Agradecemos Fiona Foley para suporte excelente laboratório e cuidados zebrafish. Este trabalho foi suportado uma comunhão AHA predoctoral a GW (11PRE5730027) e concede NHLBI para HJY (R01HL66292) e ADC (R01HL095690).

Visão de Estágio Específicos Injeções Embrião Zebrafish Os oligonucleótidos anti-morfolino (MO), os quais se ligam a um ARNm alvo e interromper a expressão de proteína a partir dessa transcrição, são amplamente utilizados no gene knockdown (perda de função) Estudos em peixes-zebra 13,14. Ferramentas de genes, LLC oferece MOs que são marcados com um carboxifluoresceína (emite fluorescência verde) ou lissamina (emite fluorescência vermelha) para detectar MO em embriões injetados usando microscopia de fluorescência. Por injecção de MO na célula gema em diferentes estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, é possível entregar o MO para compartimentos específicos do embrião (Figuras 1A-F). MO injectado na gema entre os estágios de células 1-4 (0-1 hpf) entra todas as células embrionárias (Figuras 1A, D, D &#39;), através de ligações com a gema que persistem até que a fase de 32 de células 15 para facilitar o knockdown global. MO injectado na gema durante midblastfases ula (2,5-3 hpf) pode introduzir os progenitores das DFC (Figuras 1B, E, E &#39;) provavelmente através de pontes citoplasmáticas 8 e função do gene knockdown especificamente na linhagem celular DFC / KV 12, sem introduzir mais outras linhagens de células embrionárias . Como um controlo importante para testar se a função do gene é requerido em DFC / KV ou também na gema 12,16, também é possível restringir o MO para a célula por injecção de gema entre as fases epiboly de cúpula de 30% (~ 4,5 hpf) depois todas as pontes citoplasmáticas ter fechado (Figuras 1C, F, F &#39;). Estas injecções foram utilizados em combinação para analisar a função do gene na DFC / KV células 17-24. Para avaliar o fluxo de fluido em KV, microesferas fluorescentes são injectados para dentro do lúmen KV entre as etapas 6-10 somito (12-14 hpf) e, em seguida, imediatamente fotografada usando videomicroscopia (Figuras 1G-J). Microesferas estão disponíveis, que emitem fluorescência vermelha ou verde (ou ambas), de modo que é possível a utilização de diferentescanais para imagem fluorescente micro e MO. 1. Fase específica de injeção de morpholinos (MO) Injecção de MO em embriões de peixe-zebra foi demonstrado anteriormente 25,26. Aqui, descrevemos brevemente injeções de estágio específicas MO. Seguindo todas as injecções, os embriões são transferidos para uma placa de Petri e incubou-se a 28,5 ° C. <ol><li> Injeção MO Global: Coletar embriões logo após a fertilização e carregá-los em uma placa de injeção. Carregar MO fluorescente em uma agulha capilar e montar a agulha para um microinjector (por exemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector). Quebrar a ponta da agulha de injecção e ajustar as configurações (pressão e / ou tempo) para criar uma queda de injecção que tem um volume de 1 nl, como descrito 25,26. Usando um estereomicroscópio de dissecação, injectar 1 nl de MO na gema (Figura 1A) de ≥ 50 embriões por experiência. Trabalhe rapidamente para completar injeções pelo veado de 4 célulase. </li><li> DFC-alvo injeção MO: Coletar embriões logo após a fertilização e incubar a 28,5 ° C. Quando os embriões terem atingido a fase 256 células (~ 2,5 hpf), rapidamente carregá-los em uma placa de injecção e, em seguida, injectar 1 nl de MO fluorescente na gema de ≥ 100 embriões entre os estágios de células 256 e 1000 células (Figura 1B). </li><li> Gema-alvo injeção MO: Coletar embriões logo após a fertilização e incubar a 28,5 ° C. Na fase de cúpula (~ 4 hpf), carregar os embriões em uma placa de injecção e, em seguida, injectar 1 nl de MO fluorescente na gema de ≥ 100 embriões entre a cúpula e os estágios epiboly 30% (Figura 1C). </li></ol> 2. Seleção de Embriões injetados para Análise <ol><li> Quando MO embriões injectados atingir o estágio 75%-epiboly (8 hpf), remover os embriões não fertilizados e em seguida os embriões mortos e vivos tela sob um microscópio de dissecação para a distribuição de fluorescência da MO fluorescente. Então allow selecionados embriões para desenvolver a 28,5 ° C. <ol><li> Por mundial MO injecções, seleccionar os embriões que foram distribuídos uniformemente na fluorescência ao longo de todas as células embrionárias (Figura 1D; Figura 2A). </li><li> Para DFC-alvo MO injecções, seleccionar os embriões em que MO fluorescente tem espalhado por toda a gema e aparece concentrada na margem dorsal blastoderme (DFC) (Figura 1E; Figura 2B). Nesta fase, pode ser difícil de visualizar SFD fluorescentes devido à fluorescência brilhante na gema subjacente. Ter o cuidado de excluir embriões em que o MO fluorescente tem incorporadas outras células embrionárias de DFC ou agregados permanece no local de injecção (Figura 2D). </li><li> Para gema-alvo MO injeções, selecionar embriões em que MO fluorescência é uniformemente distribuídos por toda a gema e não observado em todas as células embrionárias (Figura 1F; Figura 2C). Mais uma vez, os embriões em que remover a MO fluorescente permaneceagregados no local da injeção. </li></ol></li><li> Entre as fases 2-4-(~ 11 somito hpf), tela embriões uma segunda vez com um microscópio fluorescente utilizando uma ampliação maior. Em seguida, permitir embriões selecionados para desenvolver a 28,5 ° C. <ol><li> Para preparações injectáveis ​​globais MO, assegurar embriões seleccionados têm MO fluorescência distribuída uniformemente no KV e todas as células embrionárias (Figura 1D &#39;; Figura 2E). </li><li> Para DFC-alvo MO injeções, cuidadosamente selecionar embriões que têm MO fluorescência apenas em células KV ea gema (Figura 1E). Embriões transgénicos que expressam GFP em células KV, como Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, pode auxiliar na identificação de embriões em que MO tem sido entregue com sucesso para células KV (Figura 2F). Descartar embriões com MO fluorescência em células embrionárias de outras células que KV. </li><li> Para gema-alvo MO injeções, selecionar embriões que têm fluorescência MO exclusivamente no (gema Figura 1F &#39;: Figura2G). </li></ol></li></ol> 3. Embriões de montagem para analisar o fluxo de fluidos em KV <ol><li> Para analisar o fluxo de fluido assimétrica na KV mundial de MO, DFC-alvo MO ou gema-alvo embriões injetados MO, cuidadosamente dechorionate ~ 20 embriões entre 4-6 estágios somito (~ 11-12 hpf) com pinças afiadas. </li><li> Preparar 50 ml de 1% de baixo ponto de fusão e ponto de agarose aliquota em 5 ml tubos de ser mantidas como um líquido num banho seco a 42 ° C. </li><li> Transferir um embrião de uma lâmina de vidro a depressão (Supplies Unidos Scientific, Inc.) e remover o máximo de água possível. Imobilizar o embrião adicionando bastante morna 1% ponto de fusão baixo ponto de agarose para cobrir apenas o embrião (muito agarose pode interferir com a imagem seguinte). À medida que a agarose solidificar, fórceps para posicionar o embrião de tal modo que esteja voltada para cima KV (vista dorsal) (Figura 1H). Montar 10 embriões com um embrião por slide. Trabalhe rapidamente para garantir a todas as injeções na próxima etapa são completed pela fase somito 10 (14 hpf). </li></ol> 4. A injeção de microesferas fluorescentes em KV <ol><li> Diluir Fluoresbrite Multifuorescent de 0,5 micron de diâmetro Microesferas (Polysciences, Inc.) a 1:50 em água estéril num tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Misture a diluição de 1:50 de micro-esferas cuidadosamente tocando o tubo e colocar em 3 ul de uma agulha capilar. Usando o mesmo utilizado para microinjetor MO injeções (por exemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector), quebrar a ponta da agulha com uma pinça e ajustar as configurações de injeção para gerar a queda de injeção menor possível (&lt;0,5 nl). </li><li> Sob um microscópio de dissecação, o alinhamento da agulha com o lúmen KV do primeiro embrião montado. Inserir a agulha no interior do lúmen e injectar um volume pequeno (&lt;0,5 nl) de pérolas (Figura 1G). A ponta da agulha pequena e volume de injeção de pequeno porte são fundamentais para evitar KV prejudicial. </li><li> Injetar todos os embriões montados. Uma vez que o embrião tem sido injected, uma gota de água estéril pode ser adicionado em cima da agarose para impedir que sequem. Durante o curso das injecções, as pérolas frequentemente obstruir a abertura da agulha. Isto requer re-quebrar a ponta da agulha e ajustando o volume de injecção através da criação de modulação de pressão ou o tempo do aparato de microinjecção. Substituir a agulha se torna-se cega o suficiente para causar danos significativos durante a injeção. </li><li> Tela os embriões injectados para a entrega bem sucedida de grânulos sob um microscópio composto fluorescente na vertical (por exemplo, Zeiss AxioImager M1), utilizando uma objectiva de 20X. Em primeiro lugar, determinar se a estrutura está intacta KV usando iluminação de campo claro (Figura 1J), e, em seguida, usar fluorescência para observar os grânulos. Selecionar embriões cujas contas estão presentes e se movendo dentro do lúmen KV. Descartar embriões com danos KV ou nenhum grânulos flutuantes em KV. É fácil perder KV e entregar contas para tecidos próximos ou a gema subjacente. Se não tiver êxito, montagem AnoTher 10 embriões e repita o procedimento de injeção. </li></ol> 5. Visualização e análise de KV Fluido <ol><li> Para cada embrião seleccionado com os grânulos no interior KV, adicionar uma gota de água estéril para cobrir a agarose e em seguida observar KV sob o microscópio composto fluorescente vertical utilizando uma objectiva 63X de água de imersão (Figura 1I). Alternativamente, uma lamela pode ser aplicado para utilização com objectivos de água não-imersão e / ou de microscópios invertidos. </li><li> Utilizar uma câmara de alta velocidade montado no microscópio (por exemplo Zeiss AxioCamHSm) para gravar um filme 10 seg. Gravar ambos os grânulos através do canal fluorescente (cerca de 70 fotogramas / segundo) e o lúmen KV utilizando um campo claro ou de contraste de interferência diferencial (DIC) do canal. </li><li> Para visualizar todos os movimentos de contas ao longo do tempo, importar o filme de partículas fluorescentes em ImageJ software (download gratuito em <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) umnd criar uma projeção máxima de todos os sinais fluorescentes no filme. Para realizar a projeção máxima em ImageJ, clique em &quot;Imagem → → Pilhas projeto Z&quot;. No projeto &quot;Z&quot; janela, projetar todas as fatias com o tipo de projeção de &quot;intensidade Max&quot;. Esta imagem pode ser sobreposta sobre uma imagem da DIC KV em que as contas foram clonados (Figuras 3A-B). </li><li> Os movimentos de contas individuais podem ser rastreados usando ImageJ. Um plugin (&quot;Tracking Manual&quot;) pode ser baixado em <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Abra o filme pérolas fluorescente no ImageJ e executar a função rastreamento manual. Na janela de rastreamento manual, verifique &quot;parâmetros Show&quot; e os parâmetros de entrada para &quot;intervalos de tempo&quot; e &quot;calibração x / y&quot;. Selecionar manualmente contas que permanecem no plano focal do filme para ≥ 50 quadros e acompanhar ≥ 5 contas por embrião. O caminho e velocidade de cada pérola é gerado por the software (Figuras CD 3). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Usando estágio específicos injeções para atingir MO à linhagem de células DFC / KV é uma abordagem útil para o estudo de células-autonomia da função do gene e evitar fenótipos pleiotrópicos causados ​​por knockdown do gene global. No entanto, essas injeções pode ser tecnicamente desafiadora. Injecção de MO entre os estágios de células 256 e 1000 células pode resultar em três resultados possíveis: 1) o MO permanece agregados no local da injecção, 2) se difunde ao longo do MO gema e entra DFC /...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Norma de controlo oligo-marcado Lissamine </td><td> Gene Ferramentas, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Personalizado Rock2b morfolino oligo </td><td> Gene Ferramentas, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 mícron Microesferas </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analysis of gene function and visualization of cilia-generated fluid flow in kupffer's vesicle

Órgãos internos como o coração, cérebro, intestino e desenvolver esquerda-direita (LR) assimetrias que são críticos para suas funções normais 1. Cílios móveis estão envolvidos no estabelecimento LR assimetria em embriões de vertebrados, incluindo rato, sapo, e zebrafish 2-6. Estes &#39;LR&#39; cílios gerar fluxo de fluido assimétrica que é necessária para desencadear uma conservada assimétrica Nodal (TGF-β superfamília) cascata de sinalização na mesoderme da placa lateral esquerda, que é pensado para proporcionar informação LR padronização para o desenvolvimento de órgãos 7. Assim, para compreender os mecanismos subjacentes à padronização LR, é essencial identificar os genes que regulam a organização das células ciliadas LR, a motilidade e tempo de LR cílios e a sua capacidade de gerar um fluxo assimétrico robusto. No embrião do peixe-zebra, cílios LR estão localizados na vesícula de Kupffer (KV) 2,4,5. KV é composta de uma única camada de células epiteliais monociliatedque encerram um lúmen cheias de líquido. Mapeamento de destino tem mostrado que KV é derivado a partir de um grupo de ~ 20-30 células conhecidas como células de precursor dorsal (DFC) que migram para a margem dorsal blastoderme, durante os estágios epiboly 8,9. Durante as fases iniciais somito, DFC cluster e diferenciam-se em células epiteliais ciliadas, para formar KV no tailbud do embrião 10,11. A capacidade de identificar e rastrear DFC em combinação com transparência óptica e rápido desenvolvimento do peixe-zebra-embrião zebrafish KV fazer um sistema excelente modelo para estudar as células ciliadas LR. Curiosamente, os progenitores da linhagem de células DFC / KV reter pontes citoplasmáticas entre a célula de gema até 4 horas pós-fertilização (hpf), enquanto pontes entre o citoplasma de células de gema e de outras células embrionárias perto após 2 hpf 8. Aproveitando essas pontes citoplasmáticas, desenvolvemos uma estratégia de injeção de estágio específico para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente para SFD e knockdown da função de um gene alvo nestes 12 células. Esta técnica cria embriões quiméricos em que a função do gene é derrubados na linhagem DFC / KV desenvolvimento no contexto de um embrião de tipo selvagem. Para analisar o fluxo de fluido assimétrica na KV, injetamos microesferas fluorescentes para o lúmen KV e movimento recorde talão usando videomicroscopia 2. O fluxo do fluido é facilmente visualizado e pode ser quantificado seguindo o deslocamento do grânulo ao longo do tempo. Aqui, o uso da fase específica DFC segmentada técnica knockdown do gene e a injecção de microesferas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo, apresenta um protocolo que proporciona uma abordagem eficaz para caracterizar o papel de um gene específico durante o desenvolvimento e função KV.

Injecções fase específicos MO proporcionar uma abordagem útil para a análise da função dos genes em compartimentos específicos do embrião. Figura 1 apresenta um diagrama de fluxo das estratégias de injecção utilizados para testar a função de genes em DFC / KV células e como introduzir partículas fluorescentes para visualizar o fluxo do fluido em KV. A distribuição de MO fluorescente em fase de sucesso específicos embriões injectados está representado esquematicamente nas fig...

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Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer&#039;s Vesicle

Cílios gerado o fluxo de fluido na vesícula de Kupffer (KV) controla esquerda-direita padronização do embrião do peixe-zebra. Aqui, nós descrevemos uma técnica para modular a função do gene especificamente em células KV. Além disso, vamos mostrar como entregar partículas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo de fluido.

Análise da função do gene e Visualização de Cilia-Generated fluxo de fluidos em vesículas de Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

14.7K visualizações.  Upstate Medical University. Cílios gerado o fluxo de fluido na vesícula de Kupffer (KV) controla esquerda-direita padronização do embrião do peixe-zebra. Aqui, nós descrevemos uma técnica para modular a função do gene especificamente em células KV. Além disso, vamos mostrar como entregar partículas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo de fluido.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biologia

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as knockout mutants, wild accessions and advanced breeding populations, there is a rising burden for gene functional annotation. In this protocol, annotation of plant gene function using combined co-expression gene analysis, metabolomics and informatics is provided (Figure 1). This approach is based on the theory of using target genes of known function to allow the identification of non-annotated genes likely to be involved in a certain metabolic process, with the identification of target compounds via metabolomics. Strategies are put forward for applying this information on populations generated by both forward and reverse genetics approaches in spite of none of these are effortless. By corollary this approach can also be used as an approach to characterise unknown peaks representing new or specific secondary metabolites in the limited tissues, plant species or stress treatment, which is currently the important trial to understanding plant metabolism.

Combination of genomics, co-expression gene analysis and the identification of target compounds via metabolism give gene functional annotation.

Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

A Assembleia e Aplicação de &#39;tesoura Anéis&#39;: A endotelial novo modelo de Orbital, unidirecional e periódica fluxo de fluido e tensão de cisalhamento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...