Os autores gostariam de agradecer Shelly Xie e Jennifer Payne por sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi possível através de doações da Sociedade de Urologia Pediátrica e do Fundo de Investigação Pediátrica Stanford.

I. Elaboração de cateteres uretrais <ol><li> Para cada bexiga e rim do rato a amostrar, coloque 5-6 grânulos de aço inoxidável (bexiga, 1,6 mm ou tamanho 0,9-2,0 mistura mm) ou grânulos de óxido de zircônio (rim, tamanho 0,5 mm) em um tubo de cryovial, respectivamente. Autoclave os tubos contendo talão. </li><li> Após os tubos esfriarem até a temperatura ambiente, adicionar 200 microlitros de PBS estéril a cada tubo de aço inoxidável contendo talão e 400 microlitros de PBS estéril a cada tubo de óxido de zircônio contendo talão. </li><li> Nós preparamos cateteres uretrais, como descrito por Hung e Hultgren 13. Autoclave um par limpo de flat-cabeça pinças e tesouras finas (íris ou tipo similar) e permitir que os instrumentos para esfriar a temperatura ambiente. Limpe as superfícies de uma capela de fluxo laminar com etanol 70%. Na capa, corte um segmento de 30 centímetros (aproximado) de tubos de polietileno. Assepticamente colocar uma agulha estéril 30 (meia polegada longa agulha) em uma seringa estéril cc 3. Pegue uma das extremidades do tubo de polietileno de corte com a pinça autoclavado e deslize o tubo na agulha até encontrar o hub. Cortar o tubo de modo que cerca de 2 centímetros se estende além da ponta da agulha. Remover o cateter da seringa e colocar em uma placa de Petri estéril. </li><li> Para reduzir a probabilidade de contaminação cruzada, fazemos um cateter para cada rato. Depois de todos os cateteres são feitos, esterilizá-los pela exposição em uma placa de Petri descoberto à radiação UV por pelo menos 30 minutos. Não olhe diretamente para as lâmpadas UV ou expor qualquer parte do corpo no capô enquanto as lâmpadas são ativadas. Após a exposição UV, os cateteres podem ser armazenados a longo prazo na placa de Petri. Recomendamos selando o prato com Parafilm para ajudar a manter a esterilidade. </li></ol> II. Inoculação em animais <ol><li> Ratos deve chegar pelo menos uma semana antes da manipulação experimental, a fim de evitar o stress induzido por fatores de confusão. Camundongos fêmeas são usados ​​porque a uretra masculina do mouse é extremamente difícil de cateterização. CBA / J é um comumente utilizados, UTI suscetíveis à tensão do mouse puras. Camundongos devem ser usados ​​entre 8 e 12 semanas de idade, uma vez que esta é a janela imunológica de maturidade antes da senescência. No primeiro dia do experimento, mergulhe o fim de um ciclo estéril da inoculação em um frasco de estoque de bactérias congeladas. Desenterrar um inóculo pequenos e fora de raia em uma placa de ágar apropriado. Geralmente, uropathogenic E. coli (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani agar (LB) a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como sólido, branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Devolver imediatamente o estoque de bactérias para o freezer. Cepas bacterianas uropathogenic pode tornar-se menos virulento ao longo do tempo com repetidas, as culturas de série. Por isso, recomendamos listando fora uma placa de agar fresco para cada experimento. </li><li> No dia 2 do experimento, após a confirmação de morfologia das colônias adequada, pick colônias única a partir de placas de ágar e colocar em pelo menos 5 cc caldo de cultura durante a noite. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana (37 ° C, 200 rpm no ar ambiente). Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração. </li><li> No dia 3 do experimento, tomam 10% do caldo da cultura primeira e cultura em caldo novamente durante a noite (tipicamente 37 ° C e 200 rpm), para aumentar a expressão do tipo I pili. Culturas caldo Serial ajudar a otimizar uropathogenicity bacteriana, uma vez que pili tipo I tem se mostrado um fator de virulência essencial para uropatógenos in vivo 1. Mantenha as tampas soltas sobre os tubos de caldo de cultura para permitir a aeração. </li><li> No dia 4 do experimento, medir o OD 600 da cultura caldo do dia 3. Se não já conhecidos para a cepa bacteriana que está sendo testado, executar dez vezes à diluição em série ao longo de pelo menos 7 logs (diluições realizadas com PBS, as culturas realizadas em ágar LB, 37 ° C durante a noite de incubação) para determinar a relação entre OD e 600 ufc / ml. Como regra geral, um OD 600 de 0,4-0,5 geralmente corresponde a 1-2x10 7 ufc por 50 microlitros. Uma vez que a relação entre OD e 600 ufc / ml foi determinado, pode-se ajustar o caldo de cultura para o OD 600 correspondente ao ufc desejado por rato em 50 microlitros de PBS. Alguns trabalhos sugerem que a inoculação de 10 microlitros, em vez de 50, leva a uma menor refluxo para o kidneys6. No entanto, a maioria das publicações têm relatado o uso de 50 microlitros por mouse. Geralmente, os intervalos ufc desejado entre 10 6 e 108 ufc / mouse, mas cada combinação estirpe bacteriana / mouse precisa ser empiricamente testado in vivo. </li><li> Para ajudar a garantir que inóculos não são anulados imediatamente após a instilação, os ratos deveriam ser privados de água por pelo menos 30 minutos antes da indução da anestesia geral. Outra manobra fundamental é induzir esvaziamento antes da indução da anestesia por scruffing ratos e pressionando suavemente a parte inferior abdomen. Dois a 2,5% do isoflurano é uma dose segura para a indução 8-12 semanas de idade camundongos fêmeas CBA, seguido de anestesia de manutenção com 1,8-2% isoflurano. </li><li> Uma vez que a anestesia é alcançado, os ratos são colocados em posição supina com a cabeça inserido em um cone de nariz ligado ao isoflurano contendo oxigênio. Parte inferior do abdome é massageado para evacuar a urina da bexiga. Se a bexiga está relativamente vazio, esta manobra pode não produzir urina. Parte inferior do abdómen e do períneo é embebido com álcool 70%. </li><li> Uma seringa estéril 1 cc sem agulha é usada para elaborar o inóculo desejado bacteriana. Em seguida, um cateter uretral estéril é colocado assepticamente na seringa. A tubulação em excesso é cortar o cateter com uma tesoura de modo que somente 1-2 milímetros de tubos permanecem distal à ponta da agulha. Em seguida, a seringa é aproveitado eo êmbolo deprimido com a seringa na posição vertical para remover todas as bolhas. Um montão de lubrificante bacteriostático geléia é esguichou em uma placa de Petri estéril ou o interior do invólucro seringa estéril. A ponta do cateter (com seringa em anexo) é mergulhado na geléia. Se múltiplas cepas bacterianas estão sendo testados no mesmo experimento, tenha cuidado para não usar a mesma queda de geléia para lubrificar cateteres contendo diferentes cepas. </li><li> Usando um microscópio estéreo (0,8 x a faixa de zoom 5x) para ampliação, o capuz do clitóris do mouse anestesiados é gentilmente agarrou na mão não-dominante com um par de pinças de dentes finos e levantou cefálica para expor o fundo rosa meato uretral ( Figura 1). A seringa (com cateter em anexo) é agarrado na mão dominante, com um aperto de lápis ea ponta do cateter está envolvida no meato uretral em um ângulo de 45 graus. O capuz do clitóris é esticada ao longo do eixo da seringa, de forma eficaz &quot;loading&quot; a uretra para o cateter. Esta manobra é essencial, pois a uretra do mouse é redundante. O cateter deve deslizar facilmente para a bexiga (até o hub, Figura 2), e pode ser gentilmente girou para ajudar a navegar as dobras redundantes da uretra. Uma vez que o cateter é hub, a seringa pode ser reduzida até que esteja paralela com o longo eixo do mouse. A mão não-dominante pode soltar o fórceps para ajudar a estabilizar a posição do cateter e seringa como a mão dominante é utilizada para injectar lentamente o inóculo (pelo menos 5 segundos). Se o líquido é visto fluindo ao redor do cateter durante a injeção, seja a bexiga está cheia ou o cateter é na vagina (apenas caudal para a uretra). Injecção deve ser imediatamente interrompido e da posição do cateter cuidadosamente examinada. Se o cateter foi na uretra, o rato dado não deve ser incluído no experimento. Por outro lado, um cateter extraviado na vagina pode ser reposicionada ea injeção re-tentada. Após a injeção, o cateter ea seringa é lentamente retirado do mouse. </li><li> Para reduzir a probabilidade de esvaziamento pós-inoculação precoce, o que pode evacuar bactérias administrados e, assim, levar a níveis de infecção variável, alguns investigadores manter ratos sob anestesia por 30 minutos após inoculation10 transuretral. Após a cirurgia, os ratos deve se recuperar em um cobertor aquecimento limpo, com observação contínua para confirmar retorno dos padrões normais de respiração e atividade. Uma vez que os animais se recuperaram totalmente a capacidade de engatinhar, que podem ser devolvidos à cama contendo gaiolas. </li></ol> III. CFU medição em tecido infectado <ol><li> Publicações diversas do mouse UTI relataram os resultados de cultura de 6 horas para uma semana ou mais após a inoculação. O tempo ideal pontos precisam ser determinadas empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse. Urina anulada é obtido para a cultura por scruffing do mouse sobre uma placa de Petri estéril. Urina colhida deve ser mantida no gelo em todos os momentos. Várias tentativas para obter urina anulado durante muitas horas pode ser necessária, uma vez anular mouse é volume, freqüência baixa (3-10 microlitros por void), e estresse-dependente. </li><li> Depois de obter amostras de urina anulada, nos sacrificamos camundongos usando isoflurano e deslocamento cervical. O abdômen é assepticamente aberto. Se uma amostra de urina anulado não foi obtida com sucesso anteriormente, uma pequena quantidade de urina muitas vezes pode ser aspirado através da parede da bexiga usando uma agulha de calibre 30 e seringa. </li><li> Um ou ambos os rins são removidos, picadas em pelo menos 4 peças (cada peça deve ser inferior a 50 microgramas) em uma placa de Petri estéril e colocados em cordão de zircônio / PBS contendo criotubos no gelo. A bexiga é removida, picada em pelo menos 4 peças, e colocados em cordão de aço inoxidável / PBS contendo criotubos no gelo. O tecido / grânulo / PBS contendo criotubos são colocados em um homogeneizador de bala Blender e os tecidos são homogeneizados usando o &quot;8&quot; configuração de velocidade durante um minuto. É comum que alguns fragmentos de tecido para permanecer após homogeneização. Enquanto 5-10 microlitros de homogeneizado de líquido pode ser pipetado, fragmentos sólidosnão são necessariamente um problema. Se o tempo de homogeneização é o aumento de algumas amostras, é fundamental para fazê-lo para todos os tecidos, a fim de manter a consistência de homogeneização. Nós utilizamos uma bala Blender homogeneizador porque evita a possibilidade de contaminação cruzada, é mais rápido do que o processamento de amostras individuais um a um, usando um homogeneizador padrão, e não de forma significativa de calor as amostras sendo homogeneizado. </li><li> Pelo menos dois ou três de dez diluições de urina coletados e homogeneizados de tecido deve ser feita em uma placa de microtitulação. Para experimentos preliminares, pode ser prudente para fazer pelo menos sete de dez diluições. Cultura até 100 microlitros de urina, da bexiga e / ou homogeneizados de rins em ágar apropriado. Uma vez que as amostras de urina podem ser de volume limitado, pode ser necessário para trazer os seus volumes de 100 microlitros antes de realizar dez diluições. Se esta for necessária, a diluição inicial (antes de dez vezes diluição) terão de ser tidos em conta os cálculos finais de rendimentos bacteriana. Nós preferimos UPEC cultura em eosina-azul de metileno ou agar MacConkey (incubação overnight a 37 ° C), uma vez que estes meios são seletivos para os organismos Gram negativos. Cepas UPEC crescer em agar MacConkey como central umbilicadas, vermelho-rosa colônias devido à sua capacidade para fermentar lactose. </li><li> Depois de cultura durante a noite, contar o ufc para cada prato. Para amostras diluídas em série, a diluição placa contendo 50-100 colônias é considerada a contagem mais precisa. &quot;Voltar&quot; calcular ufc por tecidos, por miligrama de tecido, ou por ml. </li></ol> IV. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Meato uretral (tecido rosa escuro) expostos, levantando capuz do clitóris cefálica com o fórceps (além topo da foto) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cateterizada uretra. O clitóris bífido pode ser visto logo acima do cateter. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Bexiga ufc conta dois dias após a infecção transuretral de 8 semanas de idade do sexo feminino camundongos CBA / J com uropathogenic E. coli. Bexigas foram homogeneizadas e ufc / ml determinada pela diluição em série em ágar MacConkey. Diamantes indicam ufc / ml para camundongos individual, barra horizontal indica ufc mediana / ml.

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli:+refining+the+murine+model.">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Indução de rato infecção do trato urinário por inoculação de bactérias transuretral é um procedimento estabelecido há muito tempo, mas tecnicamente exigente 11. Hung e Hultgren publicou recentemente uma excelente revisão das técnicas de ressecção transuretral de mouse infecção do trato urinário 13. Neste trabalho, tentamos ilustrar ainda mais os pontos mais delicados desta abordagem experimental. Novatos podem praticar a sua técnica através da realiza...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

Cepas bacterianas uropathogenic de interesse são cultivadas em ágar. Geralmente uropathogenic,<em&gt; E. coli</em&gt; (UPEC) e de outras variedades podem ser cultivadas durante a noite em Luria-Bertani (LB) ágar a 37 ° C no ar ambiente. Cepas UPEC crescer como branco-amarelada translúcida colônias em ágar LB. Após a confirmação da morfologia da colônia apropriado, colônias individuais são, então, escolhido para ser cultivado em caldo. LB pode ser usado para cepas mais uropathogenic bacteriana. Dois serial, culturas caldo LB noite pode ser empregada para aumentar a expressão do pili tipo I, um fator de virulência bem definidos para as bactérias uropathogenic. Culturas caldo são diluídos para a concentração desejada em tampão fosfato salino (PBS). De oito a 12 semanas de idade camundongos fêmeas são colocadas sob anestesia com isoflurano e transurethrally inoculadas com bactérias usando tubos de polietileno coberta de 30 seringas de calibre. Inóculos típico, que deve ser determinado empiricamente para cada combinação estirpe bacteriana / mouse, são 10<sup&gt; 6</sup&gt; A 10<sup&gt; 8</sup&gt; Ufc por rato em 10 a 50 microlitros de PBS. Após o período de infecção desejado (um dia a várias semanas), amostras de urina e da bexiga e os rins são colhidos. Cada órgão é picada, colocados em PBS e homogeneizadas em um homogeneizador de bala azul. Homogeneizados de urina e tecido são serialmente diluída em PBS e cultivadas em ágar apropriado. No dia seguinte, as unidades formadoras de colónias são contadas.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Indução transuretral de rato infecção urinária

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.4K visualizações.  Stanford University. Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Vídeo: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparação de rato Imunogénio Pituitária para a indução de hipofisite Auto-Imune Experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Imunologia e Infecção

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Indução de hipofisite Auto-Imune Experimental em Ratos SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento de RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizar o trato gastrointestinal Murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

Procedimento de instilação transuretral no rato adulto masculino

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolamento de comunidades de bacterianas intracelulares único gerado a partir de um modelo murino de infecção do trato urinário para análise de célula única a jusante

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Indução de lesão de pulmão de camundongo por injeção endotraqueal de bleomicina

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Methods Article

Indução transuretral de rato infecção urinária