우리는 센서를 안달 표현 공장 라인을 제공하기위한 동영상 준비와 Bhavna Chaudhuri과 관련하여 도움이 필립 Denninger 감사드립니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (MCB 1,021,677), WBF, 국립 보건원에 에너지학과 (DE-FG02-04ER15542) 및 SRQGG에 하워드 휴즈 의학 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다하는 것은 EMBO 길이에 의해 지원되었다 교제 - 용어입니다. MM은 알렉산더 폰 훔볼트 재단에 의해 지원되었다.

참고 : 무균 조건 하에서 모든 단계 준비 단계를 수행합니다. 1. 종자 발아를위한 플라스틱 원뿔의 작성 <ol><li> 5mm의 두께로 1 %의 한천을 포함하는 성장 매체와 10cm 페트리 접시를 채우십시오. 우리는 Hoagland 매체 4를 수정한 반 강도를 사용하지만 중간 성분은 개별 실험적인 요구 사항에 맞게 선택되어야한다. </li><li> 매체가 여전히 액체이지만, 배양 접시에서 매체의 5 μl와 10 μl 피펫 팁을 채우기 위해 멀티 채널 피펫을 사용합니다. </li><li> 매체가 완성 때까지 똑바로 견고한 성장 매체를 포함하는 배양 접시에 4mm 긴 플라스틱 콘과 장소로 잘라, 피펫 팁 상자에 채워진 팁을 저장합니다. </li></ol> 2. 종자 발아와 묘목 성장 <ol><li> 5 분, 5 %의 NaOCl에 종자를 소독 표면 살균 물로 세 번 씻어 다음, 중간 채워진 원뿔의 각 상단에 하나의 씨앗 배치의. </li><li> 4에서 Micropore 테이프 (3M)와 상점과 음식을 봉쇄 ° C 발아를 동기화합니다. </li><li> 3 개월 후엔, 발아를 시작하는 성장 캐비닛에 번호판을 전송합니다. 우리의 성장 조건 16h 높은 light/8h 어두운 사이클에서 23 ° C (100 μE m -2 s의 -1 빛의 강도)입니다. </li><li> 5 칠일 발아 후 사이에, 묘목은 RootChip로 전송을위한 준비가 있어야합니다. 이때 루트 팁 플라스틱 원뿔의 아래쪽 콘센트 근처에 있어야합니다. 해부 현미경 묘목 건강, 루트 길이, 해당되는 경우, 형광 마커의 표현을 확인합니다. </li><li> 칩에 전송을위한 개별 모종을 표시한다. 케이스 하나에 10 명 이렇게 모종을 선택가 전송 중에 손상되었습니다. </li></ol> 3. RootChip쪽으로 모종의 양도 <ol><li> 장기적인 실험을위한 RootChip 멸균을 위해 싸다조직 종이, 유리 배양 접시에있는 장소, 그리고 압력솥에있는 장치. </li><li> RootChip가 냉각되면, 액체 성장 매체와 함께 다룹니다. RootChip 완전히 포장되어해야하지만, 유체 수준 RootChip 표면 위에서 더 이상 3보다 mm이어야합니다. </li><li> 20 μl 피펫으로 중간에 전망대 챔버를 채우는 루트 입구와 챔버 콘센트를 통해 매체를 당기십시오. </li><li> 플러그 플라스틱 콘은 RootChip의 inlets로 단계 2.5 선택했습니다. 콘은 inlets에 석판이 적합합니다. RootChip는 광학 유리의 얇은 레이어에 탑재되어 있기 때문에, 칩에 너무 많은 압력을 적용하지 않습니다. </li><li> 액체 배지에서 하룻밤 RootChip을 품어. 부동 방지하기 위해 칩에 두개의 유리 슬라이드를 넣습니다. 자기 볶음 표시줄을 추가하고 요리를 닫습니다. </li><li> 자기 활동가로 어셈블리를 전송하고 부드럽게 매체를 선동. </li><li> RootChip의 inlets는 faci에 정상 장치에 30 ° 각도로 채널을 교차채널 (그림 1A)에 뿌리 성장을 litate. 추가로 원하는 방향으로 성장을 지원하기 위해 콘센트의 칩 반대의 측면에서 배양 접시 아래에 유리 슬라이드를 배치하여 약간 어셈블리를 기울. </li><li> 타이머에 연결되어 : 다크 / 라이트 사이클을 유지하기 위해 링 스탠드 (100 μE m -2 s의 -1 빛의 강도)로 묘목을 캐는. </li></ol> 4. 캐리어에 RootChip 연결 <ol><li> 다음 날, 액체 성장 매체 (그림 1B)로 sealable, pressurizable 병을 채운다. </li><li> 칩 캐리어 반전하고 안정된 표면에 놓으십시오. 액체 매질에서 RootChip를 제거하고 칩 캐리어 하단의 조리개로 PDMS 측을 아래로 삽입합니다. 동양 칩은 있도록 제어 계층 inlets을 포함 측면 캐리어 측면 벽에 압력 라인 튜브 커넥터의 측면에 직면하고 있습니다. </li><li> 에 덮개 유리를 건조부드럽게 티슈로 모래 바닥에 의한 칩의 바닥. 테이프 바로 온 회중과 함께 캐리어로 RootChip를 고정합니다. </li><li> 튜브 커넥터는 5cm 길이 조각으로 유연한 플라스틱 microbore 튜빙 (TYGON, 0.20 &quot;ID X 0.060&quot;OD)을 절단하고 스테인레스 스틸 microbore 튜브 (뉴잉글랜드 작은 튜브, 0.025 &quot;OD X 0.013&quot;ID X 0.75 &quot;로 연결하여 만들어진다 긴). 칩 해당 컨트롤 계층 입구에 주사기 및 플러그 각 튜브 커넥터를 사용하여 물로 튜브 커넥터를 채우십시오. 물이 나중에 컨트롤 레이어 채널을 채울 것이며 micromechanical 밸브에 압력을 전송하는 데 사용됩니다. </li><li> 미디어 / 솔루션 유리병 (들)에 라인의 반대편 끝을 연결합니다. 공기 주사기와 솔루션 유리병에 압력을 적용합니다. 솔루션 유리병 내에서 증가 공기 압력 라인에 액체를 강제합니다. </li></ol> 5. 현미경에서 RootChip 마운트 <ol><li> microsc에 캐리어를 놓고ope 단계. 방에 진동에 의한 실험의 과정을 통해 변화 어셈블리의 가능성을 줄이기 위해 이동 통신사 무대 인서트의 노치에 정확히 맞도록해야합니다. </li><li> 칩을 통해 칩 밸브 및 매체의 흐름은 공기 압력에 의해 제어됩니다. 규제가있는 두 개의 라인 메인 압력 라인의 오프 측쇄있다 - 하나는 채널을 통해 매체 흐름을 제어하는​​ 데 사용되며, 기타는 제어 계층의 푸쉬 - 업 밸브 행동시키다 솔레노이드 에어 밸브에 연결됩니다. 솔레노이드 밸브는 밸브의 USB 컨트롤러 (라파엘 고메즈-Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발)를 통해 컴퓨터에서 운영하고 있습니다. 칩을 연결하기 전에 두 압력 레귤레이터를 닫습니다. </li><li> 어셈블리 내의 습도를 높게 유지하기 위해 운송인의 저수지에 물을 몇 ML를 추가합니다. 이 단계 말리는에서 식물을 유지하는 이상의 실험 과정을 통해 반복해야합니다. t를 최소화하기 위해 볼륨은 줄이고현미경에 쏟았 수있는 액체의 그 금액입니다. 장기 실험은 칩 콘센트에서 유출은 microbore 튜빙 (단계 4.4 참조)와 저수지에 칩 콘센트를 연결하여 운송인의 저수지로하실 수 있습니다. 양자 택일로, 칩 표면에 축적 유출은 pipetting에 의해 수집된 수 있습니다. </li><li> 시트 보호 장치에서 투명 플라스틱 (C 라인)의 제곱 시트를 준비합니다. 어셈블리의 높은 습도를 유지하기 위해 양면 테이프로 캐리어에 투명 플라스틱을 수정합니다. </li><li> 칩 위에 링 빛을 위치와 다크 / 라이트 사이클을 유지하고 있습니다. 고리 빛이 직접 조명 이미지 컬렉션에 방해하므로, 형광 마커를 사용하는 모든 실험이 시작하기 전에 꺼져 있어야합니다. </li></ol> 6. LabView 인터페이스를 사용 RootChip 운영 LabView 소프트웨어 플랫폼을위한 RootChip 컨트롤러 인터페이스 수저희 웹 사이트에서 다운로드할 수 <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> 칩 밸브는 솔레노이드 공기 밸브를 열어이 경우 제어 계층에 압력을 적용하여 종료됩니다. 컨트롤러 인터페이스는 밸브 번호 아래의 버튼을 클릭하여 밸브의 작동이 가능합니다. 밝은 녹색 칩 밸브 (그림 2B)의 압력과 폐쇄의 응용 프로그램을 나타냅니다. 압력 레귤레이터를 열기 전에 컨트롤러 인터페이스의 세 가지 솔루션 유입 밸브를 활성화합니다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스는 시스템의 상태 모니터링을 허용 피드백 루프를 갖추고 있습니다. 이 기능은 컨트롤러 인터페이스에 &quot;Readback&quot;버튼을 클릭하면 활성화됩니다. </li><li> 제어 계층에 대한 압력 조절기를 열고 처음에 15 PSI로 설정한 다음, 흐름 계층을위한 레귤레이터를 열고 처음 5 PSI로 설정합니다. Depen원하는 유속에 땡, 압력 나중에 조정할 수 있습니다. </li><li> 매체와 챔버를 플러시하는 선택의 성장 매체의 입구 밸브를 엽니다. </li><li> 현미경 흐름 경로를 확인합니다. 일반적으로 공기 흐름 채널에 갇혀하고 제거해야합니다. 또한, 컨트롤 레이어의 채널은 여전히​​ 튜브 커넥터 (막다른 충전)을 통해서 물이 밖으로 강제하고 교체해야 공기가 포함되어 있습니다. 두 작업 모두 공기가 PDMS로 채널 ( &quot;degassing&quot;)에서 강제 때까지 8 챔버 각각의 여러 번 (5 PSI)를 플러시에 의해 달성된다. 참고 : 컨트롤러 인터페이스가 실험을 자동화하도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 이러한 루틴은 가스를 제거하다 칩에도 사용할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 RootChip의 주요 목적은 통합을 높은 수준으로 단일 장치의 이미징 플랫폼과 관류 시스템을 결합하는 것입니다. 조작을 입증하려면뿌리의 microenvironment에서 우리는 어두운 식용 색소 (인거 매체 1시 4분 희석)와 챔버 스를 플러시하고 챔버 내의 유체의 교환을 측정했습니다. 5 PSI의 권장 압력에서 우리는 약 1.5 μl / 분 (그림 3)의 계산 유량에서 10 초 이내에 전체 교환을 측정했습니다. 우리는 또한이 사건 어둠 속에서 성장하고 외부 에너지원 (그림 4)와 같은 10 MM 포도당과 함께 제공에 모종의 루트 성장을 관찰했다. 이러한 빛과 매체의 구성과 같은 성장 조건에 따라 식물의 세 일 동안 RootChip에서 볼 수 있습니다. RootChip는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 5-7을 바탕으로 유전자 인코딩 nanosensors을 표현 뿌리에서 세포내 포도당과 갈락토 오스 수치를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 칩의 뿌리는 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 사각형 펄스로 perfused되었다 ( <strong&gt; 그림 5). 설탕의 세포내 수준 모니터링되었으며 여기에 표시된 기증자 ECFP의 강도에 대한 수용체의 형광단의 황수정의 강도의 비율로 표현됩니다. 비율의 상승은 설탕의 축적을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. RootChip 원리. <ol class="ualpha"><li> RootChip은 뿌리의 성장과 이미징위한 8 개의 관측 실이 있습니다. 종자는 먼저 플라스틱 콘에서 발아 - 플라스틱 피펫 팁에서 가공 - 어떤은 고체 매체로 가득합니다. 루트 팁이 매체를 통해 성장과 액체 매체의 지속적인 흐름 챔버 상수의 조건을 유지 챔버에 도달합니다. Micromechanical 밸브 (적색)는 흐름을 제어합니다. 이 칩은 광학 커버 유리에 마운트됩니다. 확장하지 그리기. (Grossmann 외., 2011 식물 세포의 허가로 적응.) </li><li> SCH다이어프램 (적색)와 pressurizable 솔루션 유리병의 리. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 연결 및 RootChip를 장착. <ol class="ualpha"><li> 완전히 연결된 RootChip와 이동 통신사 위로보기는 거꾸로 현미경에 장착. </li><li> 제도 valving 시스템과 컨트롤러 인터페이스를 설명. 단일 챔버에 유체 흐름을 안내하는 설정 밸브에 대한 예를 나타납니다. 동안 밸브 4 싱글 밸브, 단체에서 3 행위를 통해 밸브를 0과 같은 여덟 행위를 통해. 이 시스템을 통해 개별 챔버는 밸브의 조합을 활성화하여 해결하실 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 관측 채널의 솔루션의 교환ambers. 염료 용액을 사용하여 관측 챔버의 유체의 교환의 시각화. 이미지는 명시야 및 염료 신호의 허위 색의 강도의 오버레이이다. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 온칩 루트 성장. 관측 형광등을 표현하는 하나의 성장 루트는 20h의 과정을 통해 포도당 / 갈락토 오스를위한 nanosensor 초조해. 시간 형식 : HH : MM, 스케일 바 : 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 사용하여 측정 세포 내 설탕 수준은 nanosensors을 무서워. <ol class="ualpha"><li> 센서의 금액은 루트 팁 이내 황수정 강도 (왼쪽)으로 표시됩니다. 세포 내의 반​​응은 포도당이나 갈락토 오스 솔루션의 응용 프로그램에 nanosensor이 ratiometric 이미지로 표시됩니다 초조해. (Grossmann 외로부터 허가를 적응. 2011 괞찮아가NT 셀) 규모 모음 :. 100 μm의. </li><li> 추적은 세 반복 평방 포도당의 펄스 (녹색)와 갈락토 오스 (적색)에 대한 응답으로 비율 변화를 무서워. </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

기존의 성장 방식을 통해 RootChip의 주요 장점은 현미경을위한 최소한 침략적 준비, reversibly 반복 루트 환경을 변경할 수있는 능력, 그리고 몇 일간의 기간 동안 발달 능력과 생리학적으로 건강한 조직의 지속적인 관찰을위한 용량입니다. 이전에는 모종은 gelled 미디어에 수직으로 성장되었으며 한 번에 8 시에 하나의 뿌리를 측정하는 허용 실험 직전 관류 시스템에 전송. Microfluidic 도구는 Arabidopsis에게뿐만 아니라 낮은 통합 레벨 9 또는 관류 컨트롤 열없이 사용되었습니다. RootChip 정확한 흐름지도를 통해 실험을 자동화하는 기능과 함께 통합의 높은 수준을 자랑합니다. 모든 microfluidic 장치 11 특성이 플랫폼, 또 다른 이점은 액체의 단지 최소한의 금액이 필요한 너트와 루트를 제공하는 데 필요한 것입니다심지어 며칠 걸치는 실험을위한 rients. RootChip는 현재 단일 사용 장치로 설계되어 있지만, 칩의 생산 비용이 낮은이기 때문에, 소비 시약의 소량은 여전히​​ 매우 비용 효율적인 칩을 만들 수 있습니다. 모종의 건강을 보장하기 위해 촬영해야합니다 몇 가지 중요한 단계가 있습니다 : 플라스틱 원뿔의 부피는 공기에 노출되면 건조되기 시작합니다서만 3-4 μl입니다. 따라서 그것은 원뿔이 빠르게 칩에 전송되고 뿌리가 충​​분한 물로 그들을 공급할 것입니다 전망대 챔버를 도달할 때까지 습도가 높은 유지되는 것이 중요합니다. 4.2-4.5 단계는 빠르고 모종의 건조를 방지하기 위해 중단없이 수행되어야한다. 단계 3.5-3.8는 뿌리가 관측 실로 성장하는 동안에 액체 매체 칩의 인큐베이션을 설명합니다. 이 단계는 C에 칩을 장착하여 생략 수 있습니다arrier 즉시과 성장 매체와 지속적인 관류를 시작합니다. 그것이 몇 가지 장점이있다 그러나, 우리는 하룻밤 사이에 성장 매체에 몸을 담글 좋습니다 묘목들이 관찰 챔버로 성장로서 desiccated 될 확률이 적은있다 그래야 그것이 습한 환경을 조성 1), 2) 칩은 액체에 배어 있으므로 degassing (6.4 단계)이 빠르게 될 것입니다. 그것은 낮은 용질 농도와 미디어를 사용하는 것이 중요합니다. 더 농축 솔루션은 칩은 며칠 동안 사용되고 특히, 침전 및 채널을 방해할 수 있습니다. 장치가 공기 압력 라인에 연결되면, 매체의 유량은 밸브의 유압 압력을 변경하여 제어됩니다. micromechanical 밸브의 적절한 종결을 보장하기 위해서는 유동 압력보다 약 세 배 높다 제어 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 유체가 루트 inlets에서 밀쳐되므로 유동 압력이 15 Psi를 넘지 않아야합니다. 높은 압력 mAY는 또한 칩을 사용할 수 없게를 렌더링 칩, 박리의 원인. RootChip의 제한은 PDMS는 다공성과 소수성이라는 것입니다. 자료가 수성 솔루션에 거의 불활성이지만, 그것은 유기 화합물에게 12 흡수할 수 있습니다. 이것은 유기 화합물이 화합물의 공급 장치가 입구에서 중지되었습니다에도 물질로부터 누출 수 있으므로 솔루션의 신속한 교환을 방해할 수 있습니다. 다공성으로 인해 유기 용제를 사용하면 PDMS 12 부기의 원인이 될 수 있습니다. 우리는 작물 식물의 뿌리 RootChip을 최적화하고 예를 들어, 자사의 유틸리티를 확장하는 것을 계속한다. 우리는 치료와 관찰에 대한 루트 액세스를 향상시킴으로써, RootChip 같은 microfluidic 도구 루트 연구의 새로운 차원을 열었을 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 항목 </td><td> 출처 </td><td> 안내 </td></tr><tr><td> 칩 캐리어, 소프트웨어 및 기타 정보를 제공합니다. </td><td> 카네기 연구소 - DPB </td><td> 캐리어 제조, 컨트롤러 소프트웨어 및 자세한 정보는 CAD와 CNC 파일은 웹 사이트에서 다운로드할 수 있습니다 <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip의</a> 캐리어도이 웹 사이트에서 주문할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> 스탠포드 주조 </td><td> 마스크 설계 및 제조 프로토콜은 요청시 가능합니다. 즉시 사용하기 RootChips는 주문할 수 <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> 칩 컨트롤러 </td><td> 가정 내장</td><td> 자동 밸브 컨트롤러 시스템은 원래 라파엘 고메즈 - Sjöberg, 로렌스 버클리 국립 연구소에 의해 개발되었다. 어떻게 자신의 actuated 밸브 컨트롤러를 구축하는 자세한 지침은에서 찾을 수 <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

뿌리 식물의 물리적 앵커와 같은 기능과 같은 식물이 토양으로부터 취득하는 질소, 인, 황산 및 추적 구성 요소로서 물과 미네랄 영양소의 이해에 대한 책임 기관입니다. 우리가 높은 작물 수확량을 생산에 지속적인 접근법을 개발하고자한다면, 우리는 더 뿌리가 영양분의 다양한 스펙트럼을 소요하고, 공생과 병원성 유기체와 상호 작용, 개발 방법을 이해해야합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 몇 분 거리 일까지 기간 동안 미세한 자세하게 뿌리를 탐구 할 수 있어야합니다. 기반 microfluidic 장치, 이미징 1 (그림 1)에 대한 준비를하는 동안 뿌리에 어떠한 물리적인 스트레스를 피하는 동안 우리 Arabidopsis 모종의 성장 및 이미지 뿌리하실 수 있습니다 - 우리는 RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS)을 개발했다. 장치는 유체 흐름을 안내하는 micromechanical 밸브를 갖춘 bifurcated 채널 구조를 포함솔루션 inlets에서 8 개의 관측 실이 각각 있습니다. 이 관류 시스템은 루트 microenvironment를 조절하고 정밀도와 속도로 수정할 수 있습니다. 챔버의 부피 따라서 테스트 솔루션에만 최소한의 금액을 필요로하는 약 400 NL이다. 여기 실시간 해상도로 영상 기반 접근 방법을 사용하여 RootChip에 루트 생물학을 공부를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 뿌리는 시간 저속 현미경을 사용하여 며칠 동안 분석할 수 있습니다. 루츠는 영양 솔루션이나 저해제로 perfused 수 있으며, 최대 8 모종은 병렬로 분석할 수 있습니다. 이 시스템은 화학, 유전자 발현의 형광 기반의 분석 및 biosensors의 분석의 존재 또는 부재의 루트 성장의 분석을 포함하여 어플 리케이션의 광범위한 잠재력을 가지고, 예를 들어이 nanosensors 3 초조해.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

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Bioengineering

19.6K 조회수.  Carnegie Institution for Science. 이 문서 RootChip의 Arabidopsis 모종 배양을위한 프로토콜, 미세한 루트 모니터링 및 세포내 신진 대사 단계의 걱정 기반의 측정과 성장 조건의 자동 제어를 결합한 microfluidic 이미징 플랫폼을 제공합니다.

비디오: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

연구

생체공학

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

액슨 스트레치 성장의 연결을 성장의 Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

실버 씨앗 중재 성장 방법과 골드 Nanostar 합성

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

4D 공 촛점 시간 경과 이미징을 다음 샘플 편차 수정

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

소프트 리소그래피의 변경을 사용하여 루트 표면 미세 구조의 생물 적 복제

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...