Gostaríamos de agradecer Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio para assistência técnica especializada em produção de vídeo e edição e Immersive Dr. Martin Bertrand de Carleton Media Laboratory Regeneração Estúdio / Neural de assistência modelo visual. Os autores agradecem os pareceres dos peritos do Dr. Marilyn Keaney e toda a sua equipe dedicada na Universidade de Ottawa Animal Care e Serviços Veterinários. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, MOP 62.826) para SALB, o Instituto CIHR de Envelhecimento e Iniciativa Formação Estratégica em Pesquisa em Saúde / Programa de Formação de CIHR em lipidómica Neurodegenerativas (96.121 TGF) para SALB e SF, Fundação Canadense Para que a inovação SF, Ontário Inovação Trust para SF e Investigação da Autodesk para a SF. ACM recebe um Banting e Best CIHR prêmio de doutorado. NV recebe uma bolsa de pós-profissional do Instituto de Envelhecimento e Programa de Treinamento em CIHR lipidómica Neurodegenerativas.

1. Reagentes Preparando <ol><li> Para lavagem vaginal estéril, autoclave água bidestilada (DDH 2 O) e guarde em um recipiente hermeticamente fechado em temperatura ambiente até ser necessário. </li><li> Para a avaliação citológica, adicionar 0,1 g de pó de cristal violeta a 100 ml de DDQ 2 O. Misturar bem. O violeta de cristal mancha (0,1%) pode ser armazenado em um recipiente hermeticamente fechado à temperatura ambiente até ser necessário. </li></ol> 2. Coleta de células vaginais (lavagem vaginal) <ol><li> Colocar uma lâmpada de látex na extremidade de uma ponta de 200 ul estéril e elaborar a cerca de 100 ul de H2O estéril DDH usando as gradações na ponta como uma orientação volume. </li><li> Levante o mouse para fora da sua gaiola e colocá-la no funil gaiola (tampa) com sua extremidade traseira / trás para você. </li><li> Segure firmemente a cauda e elevar a extremidade traseira. O rato terá agora apenas as patas dianteiras agarrar a caçamba. Neste ponto, o mouse pode urinar. Se assim, Espere até parar de urinar. Caso haja urina deixados na entrada do canal vaginal, você pode querer lavar a abertura com excesso de DDH 2 O, utilizando uma ponta separado (ou seja, não a ponta coleta). </li><li> Coloque a extremidade da ponta 2 DDH O-cheia na abertura do canal vaginal tendo o cuidado de não penetrar o orifício de estimulação (e cervical) pode induzir a pseudogravidez vaginal em ratos 1,2. Relatos recentes sugerem ratos são menos susceptíveis a este efeito, no entanto deve ser tomado cuidado para minimizar o grau de invasão em análises repetidas 3. </li><li> Pressione levemente o bulbo de expulsão de um quarto a metade do volume de água (~ ul 25-50) na abertura do canal vaginal. O líquido vai-se espontaneamente aspirar para dentro do canal de inserção sem ponta. Libertam lentamente a pressão exercida sobre a lâmpada. O fluido vai retirar de volta para a ponta. Evitar a libertação demasiado rápida da pressão para evitar a aspiração de fluidono bulbo. Uma ponta filtrado podem ser úteis para esta finalidade. </li><li> Repetir os passos anteriores 4-5 vezes usando a mesma ponta, bulbo, e fluido para se obter um número suficiente de células de uma única amostra. </li><li> Colocar o fluido em lâmina de vidro, e permitir que o esfregaço para secar completamente à temperatura ambiente. Depois de seco, estas manchas estral podem ser corados imediatamente ou armazenadas e coradas numa data posterior. </li></ol> 3. Citologia usando Cristal Violeta * 4 <ol><li> Colocar a lâmina seca em um frasco Coplin (ou outro recipiente de coloração comparáveis) contendo a mancha violeta de cristal durante 1 min. </li><li> Remover para um frasco contendo Coplin segundo DDH 2 O. Lava-se a lâmina com DDQ 2 O durante 1 min. Repetir. </li><li> Retire o excesso de DDH 2 O a partir das bordas da lâmina com um limpador de tecido light-duty, evitando o contato com o esfregaço corado. </li><li> Pipetar cerca de 15 ul de glicerol no topo da tampa e esfregaçoescorregar. Alternativamente, outros reagentes histológicos de montagem podem ser utilizados para se obter uma forma mais permanente, não-difusora mancha. </li></ol> * O método de coloração descrito aqui é o procedimento mais simples que pode ser realizado em qualquer laboratório. Outros métodos podem fornecer detalhes adicionais. Por exemplo, usando a coloração de Papanicolaou, a maturidade de células epiteliais nucleadas podem ser distinguidos com células menos maduras manchadas de azul-turquesa e células mais maduras rosa ou laranja-manchadas. Estas diferenças podem ser usados ​​para a fase precoce ou tardia de proestro. 4 4. Citologia vaginal <ol><li> Examinar o esfregaço sob microscopia de luz para determinar os tipos de células presentes. Exame microscópico deve ser feito imediatamente após a coloração violeta como o cristal irá difundir a partir de células ao longo do tempo quando se utiliza o glicerol para lamínulas. As fotomicrografias devem ser tomadas no momento da análise para documentar a citologia. </li><li> Comece examinando a entiresfregaço e em uma menor ampliação. Selecione uma área representativa e passar para uma maior ampliação. Irá ver cornificado células epiteliais escamosas, leucócitos e / ou nucleadas células epiteliais (resultados representativos, Figura 1A-C). A proporção de células presente lhe permitirá determinar a fase do cio de seu mouse no momento da coleta da amostra (resultados representativos, Figura 1D-G) e seu status de imediato hormonal (discussão, Figura 2). </li></ol> 5. Resultados representativos Cytology: Três tipos de células primárias podem ser detectadas em amostras de esfregaço vaginal: (1) nucleadas células epiteliais (Figura 1A), (2) cornificado células epiteliais escamosas (Figura 1B), e (3) os leucócitos (Figura 1C). Nucleadas células epiteliais têm citoplasma levemente manchado, mais escuro membrana plasmática manchado, e um núcleo oval ( <strong&gt; Figura 1A). Cornified células epiteliais escamosas são uniformemente corada, mais em forma poligonal do que os seus antecessores nucleadas epiteliais, e carecem de um núcleo (Figura 1B). Os leucócitos polimorfonucleares podem ser distinguidas das células epiteliais pela sua forma irregular, escura manchado núcleos polimórficos e pequeno tamanho (Figura 1C, as setas pretas). Deve contaminação urina estar presente no esfregaço, cristais de ácido úrico são prontamente detectados pelas suas estruturas cristalinas diferentes de quaisquer tipos de células normais (Figura 3). Caso isso ocorra, e detecção obscuro do tipo celular predominante, a mancha deverá ser descartado e não é usado para fins de teste. Estadiamento: A proporção relativa dos tipos celulares nos esfregaços podem ser usados ​​para identificar a fase do ciclo estral o rato no dia da colheita da amostra (Figura 1D-G). Durante proestro, as células são quase exclusivamenteaglomerados de redondo, bem formado nucleadas células epiteliais (Figura 1D, a célula representativa indicado pela seta branca). Durante o estro, as células são predominantemente cornificado células epiteliais escamosas, presentes em aglomerados densos (Figura 1E, a célula representativa indicada pela seta). Durante metaestro, pequenas leucócitos darkly coradas predominam (Figura 1F, célula representativa indicada pela seta preta). Cornified células epiteliais escamosas podem ser observadas, muitas vezes, em fragmentos (Figura 1F, célula representativa indicada pela seta preta). Durante diestro, raras cornificadas células epiteliais escamosas podem ainda estar presentes (Figura 1G, célula representativa indicada pela seta preta), mas ainda predominam leucócitos (Figura 1G, célula representativa indicada pela seta preta). Metaestro pode ser distinguido do diestro pelo aparecimento de nucleadas células epiteliais em diestro ( <stron<html> g&gt; A Figura 1G, célula representativa indicada pela seta branca). <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Avaliação citológica de esfregaços vaginais podem ser usados ​​para identificar fase estro três principais tipos de células são detectados em amostras de esfregaço vaginal:. (A) nucleadas células epiteliais, (B) cornificadas células epiteliais escamosas, e (C) os leucócitos. A razão entre estes tipos de células presentes na mancha pode ser utilizado para identificar ratinhos em (D) proestro, (E) do estro, (F) metaestro, ou (G), tal como descrito em diestro resultados representativos. Setas pretas em E, F e ponto G ao representante cornified células epiteliais escamosas. Setas pretas em C, F e G a ponto leykocytes representativas. Setas brancas em D e G representante destaque nucleados células epiteliais. . Jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Citologia oncótica vaginal reflete eventos endócrinas subjacentes. Detalhes também são fornecidos em Discussão. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristais de ácido úrico pode estar coloração com violeta de cristal presentes seguinte de urina contaminadas amostras. (A) Os cristais são transparentes e podem ser de vários tamanhos (setas e região boxed ampliadas em (B)). Sem as células estão presentes nesta área. Deve contaminação cristais de ácido úrico nos campos usados ​​para a coloração citológica estar presente, pode ser difícil de identificar com precisão os tipos de células presentes no esfregaço e deve ser descartada. Barra de escala = 50 um.

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Os autores declaram que não há conflito de interesse. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Ottawa Animal Care e do Comitê Canadian Council on Animal Care.

Estas mudanças na tipologia das células são indicativos de eventos endócrinas subjacentes. A fase de proestro do ciclo estral corresponde à fase folicular humano do ciclo menstrual, 5 e é definida por um aumento pré-ovulatório, em circulação de 17 β-estradiol níveis 6, bem como uma pequena onda de prolactina 7 (Figura 2, proestro, painel esquerdo). O aumento em 17-β-estradiol estimula indirectamente gonadotropina libertadora de hormona de neurônios no hipotálamo e septo que, por sua vez, activam as células que respondem na pituitária anterior para libertar a hormona luteinizante e hormona folículo-estimulante para a circulação 8,9 (Figura 2 , proestro, painel esquerdo). Em esfregaços vaginais colhidas dos animais em proestro, as células são quase exclusivamente ovais nucleadas células epiteliais (Figura 1D, a Figura 2, proestro, painel direito). O pico de folículo estimulante-Hormum nível ovulação sinais e entrada em estro 10,11. Durante o estro, 17-β-estradiol níveis declínio dos níveis de prolactina e de pico 6,7 (Figura 2, o estro, painel esquerdo). Esfregaços vaginais são caracterizadas por detecção quase exclusiva de formato irregular cornificadas células epiteliais escamosas, muitas vezes em tufos (Figura 1E, a Figura 2, o estro, painel direito). Entrada em metaestro coincide com um aumento contínuo nos níveis de progesterona de 6 e corresponde ao início da fase luteal humano 12 (Figura 2, metaestro, painel esquerdo). Como os níveis de progesterona começam a subir e existe uma pequena onda de 17-β-estradiol em resposta a níveis de corpus luteum activação 6,13,14 (Figura 2, metaestro, painel esquerdo). Os tipos de células presentes no esfregaço vaginal durante esta fase são fragmentados, cornified células epiteliais e leucócitos menores escuras manchadas (Figure 1F, Figura 2, metaestro, painel direito). Finalmente, a entrada em diestro ocorre em ratinhos e os níveis de progesterona em circulação pico 6, que corresponde à fase lútea tardia humano 12. Regressão do corpo lúteo leva a um declínio acentuado subsequente dos níveis de progesterona 15,16 (Figura 2, diestro, painel esquerdo). Leucócitos predominam nos esfregaços durante diestro. A frequência de células epiteliais cornificadas e nucleadas é reduzida das células epiteliais começam a ser detectada imediatamente antes da transição para o proestro (Figura 1G, a figura 2, diestro, painel direito). Em resumo, este protocolo simples de rotina podem ser utilizados para estimar variações hormonais diárias e estabelecer fase estro em ratos experimentais sem alterar estado reprodutivo se as seguintes precauções sejam tomadas. A amostragem deve ser efectuada mais do que uma vez por dia utilizando o não-invasivo protocolo described aqui, em comparação com a penetração repetida do canal vaginal, aspiração, e agitação. Isto pode causar uma irritação vaginal resultando numa resposta inflamatória que resulta 17 em leucócitos e outros tipos de células de estar presentes em esfregaços que podem confundir a avaliação citológica. Além disso, mesmo na colônia alojados fêmeas, é normal ver diestro longos e estágios de estro em camundongos diferentes como a indução bem, de 18 de anestro e essa identificação é útil na interpretação do impacto hormonal reprodutiva, gênero e estudos de doenças. Variabilidade na duração do ciclo também é introduzido com a idade e por diferenças de habitação dentro de colônias (indivíduo ou grupo habitação) de fêmeas 7,19-21. Fêmeas alojadas no feminino somente colônias pode deixar de bicicleta e entrar em um estado de diestro prolongado 18,22,23 embora o ciclismo pode ser restabelecida pela exposição ao gaiolas pré-tratadas com urina masculina para provocar ciclismo 24,25. Assim, para estabelecer individual comprimentos de ciclo para um dado rato, recomenda-se que as avaliações não invasivas descritas aqui ser realizado diariamente, com cuidado, até dois ciclos completos são observados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> Estéreis 200 uL ponteiras </td><td> Diamed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td> Látex bulbo (1 ml) </td><td> Pescador </td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro de microscópio </td><td> Pescador </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Crystal Violet mancha (25 g) </td><td> Pescador </td><td> C581-25 </td></tr><tr><td> Leves Wipers Tecido </td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td> Vidro microscópio Cover (22x30) </td><td> Pescador </td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification

Um meio rápido de avaliação do estado reprodutivo em roedores é útil não só para o estudo da disfunção reprodutiva, mas também é necessário para a produção de novos modelos de rato de doença e investigações sobre a regulação hormonal da degeneração do tecido (ou regeneração) após desafio patológico. O ciclo reprodutivo murino (ou estro) é dividido em quatro fases: proestro, estro, metaestro e diestro. Flutuações definidas em níveis circulantes de esteróides ovarianos 17-β-estradiol e de progesterona, as gonadotrofinas luteinizante e folículo hormonas estimulantes, e a transição do sinal de luteotrópico hormona prolactina através destes estágios reprodutivos. Alterações na tipologia de células dentro do canal vaginal murina refletir esses eventos endócrinas subjacentes. Avaliação diária do índice relativo de nucleadas células epiteliais, células epiteliais escamosas cornificadas e leucócitos presentes em esfregaços vaginais podem ser usados ​​para identificar estral murinofases. O grau de invasão, no entanto, empregado na coleta destas amostras pode alterar status reprodutivo e induzir uma resposta inflamatória que pode confundir avaliação citológica de esfregaços. Aqui, nós descrevemos um método simples, não invasivo protocolo que pode ser usado para determinar a fase do ciclo estral de um rato fêmea, sem alterar o seu ciclo reprodutivo. Nós detalhe como diferenciar entre os quatro estágios do ciclo estral pela coleta e análise de tipologia predominante de células em esfregaços vaginais e que mostram como estas alterações podem ser interpretados com respeito ao status endócrino.

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Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Aqui, descrevemos como identificar o estágio da reprodução murino (proestro, estro, metaestro ou diestro) pelo simples, a coleta não-invasiva e avaliação citológica de amostras de esfregaço vaginal. Iremos descrever como citologia vaginal reflete níveis circulantes hormonais subjacentes transição durante o ciclo reprodutivo murino.

Realizando lavado vaginal, Crystal coloração violeta, e avaliação citológica vaginal para Rato Identificação ciclo estral Staging

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

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Research

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Biology

110.1K visualizações.  Neural Regeneration Laboratory and Ottawa Institute of Systems Biology. Aqui, descrevemos como identificar o estágio da reprodução murino (proestro, estro, metaestro ou diestro) pelo simples, a coleta não-invasiva e avaliação citológica de amostras de esfregaço vaginal. Iremos descrever como citologia vaginal reflete níveis circulantes hormonais subjacentes transição durante o ciclo reprodutivo murino.

Vídeo: Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...