coni di plastica mm di lunghezza e mettere in piedi in una capsula di Petri contenente terreno solido di crescita. </li></ol> 2. Germinazione dei semi e la crescita delle piantine <ol><li> Surface sterilizzare semi in 5% NaOCl per 5 min, lavare tre volte con acqua sterile, quindi inserire un singolo seme sopra l&#39;del mezzo-riempita conos. </li><li> Sigillare il piatto con del nastro Micropore (3M) e conservare a 4 ° C per sincronizzare la germinazione. </li><li> Dopo tre giorni, trasferire i piatti per un armadio di crescita per iniziare la germinazione. Le nostre condizioni di crescita sono 23 ° C ad una 16h ciclo di alta light/8h scuro (intensità luminosa: 100 μE m -2 s -1). </li><li> Tra il 5 e 7 giorni dopo la germinazione, le piantine devono essere pronti per il trasferimento al RootChip. A questo punto, punte delle radici dovrebbe essere vicino ai scarichi di fondo dei coni di plastica. Controllare la salute piantina, lunghezza radice e, se del caso, espressione di un marcatore fluorescente sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Segna singole piantine per il trasferimento sul chip. Selezionare una decina di piantine nel caso in cui uno è danneggiato durante il trasferimento. </li></ol> 3. Trasferimento di piantine sul RootChip <ol><li> Per sterilizzare il RootChip per esperimenti a lungo termine, avvolgereil dispositivo in carta velina, posto in un piatto di vetro Petri, e autoclave. </li><li> Una volta che il RootChip si è raffreddato, coprire con terreno di coltura liquido. Il RootChip dovrebbe essere completamente immerso, ma il livello del liquido dovrebbe essere non più di 3 mm dalla superficie RootChip. </li><li> Con una pipetta 20 microlitri, tirare mezzo attraverso l&#39;ingresso e uscita della camera principale per riempire la camera di osservazione con il terreno. </li><li> Coni di plastica Plug selezionato al punto 2.5 in RootChip le insenature. I coni devono adattarsi comodamente alle bocche di porto. Poiché il RootChip è montato su uno strato sottile di vetro ottico, non applicare una pressione eccessiva al chip. </li><li> Incubare la RootChip notte in mezzo liquido. Per evitare galleggiante, posizionare due lastre di vetro sul chip. Aggiungere una barra di agitazione magnetica e chiudere il piatto. </li><li> Trasferire l&#39;assemblea a un agitatore magnetico e agitare delicatamente il mezzo. </li><li> Il insenature RootChip si incrociano i canali in un angolo di 30 ° al dispositivo normale FACIlitate crescita delle radici nei canali (Figura 1A). Per supportare ulteriormente la crescita nella direzione desiderata, inclinare leggermente il gruppo inserendo un vetrino sotto la capsula di Petri sul lato opposto del circuito delle uscite. </li><li> Per mantenere il ciclo luce / buio, illuminare le piante con una lampada anello (intensità luminosa: 100 μE m -2 s -1) collegato a un timer. </li></ol> 4. Collegamento del RootChip al Vettore <ol><li> Il giorno seguente, riempire un sigillabile, fiala pressurizzabile con terreno di coltura liquido (Figura 1B). </li><li> Capovolgere il chip carrier e posizionarlo su una superficie stabile. Rimuovere il RootChip dal mezzo liquido e inserirla lato PDMS basso nell&#39;apertura inferiore del chip carrier. Orient il chip in modo che il lato che contiene le bocche di controllo di livello è di fronte al lato dei connettori pressione tubi linea nella parete laterale vettore. </li><li> Essiccare il vetro di copertura sulfondo del chip delicatamente blotting con carta velina. Fissare il RootChip al vettore con nastro ea destra tutta l&#39;assemblea. </li><li> Connettori tubi sono ottenuti tagliando tubo flessibile in plastica microbore (TYGON, 0.20 &quot;ID x 0.060&quot; OD) in pezzi lunghi 5 cm e il collegamento a tubi in acciaio inox microbore (New England piccolo tubo, 0.025 &quot;OD x 0,013&quot; ID x 0,75 &quot; lungo). Riempire i connettori tubi con acqua utilizzando una siringa e spina ciascun connettore tubo nell&#39;ingresso corrispondente livello di controllo sul chip. L&#39;acqua poi riempire i canali di controllo di livello e possono essere usate per trasmettere la pressione alle valvole micromeccanica. </li><li> Inserire le estremità opposte delle linee nei supporti / flacone soluzione (s). Applicare pressione sul flacone della soluzione con una siringa d&#39;aria. L&#39;incremento della pressione dell&#39;aria all&#39;interno della fiala soluzione forzerà liquida nelle linee. </li></ol> 5. Montaggio del RootChip al microscopio <ol><li> Posizionare il vettore sul microscfase di Ope. Per ridurre la possibilità del Gruppo di cambio nel corso dell&#39;esperimento a causa delle vibrazioni nella camera, il vettore deve adattarsi esattamente nelle tacche dell&#39;inserto stadio. </li><li> Le valvole di chip e il flusso del fluido attraverso il chip sono controllati dalla pressione dell&#39;aria. Due linee con regolatori sono ramificati fuori di una linea di pressione principale - uno viene utilizzato per controllare il flusso medio attraverso i canali, e l&#39;altro è collegato ad sfiati elettrovalvole che azionano le valvole push-up del livello di controllo. Le elettrovalvole sono azionate dal computer attraverso la valvola USB controller (sviluppato da Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Chiudere entrambi i regolatori di pressione prima di collegare il chip. </li><li> Aggiungere alcuni ml di acqua ai serbatoi del vettore per mantenere l&#39;alto tasso di umidità all&#39;interno del gruppo. Questa operazione deve essere ripetuta nel corso di lunghi esperimenti per mantenere le piante si secchino. Mantenere il volume basso per ridurre al minimo tegli quantità di liquido che potrebbe essere versato sul microscopio. Per esperimenti a lungo termine, il deflusso dai punti vendita di chip possono essere guidati nei serbatoi del vettore collegando i punti vendita di chip per i serbatoi con tubi microbore (vedi punto 4.4). In alternativa, il deflusso che si accumula sulla superficie del chip possono essere raccolti per pipettamento. </li><li> Preparare fogli a quadretti di plastica trasparente da protezioni in lamiera (C-Line). Fissare la plastica trasparente per il vettore da nastro biadesivo per mantenere l&#39;umidità elevata nel gruppo. </li><li> Posizionare la luce ad anello sopra il chip e mantenere il ciclo luce / buio. La luce &#39;anello deve essere spento prima dell&#39;inizio di ogni esperimento che utilizza marcatori fluorescenti, come l&#39;illuminazione diretta interferisce con collezione di immagini. </li></ol> 6. Funzionamento del RootChip utilizzando l&#39;interfaccia LabView L&#39;interfaccia di controllo RootChip per la piattaforma software LabVIEW è in gradoessere scaricato dal nostro sito <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Le valvole sul chip sono chiusi applicando pressione al livello di controllo, in questo caso aprendo le elettrovalvole aria. L&#39;interfaccia di controllo consente l&#39;attivazione delle valvole facendo clic sul pulsante qui sotto il numero della valvola. Verde brillante indica applicazione di pressione e la chiusura di una valvola di chip (Figura 2B). Attivare tutte e tre le soluzioni, le valvole di aspirazione a l&#39;interfaccia di controllo prima di aprire i regolatori di pressione. Nota: L&#39;interfaccia di controllo dispone di un anello di retroazione, che consente il monitoraggio dello stato del sistema. Questa funzione può essere attivata facendo clic sul pulsante &quot;rilettura&quot; nell&#39;interfaccia controller. </li><li> Aprire il regolatore di pressione per il livello di controllo ed inizialmente è impostato a 15 psi, quindi aprire il regolatore per il livello di flusso e inizialmente impostata a 5 psi. DipendenzaDing sulla portata desiderata, le pressioni possono essere regolato in seguito. </li><li> Aprire la valvola di aspirazione per mezzo di crescita di scelta per lavare le camere con il terreno. </li><li> Controllare percorsi di flusso sotto il microscopio. Tipicamente, aria viene intrappolata nei canali di flusso e deve essere rimosso. Inoltre, i canali del livello di controllo contengono ancora aria che deve essere forzata e sostituito dal l&#39;acqua dai connettori di tubi (morto-end riempimento). Entrambi i compiti vengono raggiunti da lavaggio ciascuno degli otto volte più camere (5 psi) fino a quando tutta l&#39;aria viene forzata dai canali nel PDMS (&quot;degasaggio&quot;). Nota: L&#39;interfaccia di controllo può essere programmato per automatizzare esperimenti. Routine può anche essere utilizzato per degassare il chip. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Lo scopo principale del RootChip è di combinare una piattaforma di imaging e un sistema di perfusione in un unico dispositivo con un elevato livello di integrazione. Per dimostrare la manipolazioneil microambiente di radici arrossimmo le camere con colorante alimentare scuro (diluizione 1:4 in ambiente idroponico) e misurato lo scambio di fluido all&#39;interno delle camere. Alla pressione raccomandata di 5 psi abbiamo misurato uno scambio completo entro 10 secondi ad una portata calcolata di circa 1,5 microlitri / min (Figura 3). Abbiamo osservato inoltre la crescita delle radici di piante, in questo caso coltivati ​​al buio e fornito con 10 mM di glucosio come fonte di energia esterna (Figura 4). A seconda delle condizioni di crescita quali la luce e la composizione del mezzo, le piante possono essere osservato nel RootChip per un massimo di tre giorni. La RootChip è stato usato per monitorare i livelli di glucosio e galattosio intracellulare in radici esprimono nanosensori geneticamente codificati, basato sul trasferimento di Förster Resonance Energy (FRET) 5-7. Radici nel chip sono stati perfusi con impulsi quadrati o soluzione di glucosio galattosio ( <strong&gt; Figura 5). I livelli intracellulari di zuccheri sono stati monitorati e sono mostrati qui espresso come rapporto dell&#39;intensità della Citrine fluoroforo accettore all&#39;intensità del ECFP donatore. L&#39;aumento nel rapporto indica accumulo di zucchero. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. RootChip principio. <ol class="ualpha"><li> Il RootChip dispone di otto camere di osservazione per la crescita e l&#39;imaging di radici. I semi germinano prima in coni di plastica - fabbricato da puntali di plastica - che sono pieni di terreno solido. La punta radice cresce attraverso il mezzo e raggiunge la camera in cui un flusso continuo di liquido mantiene le condizioni nella camera costante. Valvole di micromeccanica (rosso) controllare il flusso. Il chip è montato su un vetro di copertura ottico. Disegno non in scala. (Adattato con il permesso di Grossmann et al., 2011 Plant Cell). </li><li> Scheme di una fiala di soluzione pressurizzabile con membrana (rosso). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Collegamento e montaggio del RootChip. <ol class="ualpha"><li> Vista dall&#39;alto del RootChip completamente connessa e il supporto montato su un microscopio invertito. </li><li> Schema illustrante il sistema di otturatore e l&#39;interfaccia di controllo. Un esempio di una valvola di taratura per guidare il flusso di fluido ad una singola camera è mostrato. Mentre valvole 4 a 8 funge da valvola singole, valvole da 0 a 3 atto a gruppi. Con questo sistema una camera singola possono essere affrontate attivando una combinazione di valvole. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Scambio di soluzioni nel ch osservazioneambre. visualizzazione dello scambio di fluido in una camera di osservazione usando soluzione colorante. L&#39;immagine è una sovrapposizione di campo chiaro e falsi colori intensità del segnale colorante. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. On-Chip crescita delle radici. Osservazione di una singola radice crescente esprimere una fluorescente FRET nanosensori di glucosio / galattosio nel corso di 20h. Formato ora: hh: mm, barra di scala: 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Misura i livelli di zucchero intracellulari mediante FRET nanosensori. <ol class="ualpha"><li> La quantità di sensore viene indicato come intensità citrino all&#39;interno della punta della radice (a sinistra). La risposta del intracellulare FRET nanosensori all&#39;applicazione di glucosio o galattosio soluzione è mostrata come immagini raziometrici. (Adattato con il permesso di Grossmann et al., 2011 Plant Cell) bar Scala:. 100 um. </li><li> Analisi FRET rapporto cambia in risposta a tre impulsi ripetuti quadrati di glucosio (verde) e galattosio (rosso). </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I vantaggi principali del RootChip rispetto ai metodi convenzionali di crescita sono la preparazione minimamente invasivo per la microscopia, la capacità di alterare reversibilmente e ripetutamente l&#39;ambiente radice, e la capacità di osservazione continua di tessuto evolutivamente competente e fisiologicamente sano per un periodo di diversi giorni. In precedenza, piantine sono state cresciute verticalmente su supporti gelificati e trasferiti ad un sistema di perfusione immediatamente prima dell&#39;esperimento, che ha consentito solo misurando radici uno alla volta 8. Strumenti microfluidici sono stati utilizzati per Arabidopsis, ma su un livello di integrazione basso 9 o senza controllo perfusione 10. Il RootChip combina un elevato livello di integrazione con la possibilità di automatizzare gli esperimenti attraverso l&#39;orientamento del flusso preciso. Un altro vantaggio di questa piattaforma, caratteristica di tutti i dispositivi microfluidici 11, è che solo quantità minime di liquido sono tenuti a fornire alla radice con il dado necessariaRients, anche per gli esperimenti che coprono diversi giorni. Il RootChip è attualmente concepito come un dispositivo monouso, ma dal momento che i costi di produzione di chip sono bassi, le piccole quantità di reagenti consumati rende il chip ancora molto conveniente. Ci sono alcuni punti critici che devono essere adottate per garantire la salute delle piantine: Il volume dei coni di plastica è solo ul 3-4, che inizierà ad asciugare se esposto all&#39;aria. Quindi è importante che i coni vengono trasferiti sul chip rapidamente e l&#39;umidità è mantenuta alta fino a quando le radici hanno raggiunto le camere di osservazione, che li alimentano con acqua sufficiente. Passi 4.2 a 4.5 devono essere eseguite in modo rapido e senza interruzioni per evitare l&#39;essiccazione delle piantine. Passi 3.5 - 3.8 descrivono l&#39;incubazione del chip in mezzi liquidi durante il quale le radici crescono nelle camere di osservazione. Questo passaggio può essere saltato montando il chip nel carrier immediatamente e partendo perfusione costante con terreno di crescita. Tuttavia, si consiglia ammollo nel mezzo di crescita per tutta la notte, in quanto ha alcuni vantaggi: 1) crea un ambiente umido in modo che le piantine sono meno probabilità di diventare essiccata man mano che crescono nella camera di osservazione; 2) il chip è imbevuta di liquido, in modo degassamento (step 6.4) sarà più veloce. E &#39;importante utilizzare supporti con basse concentrazioni di soluto. Le soluzioni più concentrate possono precipitare e intasare i canali, specialmente se il chip viene utilizzato per diversi giorni. Una volta che il dispositivo è collegato alla linea di pressione dell&#39;aria, il flusso del fluido è controllata regolando la pressione idraulica nelle valvole. Per garantire la corretta chiusura delle valvole micromeccanici, è importante scegliere una pressione di comando che è circa tre volte superiore alla pressione del flusso. La pressione del flusso non deve superare i 15 psi come il fluido verrà spinto fuori delle bocche di radice. Pressioni più elevate ragazzoy anche causare delaminazione del chip, il che rende inutilizzabile chip. Una limitazione è che RootChip PDMS è poroso e idrofobo. Mentre il materiale è praticamente inerti di soluzioni acquose, può assorbire composti organici 12. Questo può interferire con un rapido scambio di soluzioni di composti organici potrebbe fuoriuscire dal materiale, anche quando la fornitura di questo composto è stato fermato all&#39;ingresso. A causa della porosità, che utilizza solventi organici può causare gonfiore del PDMS 12. Si continua a ottimizzare il RootChip ed estendere la sua utilità, ad esempio con radici delle piante coltivate. Siamo convinti che migliorando l&#39;accesso alla radice per i trattamenti e di osservazione, strumenti come la microfluidica RootChip aprirà nuove dimensioni della ricerca root.

<table border="1"><tbody><tr><td> Articoli </td><td> Fonte </td><td> Informazioni </td></tr><tr><td> Chip carrier, software e altre informazioni. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> File CAD e CNC per la fabbricazione del vettore, il software di controllo e ulteriori informazioni sono disponibili per il download dal sito <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip~~HEAD=NNS</a> portatori possono essere ordinati anche da questo sito. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Foundry </td><td> Disegni Maschera e protocolli di fabbricazione sono disponibili su richiesta. Ready-to-use RootChips può essere ordinato presso <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip di controllo </td><td> -Casa costruita-</td><td> Il sistema automatico di controllo della valvola è stato originariamente sviluppato da Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab. Un istruzioni dettagliate su come costruire il vostro proprio controllore valvola di azionamento può essere trovato alla <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

Le funzioni principali come l&#39;ancoraggio fisico della pianta ed è l&#39;organo responsabile per l&#39;assorbimento delle sostanze nutritive e di acqua minerale, quali elementi azoto, fosforo, solfato e la traccia che acquisiscono le piante dal terreno. Se vogliamo sviluppare approcci sostenibili alla produzione di colture ad alto rendimento, abbiamo bisogno di capire meglio come la radice si sviluppa, occupa un ampio spettro di nutrienti, e interagisce con gli organismi simbiotici e patogeni. Per raggiungere questi obiettivi, dobbiamo essere in grado di esplorare le radici in dettaglio microscopico su periodi di tempo che vanno da minuti a giorni. Abbiamo sviluppato il RootChip, un polidimetilsilossano (PDMS) - dispositivo basato su microfluidica, che ci permette di crescere e radici immagini da piantine di Arabidopsis evitando qualsiasi stress fisico alle radici durante la preparazione per l&#39;imaging 1 (figura 1). Il dispositivo contiene una struttura biforcata canale dotato di valvole micromeccanici per guidare il flusso del fluidoda insenature soluzione a ciascuno degli otto camere di osservazione 2. Questo sistema permette la perfusione microambiente radice da controllare e modificato con precisione e rapidità. Il volume delle camere è di circa 400 nl, richiedendo così soltanto quantità minime di soluzione campione. Qui forniamo un protocollo dettagliato per studiare la biologia root sul RootChip utilizzando l&#39;imaging basate su approcci con la risoluzione in tempo reale. Le radici possono essere analizzati più giorni utilizzando la microscopia lasso di tempo. Roots può essere perfuso con soluzioni nutritive o inibitori, e fino a otto giovani pianta possono essere analizzati in parallelo. Questo sistema ha il potenziale per una vasta gamma di applicazioni, compresa l&#39;analisi della crescita delle radici in presenza o assenza di sostanze chimiche, basato sulla fluorescenza analisi di espressione genica, e l&#39;analisi dei biosensori, ad esempio FRET nanosensori 3.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

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19.6K Views.  Carnegie Institution for Science. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Video: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Dimostrare l&#39;Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Sintesi Nanostar oro con un metodo d&#39;argento crescita Seed Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

Correzione Drift seguente esempio 4D confocale Time-lapse imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Replica biomimetica della microstruttura superficiale della radice mediante alterazione della litografia morbida

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Imaging del flusso sanguigno con Doppler ultraveloce

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...