This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

Rotular os recipientes a serem utilizados para o armazenamento de músculo com identificadores apropriados para o animal e colhido do músculo. Pré-resfriar os sacos / recipientes e instrumentos para prevenir congelamento / descongelamento do tecido quando ele é adicionado. 1. Considerações Estudo de design para a Coleta de tecido muscular <ol><li> Para as pequenas modelos animais (murina) de doença muscular, use um músculo inteiro para o estudo desde pequenos modelos animais muitas vezes exigem avaliação de um músculo inteiro para proporcionar amostragem myofiber suficiente para estudos patológicos. Para grandes modelos animais (caninos) de doença muscular, usar porções musculares que são pelo menos 0,3 x 0,3 cm ou mais na sua transversal (transversal) aspecto. NOTA: biópsias núcleo também pode ser usado, mas podem ser sub-óptima em estudos de caracterização primárias devido a problemas de amostragem. </li><li> Para estudos envolvendo sarcómero, a medição do comprimento ultraestrutural sarcómero pode compreender um parâmetro crítico e pode requira especializada manuseio. Isso geralmente só é relevante em doenças onde elementos dos comprimentos inadequados sarcômero mostra, como em algumas causas de nemalínica miopatia. Alguns laboratórios preferir corrigir o músculo em seu estado não-contratado ou esticado, ao invés de executar essas medidas no músculo não-tensionadas ou não esticado. <ol><li> Se o comprimento do sarcômero não serão medidos, fixar o tecido muscular, sem pré-alongamento do músculo, colocando-o diretamente para o fixador EM desejado (ver Reagentes). </li><li> Se comprimentos de sarcômero será medido, pode ser usado várias técnicas para pré-estiramento no músculo (ver discussão): <ol><li> Usar um dispositivo de aperto para segurar o músculo na sua tensão de repouso enquanto ela ainda está no animal, excisar o músculo à volta do exterior do grampo, e colocá-la directamente para o fixador EM desejada (ver Reagentes). </li><li> Esticar e fixar o músculo a uma superfície (tal como um pedaço de cortiça) com um comprimento semelhante ao observado <em&gt; in vivo após ter sido extraído a partir do animal. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sub-dividir o Músculo Esquelético isolada em fragmentos que são apropriados para os Estudos desejado (Figura 1) <ol><li> Para histologia muscular congelados: <ol><li> Inclua o máximo de um determinado músculo quanto possível para minimizar o viés de amostragem (veja o passo 1.1), mas os espécimes devem ser &lt;1,5 centímetros para evitar o congelamento artefatos. </li><li> Tratar todos os músculos do mesmo estudo semelhante para evitar diferenças artefatuais no tamanho das fibras devido a diferenças no manuseamento. </li></ol></li><li> Para a microscopia eletrônica (EM): <ol><li> Cortar uma ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 centímetros da faixa de músculo a partir da amostra, com o eixo longitudinal da amostra paralela ao eixo longitudinal do músculo inicial. NOTA: O fixador não penetram adequadamente pedaços mais grossos do tecido, mantendo assim a espessura da amostra ou menos 2 milímetros é crucial para a obtenção de resultados adequados. Adicionalmente,como orientação de tais pequenos fragmentos de músculo é muitas vezes difícil, é aconselhável a utilização de um fragmento de tecido que imita a orientação real do músculo (por exemplo, o aspecto mais longo da amostra é fixa a orientação longitudinal do músculo / miofibras) para minimizar o manuseio e confusão durante o processamento de EM. </li></ol></li><li> Para a cultura de células: <ol><li> O rendimento das células desejado pode afetar a quantidade de músculo necessária para estabelecimento de cultura celular. Músculos individuais (ou porções de músculos) de pequenos animais pode fornecer o número de células suficientes para estabelecer culturas de células, de modo que, se necessário, o tecido piscina de vários músculos. </li></ol></li></ol> 3. Fixação do tecido e Processamento de Microscopia Eletrônica (EM) <ol><li> Coloque um pedaço de músculo não superior a 2 mm na sua dimensão mais fina diretamente para o fixador EM desejado (ver Reagentes). </li><li> Coloque o músculo em tampão fixador EM (ver Reagentes) após 2-48 horas de FIXAÇÃOna. Fixação prolongada (semanas ou meses) pode resultar na perda de pormenor ultra-estrutural em estudos de EM. </li><li> Enviar para uma instalação de núcleo EM para processamento. </li></ol> 4. Congelamento músculo por histológica, bioquímica e estudos moleculares <ol><li> Remover a humidade excessiva na amostra por blotting cuidadosamente a amostra com uma toalha de papel até que o tecido é ligeiramente aderente à toalha. A umidade excessiva irá produzir artefatos de congelamento significativas no músculo. NOTA: Os tecidos podem ser mais secos por implantá-la em pó de bebê. Este passo não é geralmente necessário para os músculos a menos que tenham sido em um ambiente excessivamente úmido. </li><li> Coloque outubro (ou um adesivo semelhante, tal como goma de tragacanto) no fundo de um cryomold superficial ou em cortiça, com apenas o suficiente OCT para fornecer uma base para o músculo orientada (Figura 2C). Rotular a cortiça ou cryomold antes de congelamento pode ser útil para o rastreamento de amostras. </li><li> Carefully colocar o músculo no molde na orientação desejada, com a maior parte do músculo que se projeta da outubro de modo a que o músculo em corte não está em contacto com outubro (Figura 2C). </li><li> Adicionar isopentano a uma taça de metal, até atingir uma profundidade de cerca de 3-4 cm. </li><li> Coloque luvas de segurança térmica e retire a tampa de Dewar. </li><li> Coloque ou segurar o copo de metal em contacto com o azoto líquido, de modo que o nível de azoto líquido sobre o exterior do copo está acima do nível do isopentano no interior do copo. Estratégias para arranjar esses recipientes são mostrados na Figura 2. <ol><li> Não permita que o nitrogênio líquido para entrar no copo de metal, uma vez que produz uma espuma borbulhante que pode ser complicado para trabalhar com (e também não é suficientemente fria para congelamento). </li></ol></li><li> Observar o isopentano para determinar quando se atingiu a temperatura adequada. À temperatura apropriada (optimamente entre -140 a -149 ° C), de modotampa seixos brancos de isopentano congelado irá formar (depois de alguns minutos, e depois o nevoeiro inicial desapareceu acima do isopentano) no fundo do copo, ou a solução terá geralmente mais espesso para a consistência de melaço. Congelamento antes desta fase irá produzir atifacts congelamento. <ol><li> Se o isopentano completamente congela, descongelar e chill-lo a temperaturas de congelamento novamente antes do uso subseqüente. </li></ol></li><li> Utilizando uma pinça pré-refrigerados, abaixe o espécime e cortiça / molde para o isopentano por cerca de 10-20 segundos. </li><li> Coloque a amostra congelada em um recipiente pré-resfriada. </li><li> Mantenha a amostra e o recipiente em gelo seco em todos os momentos até à transferência para um congelador a -80 ° C. </li></ol> 5. Se Artefato congelamento está presente no tecido já congelados, é possível melhorar o grau de Artefato congelamento usando o seguinte &quot;Thaw e recongelar&quot; Procedimento <ol><li> Tome blocos fora do freezer, um de cada vez, E mantê-los em gelo seco. O timing deste protocolo é fundamental. Só descongelar e voltar a congelar um bloco de cada vez. </li><li> Mova amostra de gelo seco para RT. </li><li> Se a amostra foi incorporada em outubro, retire a outubro circundante tão completamente quanto possível, utilizando um bisturi. </li><li> Deixar a amostra a descongelar à temperatura ambiente até ao ponto em que ele é completamente descongelado, mas não até ao ponto em que está a secar para fora. <ol><li> Prod suavemente a amostra com uma pinça para garantir que a amostra é totalmente descongelada antes de avançar para o passo seguinte. </li></ol></li><li> Congelar o músculo, como especificado em passos 4,1-4,10. </li></ol> 6. Preparação de músculo por painel simples Fibra Testes Funcionais <ol><li> O processo de armazenamento para o músculo depende de quando o músculo / fibra está a ser utilizado para as experiências. <ol><li> Para uso dentro de algumas semanas, coloque o músculo em uma solução de 50% glycerol/50% solução relaxante (ver Reagentes), e armazenar a -20 ° C. </li><li> Para utilização réer algumas semanas, colocar o músculo em uma solução de 75% glycerol/25% solução repouso (ver Reagentes), e armazenar a -80 ° C. </li><li> Alternativamente, deixe muscular seca, pinos para cortiça, e armazenar em grânulos de sílica a -80 ° C. Estes músculos desidratado pode ser utilizado durante anos. </li></ol></li></ol> 7. Preparação de músculo fresco para a expedição de Cultura de Células para laboratórios externos Protocolos para o estabelecimento de culturas de células têm sido bem descritos em outra parte 4-7. <ol><li> Encha um tubo de 50 ml estéril com meio de cultura completo estéril. </li><li> Adicione o tecido muscular para o tubo usando uma pinça estéril, completamente submergindo o tecido na mídia. <ol><li> Encher o restante do tubo com os meios para evitar a secagem durante a expedição. </li></ol></li><li> Adicionar blocos de gelo para a caixa de isopor e coloque o tubo cônico perto de vários blocos de gelo. <ol><li> Por favor, note que apenas blocos de gelo (e não gelo seco) deve ser utilizadopara evitar danos de congelação do líquido e do tecido. </li></ol></li><li> Pacotes de navio S / N, mas os tecidos podem duração de 2 dias, sob estas condições. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+separation+of+rat+skeletal+muscle+myosin+heavy-chain+isoforms.">Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms.</a> J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).</li><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+properties+of+pure+populations+of+human+dystrophic+muscle+cells.">Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells.</a> Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis,+delayed+proliferation,+and+poor+cell+engraftment.">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Webster, C., Blau, H. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+type+IIb+increases+strength+and+lifespan+in+myotubularin-deficient+mice.">Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice.</a> Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).</li><li>Mula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+cross-sectional+area.">Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area.</a> J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).</li><li>Nance, J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+tropomyosin+3+(TPM3)+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O músculo esquelético é um tecido estrutural e funcionalmente única, e os procedimentos de preparação especializadas são necessárias para permitir a avaliação ótima de parâmetros estruturais e funcionais. Enquanto uma variedade de tecidos são normalmente congeladas para estudos patológicos em contextos clínicos e de pesquisa, os protocolos de congelação para não-tecidos musculares usualmente envolvem a imersão total do tecido em OCT, antes da congelação. Como mostrado na Figura 3, um tal protocolo é inadequado para a avaliação patológica do músculo esquelético e no entanto é bastante parecido com o protocolo descrito aqui que este é um erro normalmente encontrado. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples para o tratamento adequado da musculatura para evitar problemas como este. Conselho também foi compilado no tratamento adequado dos músculos para fora do local fisiológico e estudos celulares, em um esforço para facilitar a aquisição de dados de alta qualidade pelos laboratórios centrais de fora em casos where estudos no local não são preferíveis ou possível. Conforme observado neste protocolo, elementos que são absolutamente essencial no processamento adequado do músculo para estudos patológicos incluem minimizar o conteúdo de água do tecido, diminuindo a temperatura a que o músculo está congelado, e aumentando a velocidade a que é atingido o congelamento. A umidade excessiva dentro do tecido ou lentidão excessiva do processo de congelamento (produzido por temperaturas insuficientes ou pela falta de contato direto entre o agente de congelamento e do tecido, como é encontrado com nitrogênio líquido) vai levar a congelamento artefatos que podem prejudicar a análise patológica. Como outubro fornece uma fonte adicional de humidade nos tecidos, muitos laboratórios usam outros adesivos como goma tragacanth como substrato incorporação. Mesmo nos casos em que o congelamento é realizado de forma adequada, cuidados devem ser tomados para evitar posteriormente descongelar acidentalmente espécimes através do contato com recipientes ou instrumentos RT.Assim, um processo de congelação bem sucedida requer um grau de planeamento, que inclui um pré-refrigeração de todos os instrumentos e os recipientes a ser usados. Quando artefactos de congelamento são encontrados, existe um método aqui descrito, para a recuperação do tecido que é suficiente para a maioria das avaliações patológicas. No entanto, este ciclo de congelamento / descongelamento não oferece histologia perfeito e tem o potencial de prejudicar a outros estudos moleculares ou enzimáticas do tecido (para além do tempo necessário para voltar a congelar o tecido), de modo usando práticas apropriadas de congelamento inicial é muito preferível . Nos casos em que o congelamento artefacto é encontrado no tecido pré-congelado, no entanto, a técnica aqui descrita pode ser extremamente útil. Fixação e processamento de tecido para EM podem oferecer desafios técnicos específicos que exigem planejamento antes da coleta do tecido. O erro mais comum ao coletar espécimes para EM envolve o uso de fragmentos de tecidos que são muito espessas para glutaraldehyde para penetrar. Como glutaraldeído só penetra aproximadamente 0,1 cm no tecido muscular de uma superfície dada, cuidados devem ser tomados para garantir que uma das dimensões das amostras de EM não é mais espessa do que 0,2 cm. Além disso, como o EM é um excelente meio de avaliar diretamente o aparelho contrátil, alguns pesquisadores têm desenvolvido estratégias de pré-tensão ou pré-estiramento no músculo antes da fixação para permitir a medição de elementos contráteis a uma tensão fisiologicamente relevante. Não existe um protocolo padrão para o pré-tensionamento, mas duas estratégias são descritas resumidamente neste protocolo. Deve notar-se que as tentativas de pré-tensionamento do músculo pode produzir resultados imprevisíveis a menos que sejam feitas de uma forma muito específica, e que pode ser preferível fixar os músculos no estado de folga para evitar alterações de comprimento artefatuais sarcómero por meio de um não-padrão procedimento de pré-tensionamento 8,9. Para os músculos em que tais medidas específicas não são necessárias (incluindo mais biopsies realizadas para fins clínicos), os esforços de pré-tensão do músculo em geral, não são feitas, e o principal efeito sobre a morfologia do músculo é um espaçamento não uniforme das sarcomeres no músculo. Este trabalho representa o primeiro de uma série para fornecer SOPs para a realização de ensaios de campo doença muscular congênita, e representa os esforços de mais de 20 especialistas na área doença congênita do músculo que rotineiramente celular, molecular e funcional, fisiológico e investigação patológica. Uma gama de SOPs publicados serão disponibilizados ao longo do ano que vem, e os protocolos necessários e formatos de publicação apropriadas para cada foram discutidos em uma Muscle Congênita Doenças Consórcio Oficina realizada em abril de 2013, em Washington DC O objetivo deste esforço SOP é fornecer um roteiro para os testes necessários e análise de amostras no campo congênita doença muscular a 1) padronizar as práticas e os terminais utilizados em nosso campo como muito possível, e 2) fornecer instruções sobre as práticas padrão para novos pesquisadores em nosso campo. Acreditamos que esses recursos vão facilitar a entrada de novos pesquisadores em nosso campo de sub-estudado e, assim, melhorar o âmbito da investigação que podem ser executadas. Além disso, a padronização das práticas será extremamente útil para comparar os dados entre os estudos e identificar os pontos de extremidade quando o planejamento e realização de ensaios pré-clínicos e clínicos. Embora o foco principal deste artigo está relacionado ao congelamento e preparo de tecido apropriado para uma variedade de estudos, o nosso grupo colaborativo também discutiu os parâmetros úteis para a análise patológica de amostras musculares. No momento, não há consenso oficial sobre a abordagem a tomar quando se realiza a análise patológica, e uma variedade de diferentes estudos são realizados para relacionar as novas descobertas de publicações anteriores para cada uma das doenças visadas. Assim, pensamos que seria útil parapropor algumas diretrizes gerais para o planejamento de endpoints patológicas no músculo patologia caracterização. Antes de quantificar a patologia em um estudo, o pensamento considerável deve ser colocado em 1) o método de medição do tamanho da fibra, 2) a possibilidade de anomalias de fibra de tipo específico, ou os efeitos do tratamento, 3) a possibilidade de anormalidades ou efeitos que são restritos de músculos individuais, e 4) uma estratégia para quantificar alterações patológicas que são característicos para a doença sob estudo. Tamanho da fibra é um ponto final necessário para a maioria dos estudos, e, infelizmente, há extensa variação na forma como é quantificado. Muitos estudos relatam esses resultados usando métodos de quantificação automatizados fornecidos pelo software de imagem proprietário, mas muitos desses programas tomar atalhos (como assumindo que as fibras são círculos ou elipses) que podem tornar essas medições automatizadas impreciso. É necessário entender como esses programas automatizados fazer suas medições bntes de ter confiança nas medidas, e nós encorajamos os investigadores para incluir esses detalhes nos métodos de papel. Além disso, a medida específica usada para indicar o tamanho da fibra é extremamente variável, e algumas medições são preferíveis a outros 10,11. Uma medida comumente utilizada de tamanho da fibra é a área da seção transversal da fibra (CSA), principalmente porque os investigadores realizam estudos fisiológicos padronizar os resultados das medições CSA obtidos utilizando os seus instrumentos. Infelizmente, enquanto que as medições de CSA pode reflectir com precisão o tamanho da fibra, em secções transversais perfeitos, eles são largamente dependente da orientação da fibra (na medida em que as fibras longitudinais ou obliquamente seccionados terá medições CSA artificialmente altos) e são, assim, as medições não ideais para o tamanho da fibra. A medição do tamanho preferível de fibra que é menos dependente de fibra de área de secção transversal é o diâmetro de Feret mínimo (diâmetro MinFeret), que é a medida de the diâmetro menor na célula muscular 12. Esta medida é apenas um pouco dependente de orientação das fibras e geralmente é o padrão-ouro para a medida clínica da fibra, e os investigadores são encorajados a se mover para o uso desta técnica. Estas medições podem frequentemente ser feitos usando o mesmo software que gera medições CSA 13, e também são fáceis de medir manualmente. Com relação à avaliação dos dados patológicos de acordo com o tipo de fibra, músculo específico, e no contexto de achados patológicos relacionados com a doença específica, estas são questões menos controversas que devem apenas ser considerados durante o planejamento de um estudo. O tipo de fibra pode ser avaliada usando coloração imuno-histoquímica ou ATPase, mas é útil considerar que os músculos específicos e espécies animais têm misturas específicas desses tipos de fibras (necessitando, assim, expectativas diferentes e testar estratégias). Envolvimento patológico específico muscular ou a eficácia do tratamentopodem ocorrer, e peso do músculo do total em comparação com os controlos podem ser utilizados para identificar o grau de heterogeneidade da doença antes de decidir sobre os músculos para avaliar patologicamente. Finalmente, é bem sabido que muitas doenças musculares estão associadas a anomalias patológicas específicas (tais como barras de nemaline em miopatia nemalínica 14,15), e por isso também é útil para determinar se estas anormalidades são encontradas num tipo de fibra muscular ou -específica de distribuição ao realizar a análise 16,17. Em geral, embora nós não propor um conjunto inflexível de normas para a avaliação do músculo, nós acreditamos que estas questões devem ser consideradas antes da realização de estudos patológicos de qualquer doença do músculo esquelético.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

O músculo esquelético é um tecido único devido à sua estrutura e função, o que requer protocolos específicos para coleta de tecido para se obter os melhores resultados a partir de avaliações funcionais, celulares, moleculares e patológicas. Devido à sutileza de algumas anomalias patológicas observadas em doenças musculares congênitas eo potencial de fixação de interferir com o reconhecimento destas características, a avaliação patológica do músculo congelado é preferível muscular fixo ao avaliar o músculo esquelético para a doença muscular congênita. Além disso, o potencial para a produção de artefatos de congelamento graves no músculo exige precauções específicas quando o congelamento do músculo esquelético para exame histológico que não são comumente usados ​​quando o congelamento outros tecidos. Este manuscrito descreve um protocolo de congelação rápida do músculo esquelético usando isopentano (2-metilbutano), arrefecido com azoto líquido para preservar a morfologia óptima músculo esquelético. Este processo também é eficaz para freezing tecido destina-se a estudos de expressão genética ou de proteína. Além disso, integramos nosso protocolo de congelação em um processo mais amplo, que também descreve os métodos preferidos para a triagem de curto prazo de tecido para (1) fibra única estudos funcionais e (2) cultura de células mioblastos, com um foco no esforço mínimo necessário para coletar tecidos e transportá-lo para pesquisa ou laboratórios de referência especializados para concluir estes estudos. No geral, este manuscrito fornece um esboço de como tecido fresco pode ser efetivamente distribuído para uma variedade de estudos fenotípicos e, assim, fornece procedimentos operacionais padronizados (POPs) para estudos patológicos relacionados com a doença muscular congênita.

Para dar exemplos dos artefatos visto com o congelamento imprópria, vários músculos do quadríceps rato foram congelados utilizando diferentes técnicas (Figura 3) para replicar os erros comumente encontrados. Como mostrado na Figura 3A, o músculo esquelético adequadamente congelada mostra uma aposição apertada de miofibras que o tecido circundante (normalmente outras fibras musculares, mas, por vezes, o espaço entre endomisial miofibras é preenchido com fibrose ou células inflamatórias numa variedade de doenças ou processos de lesão) e um compartimento citoplasmático claramente visível. Para a análise patológica, a capacidade de visualizar o espaço intracelular é muitas vezes mais importante do que o compartimento endomísio, como é normalmente crítico para identificar claramente a presença de alterações degenerativas, alterações regenerativas, ou outros achados patognomônicos (núcleos centrais, inclusões intracelulares) neste espaço. Assim, a presença de cristais de gelo no compartimento intracelular representa amproblema ajor na avaliação patológica do músculo. Congelação adequada do tecido muscular requer ambas as temperaturas suficientemente frias e uma velocidade suficiente de congelação para evitar a formação de cristais de gelo. Mesmo quando respondendo por ambos os fatores, considerável artefato congelamento ainda pode ocorrer devido a umidade excessiva dentro do tecido muscular. Este problema é mais comumente encontrado no tecido muscular que tinha sido previamente imersos em solução salina e insuficientemente secas ou quando o músculo está em contato direto com outubro meios de montagem no local de corte (Figura 3B, 3E). Enquanto algum contato com outubro é geralmente inevitável, como consequência do processo de montagem, devem ser feitos todos os esforços para evitar o contato entre as áreas que serão avaliadas histologicamente e os PTU utilizados para a montagem. Em contraste, as amostras congeladas utilizando um congelador a -80 ° C (Figura 3C) e do azoto líquido (Figura 3D) fornecer exemplos de artefacto de congelação que é produzido pela temperatura sub-óptima ou a velocidade de congelação. O processo de congelação lenta encontrado colocando o tecido em um congelador a -80 ° C fornece um exemplo extremo de congelamento artefato. Quando utilizando azoto líquido, o principal problema é que o contacto entre o azoto líquido e o tecido provoca uma bainha de azoto gasoso para formar na interface tecido-líquido, e esta interface gasosa não é suficientemente frio para produzir músculo rápido congelamento 1. Isto pode produzir artefato congelação significativa perto da superfície da amostra, mas as áreas internas do espécime são mais propensos a piscar por congelação a uma taxa adequada e pode ser totalmente poupada de congelação artefato. Enquanto a simples imersão do tecido muscular em nitrogênio líquido está longe de ser tão útil quanto o processo de congelamento isopentano, ele pode ser útil para o congelamento de grandes espécimes musculares em situações onde isopentano não está disponível (tais como amostras de autópsia clínicos em instituições comlaboratórios de patologia muscular clínicos fora). Resultados usando esta estratégia são geralmente melhor quando se utiliza grandes porções de tecido (&gt; 2 cm de várias dimensões). Enquanto a evitar artefato congelamento proporciona óptimos resultados histológicos, a técnica também tem sido desenvolvido (e aqui descrito) que substancialmente inverte congelação artefactos para permitir a avaliação de tecido congelado de forma inadequada. Tecido que está indevidamente congelado (Figura 3E) pode ser descongelada e recongelada sob condições rigorosamente controladas (Figura 3F) para permitir que a redistribuição de água no interior das fibras, e o grau de preservação morfológica que é obtido pode ser excelente. Na nossa experiência, este processo preserva a morfologia intracelular do tecido de uma forma notável, mas, muitas vezes produz um artefacto de separação das fibras no interior do espaço endomisial. Como muitos pontos de extremidade patológicas são encontrados no espaço intracelular e aqueles emo espaço endomisial é melhor visualizada através de colorações especiais (tanto para destacar fibrose ou para identificar outros tipos de células), essas mudanças de artefatos não são susceptíveis de prejudicar verdadeiramente a avaliação patológica do músculo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Triagem de tecidos para estudos estruturais, funcionais e celulares do músculo esquelético. Dependendo dos tipos de estudos desejados, o tecido do músculo esquelético recolhido pode ser processada numa variedade de maneiras para obter os melhores resultados. Os protocolos descritos neste documento descreve métodos para triagem ou processamento de amostras de músculo esquelético para estudos fora do local para otimizar os resultados que podem ser obtidos a partir de instalações de centrais de especialistas. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Exemplos de aparelhos utilizados para o congelamento do músculo. Tal como descrito no protocolo de congelação óptima muscular requer a imersão do tecido muscular em isopentano que é a sua temperatura de congelação. Um meio seguro e eficiente de obtenção de isopentano arrefecido em gelo envolve o uso de um recipiente metálico para o isopentano que é arrefecida num Dewar contendo azoto líquido circundante. Como muitas vezes é conveniente ter ambas as mãos livres, é possível a utilização de uma cinta, tal como um anel de suporte (A) para segurar o recipiente isopentano no azoto líquido, evitando-se a mistura dos dois líquidos. Alternativamente, o recipiente também pode ser realizada no nitrogênio líquido manualmente (B). Em ambos os casos, o tecido não deve ser colocado no isopentano até o isopentano é visivelmente congelação na parte inferior do recipiente (normalmente como seixos brancos opacos), e em seguida, deve ser imersa durante 10-20 segundos para permitir que o congelamento completo. Isopentane à temperatura de congelamento produz mínimo &quot;nevoeiro&quot;, (ou seja, a temperatura é insuficiente se considerável nevoeiro está presente). Uma vez que o tecido é congelado, coloque-o diretamente em recipientes pré-refrigerado (e, em seguida, diretamente em um refrigerador ou no freezer) para evitar o descongelamento acidental após o congelamento. Músculo congelado (C) apropriadamente montada deve ter a maior parte do tecido muscular que sobressai a partir de uma base de gelado outubro <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Exemplos de congelação artefacto, e eficaz de descongelação / recongelação. Imagens representativas de (A), apropriadamente de isopentano músculo congelado, (B), apropriadamente músculo congelado em isopentano, mas ao mesmo tempo em contacto com o meio de montagem outubro, (C) músculo congelado em um congelador a -80 ° C, e (D </forte&gt;) músculo congelado em azoto líquido, os quais exibem diferentes graus de congelação artefato. Como mostrado em (B), o alto teor líquido de outubro produz artefato congelamento significativo no músculo que está em contato com ele, portanto, apenas a quantidade mínima de outubro necessário para a montagem deve ser usado, eo músculo para avaliação histológica deve ser &quot;em pé out &quot;de sua superfície. A lentidão do processo de congelamento, utilizando um (C) -80 ° C congelador ou (D) de azoto líquido (em relação à velocidade de congelação em gelo isopentano frio) podem conduzir à produção do produto manufacturado congelação significativa. Painéis E e F mostram o músculo do mesmo espécime que era (E) inicialmente subótimamente congelado (devido ao contacto excessivo com OCT) e (F) descongelado e novamente congelado usando a técnica aqui descrita. Embora se possa observar uma certa separação entre artifactual fibras na amostra refrozen, o i melhorian morfologia intracelular das fibras musculares é facilmente perceptível. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

tissue-triage-and-freezing-for-models-of-skeletal-muscle-disease

Research

JoVE Journal

Biology

39.8K visualizações.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Vídeo: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...