Este protocolo é significativo para a produção de organoides epiteliais de memória que são gerados sem passar. A principal vantagem desta técnica é que os organoides podem ser isolados do tecido mamário e de memória humana e de camundongo após a digestão enzimática. Realizamos uma série de etapas de centrifugação diferencial que isolam organoides epiteliais sem ter que passar células.
Um indivíduo que realiza esta técnica pode enfrentar desafios ao incorporar os tecidos em colágeno ou matriz e chapeá-los dentro de uma placa de 96 poços. Além disso, o uso de colágeno polimerizado adequadamente e o revestimento de cúpulas estáveis é a chave para ver a invasão. Para começar, colete o tecido mamário de um rato eutanasiado jogando membros de camundongos e, usando quatro agulhas de calibre 19, prenda o rato pelas patas a uma tábua coberta com uma almofada absorvente com o lado ventral voltado para cima.
Pulverize com etanol a 70% para suavizar a pele e higienizar a pele e limpar as fezes com uma gaze ou tecido. Começando logo acima da região anogenital, corte para cima a partir da linha média usando tesoura cirúrgica tomando cuidado para não perfurar o peritônio. Ao chegar ao queixo, faça cortes laterais em ambas as clavículas e nas patas traseiras e prenda a pele do rato esticada à prancha para expor as almofadas de gordura mamária.
Depois de localizar as almofadas de gordura mamária inguinal e torácica em camundongos do tipo selvagem, use fórceps para elevar a almofada de gordura mamária. Usando a extremidade contundente da tesoura afiada e contundente, crie um bolso sob a almofada de gordura mamária longe da pele e corte a almofada de gordura mamária em uma peça completa. Uma vez que as almofadas de gordura mamária tenham sido removidas, enxágue em PBS antes de colocá-las em um prato de cultura de tecidos estéreis e, em seguida, transfira rapidamente para um capuz de cultura de tecidos.
Pice os tumores mamários com um bisturi número 10 ou número 11 para soltar o tecido até atingir uma consistência pastosa. Transfira o tecido picado para um tubo cônico contendo 10 a 30 mililitros de solução de colagenase usando um bisturi. Para garantir que todo o tecido seja coletado, pipete um mililitro de solução de colagenase na placa de cultura de tecidos e de volta para o tubo cônico.
Coloque o tubo cônico em uma incubadora de agitação de bancada até que o tecido se torne fibroso e a solução de colagenase fique turva. Gire 50 mililitros de solução por cinco a 10 minutos a 1.500 RPM. Aspirar sobrenadante e adicionar 12 mililitros do meio basal e misturar pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes ou gire suavemente o pulso enquanto segura o tubo 15 vezes.
Novamente, gire para baixo o sobrenadante aspirado, adicione o meio basal e misture por pipetagem ou rotação do tubo, conforme demonstrado anteriormente. Uma vez que os fragmentos de tecido mais pesados se depositam no fundo, colete o sobrenadante com uma pipeta sorológica e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Após cada centrifugação, certifique-se de que o pellet se torne cada vez mais opaco.
Aliquot suspensão apropriada de organoides em tubos de microcentrífuga de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de BECM por poço. Centrifugar os tubos de microcentrífuga durante 10 minutos a 300 G à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante dos tubos. Mova os tubos com pellets organoides para o gelo e adicione o volume apropriado de BECM a cada tubo de microcentrífuga.
Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no BECM, tomando cuidado para não produzir bolhas. Lentamente e cuidadosamente pipetar os organoides suspensos BECM na superfície de revestimento e encher todos os poços vazios com PBS para manter a umidade. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma hora para permitir que o BECM solidifique e, em seguida, cubra com o volume apropriado de meio.
Para preparar a solução de colágeno, combine 375 microlitros de 10 vezes a concentração de DMEM, 100 microlitros de um hidróxido de sódio normal e três mililitros de solução de colágeno I de cauda de rato em um tubo cônico de 15 mililitros. Misture a pipeta, tomando cuidado para não fazer bolhas, e titular a solução a um pH de 7,2 a 7,4 com uma pequena quantidade de hidróxido de sódio ou 10 vezes a concentração de DMEM, conforme necessário. Revestir o fundo dos poços com a quantidade mínima de colágeno necessária para cobrir totalmente o fundo do poço, colocando uma pequena quantidade de colágeno e balançar a placa de um lado para o outro.
Deixe que os revestimentos de colágeno se fixem em 37 graus Celsius por 30 minutos a duas horas. Aliquotar a suspensão apropriada de organoides em tubos de microcentrífuga de acordo com a densidade organoide em relação à quantidade de colágeno por poço. Armazene a solução de colágeno a quatro graus Celsius e monitore a polimerização verificando a formação de fibras sob um microscópio a cada 10 minutos.
Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 300 G durante 10 minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante dos tubos. Mova os pellets organoides para o gelo e adicione o volume apropriado de colágeno a cada tubo de microcentrífuga. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender os organoides no colágeno, tomando cuidado para não produzir bolhas.
Pipete lenta e cuidadosamente os organoides suspensos de colágeno na superfície de revestimento. As imagens imunofluorescentes de organoides embutidos na matriz extracelular basal ou colágeno foram obtidas para estudar as semelhanças de composição tecidual entre espécies. Organoides embutidos na matriz de colágeno podem ser usados para um ensaio de invasão e analisados rastreando a expansão das gavinhas que se ramificam do próprio organoide através da marcação de tomate por membrana ou coloração de faloidina da actina.
Por fim, a coloração de hematoxilina e eosina de organoides embutidos em parafina mostra que os organoides mantêm a mesma histologia do câncer de mama. É crucial manter o BECM e o colágeno frios durante a pipetagem das cúpulas gelificadas para evitar a polimerização prematura. Além disso, a fixação prolongada de cúpulas em PFA levará a solução gelificada se realizar coloração imunofluorescente.
Os organoides também podem ser usados em procedimentos in vitro e in vivo, como telas de drogas e modelos de metástase em camundongos. Esses métodos podem fornecer insights sobre a sensibilidade terapêutica do tecido tumoral, propriedades metastáticas e interações imunológicas.
