Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW); American Heart Association, Fundadores da filial (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fundo, Nova York (SHP).

1. Preparação <ol><li> Preparar as seguintes soluções e tubos (Tabela 1) como se segue: <ol><li> Hanks, solução sem cálcio e magnésio, ou com o indicador de penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml). </li><li> Salina tamponada com fosfato (PBS), 1x, sem cálcio, nenhum magnésio. </li><li> Etanol, 70%, perfazer 500 ml. </li><li> Formol tamponado, 7-10% com PBS, perfazer 500 ml. </li><li> Anestesia soluções: <ol><li> Avertin. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Uma vez dissolvido, mantenha solução estoque, à temperatura ambiente, no escuro. Tomar 0,25 ml da solução-mãe e diluir com 10 ml de 1xPBS em frasco com fundo de vidro. Enrole a garrafa com folha de alumínio, lugar a 37 ° C até se dissolver e depois aliquota em 5 ml de tubos de polipropileno e manter no refrigerador. Aquecer uma alíquota, na manhã da experiência. </li><li> Barbitúricos. Diluir solução-mãe com PBS para dar origem a 2,6% barbitúrico solution. Colocar alíquotas de 3-4 ml em tubos de polipropileno. </li></ol></li></ol></li><li> Organizar três trabalhos-áreas (Figura 1). </li><li><ol><li> Área A: Organizar os seguintes itens: a forma de estudo para registrar o número de estudo de identificação, data, peso corporal, peso de coração direito, coração esquerdo e septo, balança de precisão (0-50 g de precisão de 0,01 g) para determinar o peso corporal; escala micro para determinar peso do coração em 0,001 g de precisão; pesar barcos; anestesia soluções (claramente marcado); dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa para coletar sangue e amostras de tecidos (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos ( A Tabela 2, Figura 2), e as soluções para limpar os instrumentos (Tabela 1). </li><li> Área B: Preparar os seguintes itens: microscópio de dissecação, cateter ventricular direita ligada a uma unidade de controlo de pressão que está conectado a um amplificador e um computador portátil. O cateter é colocadoum copo contendo água. Organizar instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), pedaços de corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; fita (fita de autoclave é ótima) cortados em comprimento e largura ideal e alinhados no banco ou microscópio de laboratório para o acesso fácil, cotonetes e solução de removedor de pêlos. Calibra-se o cateter no início do estudo. </li><li> Área C: Organizar os seguintes itens: lupa; cânula traqueal; seringas de 1 ml; corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa de recolher BAL e amostras de tecido (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), soluções para realizar BAL e para limpar a cânula traqueal e os instrumentos (Tabela 1). </li></ol></li></ol> 2. Cateterismo Cardíaco Direito <ol><li> Pesar mouse usando uma balança de precisão delicadamente colocando o mouse em um pesar baveia. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente. Grave peso. O protocolo descrito funciona melhor para ratinhos que são de 20 g ou mais, porque o diâmetro da veia jugular tem de acomodar o cateter de pressão, é possível a cateterização ratos pequenos (17 g ou mais), enquanto a veia é suficientemente grande. </li><li> Anestesiar o rato por injecção com Avertin, dependendo do peso corporal (10 ul / g), por exemplo, para dar 20 g 200 ul, para dar 25 g 250 ul, para dar 30 g 300 ml. O volume de injecção exacta tem de ser ajustado, dependendo da estirpe do rato. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente porque o estresse pode alterar a resposta ao anestésico. </li><li> Uma vez que o mouse é sedado lugar, em duplo papel de seda plissada. Note o número de identificação do artigo. Suavemente esfregue loção depilação no aspecto ventral do pescoço para limpar o campo cirúrgico. Posicione o mouse de volta para o papel e esperar por 1-2 min. </li><li> Remover os pêlos da face ventralno pescoço, acariciando o cabelo contra o sentido do crescimento do cabelo com cotonetes. </li><li> Cuidadosamente determinar a profundidade suficiente de anestesia, verificando a ausência do reflexo de pés: o mouse não reagir a beliscar de seus dedos. </li><li> Trabalhando rapidamente e descontraído, o restante do cateterismo cardíaco direito não deve levar mais de 10 minutos, de forma otimizada 3-6 min. É importante que o tecido não seca, porque o catéter tem de deslizar para dentro da veia e mover-se para dentro da veia em uma camada de humidade. Tempo consistente do processo é importante para a geração de dados que são comparáveis ​​entre os dois grupos. </li><li> Voltar lugar do mouse em papel de seda e de transferência com papel de seda em isopor bordo. Corrigir as patas ea cabeça no lugar usando fita autoclave. </li><li> Faça uma incisão de pele de mandíbulas para esterno (osso do peito). </li><li> Dissecar cuidadosamente para cima da tireóide grandes para as mandíbulas para expor a veia jugular direita umª traquéia. </li><li> Lugar de isopor placa segurando o mouse sob o microscópio de dissecção com o plano de foco já está em vigor e as lentes em aproximadamente 0,8 x ampliação (ampliação total [lente ocular x] é de cerca de 8x. </li><li> Microdissect cuidadosamente da veia jugular direita, removendo circundante tecido conjuntivo com pinça cirúrgica. </li><li> Colocar duas partes de fio de sutura na parte superior da veia jugular direita. Atar o fio de sutura mais próximo das mandíbulas para fechar o fluxo de sangue na veia de um fio pequeno, colocar o fio de sutura que está mais próxima do esterno / esterno em um nó frouxo em torno da veia. Pode-se usar as gotas pequenas de sangue para posterior encontrar o furo na veia, caso seja necessário. </li><li> Respire e relaxe (soltar os músculos do pescoço e da mandíbula) para manter seus olhos na veia através da ocular. Isso irá garantir que suas mãos e dedos vai passar de forma segura, suave e relaxante. Enquanto mantém a veia com uma pinça no lado mais próximoas mandíbulas, um furo na veia entre as duas suturas usando micro-tesoura operados por outro lado. Coloque as tesouras micro-, e manter essa relaxada mão, sentir o cateter. Suavemente recuperar o cateter segurando-o entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3). Introduzir o cateter no orifício da veia. </li><li> Suavemente avançar o cateter no interior do coração direito (Figura 3). Observar as marcas no cateter que dão um índice aproximado de quão longe o catéter tem de ser inserida e observar o monitor. Uma vez que as curvas de pressão são apresentados, apertar ligeiramente inferior a sutura em torno do cateter. Uma vez que o cateter tem uma resistência à tracção que lhe confere uma bobina, e porque a batida do coração e de respiração do rato adicionar movimento, adicionalmente fixar o cateter com fita. </li><li> Grave medições de pressão, durante 2 minutos para análise posterior (Figura 4). </li><li> Abrir o suporte da sutura do cateter e então suavemente retrieve cateter. Limpar a parte de trás do transdutor de pressão, local de volta para o recipiente com água. Não toque no transdutor de pressão. </li><li> Transferir o rato em cima do papel de tecido para a área A para a eutanásia, a recolha de sangue e tecido do baço. Limpar instrumentos cirúrgicos. </li><li> Iniciar o procedimento com o próximo animal. Quando o tempo permite, injetar o anestésico enquanto espera para gravar a curva de pressão (2,15). </li></ol> 3. Coleta de amostras de sangue e Baço <ol><li> Injectar solução barbitúricos, 400 ul por rato e espere por 1-2 min. Isto é realizado rotineiramente no nosso laboratório a fim de evitar a possibilidade de que, inadvertidamente, os ratos recuperar da anestesia, enquanto avertina-de sangrado. Normalização adequada do experimento é conseguido através da injecção da mesma dose de solução de barbiturato por rato, e pela espera a mesma quantidade de tempo antes da colheita de sangue. Se for permitido pelo Animal Care Institucional e Comitê Use econtanto que os animais são cuidadosamente monitorizados quanto a profundidade da anestesia antes da sangria, esta etapa pode ser omitida. </li><li> Faça uma incisão no abdômen. Abrir a veia caudal (veia cava), e colheita de sangue utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Remover o baço, ou uma parte do baço para dentro do tubo de Eppendorf e congelamento em azoto líquido, pressão, ou para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem para a preparação posterior de células individuais. </li><li> Transferir o rato em cima do papel de seda a área de trabalho-C para a recolha de BAL, o nodo de drenagem linfática de pulmão, pulmão, e os tecidos do coração. Limpar instrumentos cirúrgicos. </li></ol> 4. Recolha de amostras de pulmão e do coração <ol><li> Dissecar o livre traquéia de músculo e tecido conjuntivo. Fórceps colocação sob a traquéia, puxe através de sutura. Gentilmente gerar trecho suficiente para cortar um buraco. Manter o alongamento suave, inserir a cânula traqueal com um movimento ligeiramente girando, e sutura cânula intó lugar. Para a inserção da cânula traqueal, certifique-se de que a traqueia seja húmido, se necessário adicionar uma gota de solução de Hanks. Durante todo o processo, respirar, relaxar músculos do pescoço e da mandíbula, para manter os movimentos da mão segura e suave. </li><li> Dissecar abrir a caixa torácica, removendo cuidadosamente o esterno a partir da extremidade abdominal. Não perturbe o conteúdo do tórax, porque isso irá torná-lo muito difícil encontrar o nó de linfa. </li><li> Realizar lavado broncoalveolar (LBA) por inserção suavemente 1 ml de tampão de Hanks, vire suavemente a seringa e recuperar fluidos BAL. Repetir 3 vezes, o tubo estreito e colocar em gelo. Durante todo o processo, manter os olhos na extremidade da cânula traqueal que se conecta à seringa. Olhar para observar o tórax inflação e deflação dos pulmões. </li><li> Colheita linfonodo pulmão mantendo parede costelas com um conjunto de pinças, encontrar e recuperar o nó de linfa com outros fórceps. Nó de linfa lugar em 24 placa bem. É importante kagora onde procurar: a partir do pescoço, encontrar a entrada da caixa torácica a partir do lado direito do rato e olhar por cima da coluna (Figura 5). </li><li> Colheita coração e coloque em papel de seda. Isolar o coração direito, cuidadosamente dissecar ao lado do septo. Transferência para área de trabalho-A pesar, registrar o peso e colocar nos tubos de eppendorf para tirar congelamento em nitrogênio líquido. </li><li> Coloque sutura em torno do lobo do pulmão esquerdo para fechar o brônquio principal. Dissecar o pulmão esquerdo lobo livre, em lugar do tubo eppendorf e congelamento de encaixe em azoto líquido, ou local dentro de um poço de uma placa de 24 poços contendo uma solução de Hanks para o isolamento posterior de suspensões de células individuais. </li><li> Insira aprox. 0,5 ml solução de formol tamponado através da cânula traqueal para os lobos pulmonares restantes. Depois de inflação, dissecar os lobos pulmonares para fora do tórax e coloque em tubo de 50 ml contendo solução de formaldeído. Para um projeto de estudo alternativo, os pulmões podem ser inflados com otimismomal meios de corte (OCT, diluído a 1:4 com PBS) e congelados em um molde contendo outubro não diluídas para a preparação posterior de secções congeladas. Outro projeto de estudo pode exigir a obtenção de pressão tecido pulmonar congelado e suspensões de células individuais dos pulmões. Nesse caso, não é necessária a inflação: dissecar os lobos pulmonares restantes; recuperá-los a partir do tórax e do lugar para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem. </li><li> Remover cânula traqueal, limpo por lavagem com tampão de Hanks, limpar instrumentos cirúrgicos. </li></ol> 5. Análise de curvas de pressão gerada a partir do cateter do coração direito Os gravados dados de pressão do ventrículo direito são analisados ​​usando LabChart 7 software sem conhecimento da identidade de grupo de cada gravação. Mais de 20 curvas são seleccionados de forma aleatória e que a diferença entre máximo e mínimo de pressão ventricular medido para cada curva (AP). O AP média é calculada para dar o v direitapressão sistólica entricular.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O fluxo experimental descrito aqui permite a medição rápida e simultânea da pressão sistólica ventricular direita e colheita de amostras para a análise das respostas no pulmões, do coração e do sistema imune em ratinhos. O procedimento combina medições coração fisiologia, micro-dissecção e colheita de tecidos para estudos posteriores de células vivas, análise histológica, ou omics-análise dos tecidos. O procedimento completo demora menos de 20 minutos por ratinho. Por causa do fluxo de trabalho de tr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> 2-Metil-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-tribromoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> sabão desinfetante (Cobertura da Pulverização TB mais Steris) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-1608 </td><td></td></tr><tr><td> Álcool Etílico, 200 Proof, Absoluto, Grade ACS / USP anidro </td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Diluir a 70% com água destilada </td></tr><tr><td> Solução de formaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Diluir a 7-10% de uma formaconcentração ldehyde PBS a uma concentração de 1 x PBS utilizando solução mãe e água </td></tr><tr><td> Hanks, solução sem cálcio magnésio, </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 mg / ml) Solução </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), sem cálcio, sem magnésio, soluções 1x e 10x </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 26% de sódio pentobarbital </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> As placas 12, 24, 96 bem </td><td> Falcão </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Pipetar transferência </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-9BM </td><td></td></tr><tr><td> Tubo, revestida de EDTA </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos ml de 0,65 e 1,7 ml de centrífuga de micro- </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Os tubos de polipropileno de 12 x 75 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956 1D- </td><td></td></tr><tr><td> Tubos, vários tamanhos, polipropileno </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Fórceps, Dumon # 5 Fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, extra fino Graefe-0.5mm dicas curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, fi adicionalGraefe ne-0.5mm dicas reta </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Cânula 18ga, 19 ga </td><td> BD </td><td> Agulhas Precision Glide </td><td> Corte com o comprimento ideal, embotado e fora raspou para criar uma superfície áspera fora </td></tr><tr><td> Tesouras, tesouras dissector-slim lâminas de 9 centímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura para BAL, fio de seda trançada, 4-0 </td><td> Belas Science Tools </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura para cateterismo cardíaco direito, fio de seda trançada, 6-0 </td><td> Teleflex médica </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Amplificador, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modelo ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Pressão do cateter, F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fórceps, tesoura Vannas primavera-2 milímetros lâminas </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halogênio Iluminado Lupa Desk </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Computador portátil </td><td> Asus </td><td> Modelo número do processador i5 A52F; 15 polegadas </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de Luz </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Controle de Pressão </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Software, Labchart-Pro V.7 </td><td> Em ADtrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

A função do coração é bombear direito o sangue através dos pulmões, que liga a fisiologia do coração direito e fisiologia vascular pulmonar. A inflamação é um modificador comum do coração e da função do pulmão, através da elaboração de infiltrado celular, produção de citocinas e factores de crescimento, e, iniciando processos de remodelação 1. Em comparação com o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito é uma bomba de baixa pressão, que funciona de uma zona relativamente estreita de mudanças de pressão. O aumento das pressões de artéria pulmonar estão associados com aumento da pressão no leito vascular pulmonar e hipertensão pulmonar 2. A hipertensão pulmonar é frequentemente associada a doenças pulmonares inflamatórias, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças auto-imunes ou 3. Como a hipertensão pulmonar confere um prognóstico ruim para a qualidade de vida ea expectativa de vida, muita pesquisa é direcionada para a compreensão dos mecanismos que might ser alvos para 4 intervenção farmacêutica. O principal desafio para o desenvolvimento de ferramentas de gestão eficazes para a hipertensão pulmonar permanece a complexidade da compreensão simultânea de alterações moleculares e celulares no coração direito, os pulmões eo sistema imunológico. Aqui, nós apresentamos um fluxo de trabalho de procedimento para a medição rápida e precisa de mudanças de pressão no coração direito de ratos e a colheita de amostras em simultâneo a partir de coração, pulmões e tecidos imunes. O método baseia-se no cateterismo directa do ventrículo direito através da veia jugular em estreita de peito ratinhos, desenvolvido pela primeira vez na década de 1990, como medida substituta da pressão na artéria pulmonar 5-13. A equipe de abordagem organizada facilita muito rápida técnica de cateterismo do coração direito. Isto faz com que seja possível realizar as medições em ratos que respiram espontaneamente com ar ambiente. A organização do fluxo de trabalho em diferentes áreas de trabalho-reduz o tempo de atraso e abre a possibilidade de realizar simultaneamente experimentos de fisiologia e colher tecidos do coração, pulmão e imune. O fluxo de trabalho de processo descrito aqui pode ser adaptado para uma grande variedade de ambientes de laboratório e desenhos de estudo, desde pequenas experiências orientadas, para testes de rastreio grandes drogas. A aquisição simultânea de dados da fisiologia cardíaca que pode ser expandida para incluir a ecocardiografia 5,14-17 e colheita de tecidos de pulmão, coração e imunológico, reduz o número de animais necessários para obter os dados que se movem a partir do conhecimento científico para a frente. O fluxo de trabalho processual apresentada aqui também fornece uma base ideal para ganhar o conhecimento das redes de ligação de pulmão, imune e função cardíaca. Os mesmos princípios aqui descritos podem ser adaptados para estudar outros órgãos ou adicionais, se necessário.

O desfecho primário para a obtenção de curvas de pressão direito do coração é conseguido por a posição correcta do cateter ventricular direita. A forma das curvas de tempo de pressão é crítica, porque a correcta colocação do cateter no interior do ventrículo direito irão resultar em patamares de pressão (Figura 4). Curvas de picos, em vez disso, indicam um cateter que é movida pela respiração ou movimento batida do coração contra a parede do ventrículo direito. Para detectar poss?...

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Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

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25.0K visualizações.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Vídeo: Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

Indução de Maternal Immune Activation em Ratos na Fase Mid-gestação com Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Aplicação de consistente massagem-como perturbações em bezerros do mouse e monitoramento das mudanças de pressão intramuscular resultante

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

Monitoramento de Elastase e Cathepsin G Atividade em Amostras de Espiuma Humana

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.