Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Nelson Deirdre pelos comentários úteis e para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH DE019244, DE019197, e DE021841 a ML, F32DE02098001 a SJS, e C06 RR015464 para a Universidade de Albany, SUNY.

O protocolo contém quatro etapas principais, conforme representado na Figura 1. Todos os passos são descritos em pormenor. Construção do adenovírus e purificação viral deve ser realizada antes da colheita de órgãos para utilização na transdução genética das dissecados rudimentos epiteliais. Todos os padrões de precauções BSL-2 de segurança devem ser seguidas quando se trabalha com adenovírus. 1. Embrionárias de camundongos glândula submandibular colheita (SMG) e Microdissecção <ol><li> Euthanize timed-fêmeas grávidas de ratinhos (estirpe CD-1 outbred ou ICR) usando CO 2 narcose, seguido por deslocação cervical e cordas de colheita de embriões de ratinho no dia embrionário 13 (E13, 3-5 brotos epiteliais) seguintes procedimentos aprovados pelo IACUC institucional comitê. O dia da descoberta plug vaginal é designado como E0. As glândulas salivares podem também ser colhidas e cultivadas na fase E12, quando existe um único botão primário e do caule com fendas apenas começandopara iniciar. SMGs anteriores a esta fase requer diferentes condições de cultivo que os indicados aqui. </li><li> Transferir cordas de embriões em estéreis 10 centímetros pratos de cultura de tecido cheias com 25 ml de DMEM / Ham &#39;s Medium F12 (F12) sem vermelho de fenol (Life Technologies), suplementado com 100 U / penicilina ml e 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies). </li><li> Usando um bisturi estéril (# 11 lâminas) e fórceps (# 5, Ferramentas Ciência Fine, 11.252-20), remova os embriões dos sacos em um prato separado 10 centímetros contendo 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep. </li><li> Cortar as cabeças de embriões com um corte angular, logo abaixo do maxilar inferior. </li><li> Isolar as mandíbulas inferiores das cabeças sob um microscópio de dissecação estéreo com uma base de luz transmitida (Nikon SMZ645 ou equivalente), utilizando um corte abaixo do maxilar superior. Colocar os tecidos em cima de uma peça extra de vidro, em vez de directamente sobre o elemento de vidro da base do microscópio. </li><li> Recolha as mandíbulas inferiores em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um prato de 35 milímetros estéril de cultura de tecido. </li><li> Coloque uma fatia mandíbula na platina do microscópio de dissecação, de modo que a lingueta está na parte inferior da fatia, mas está a apontar para a posição 0:00 horas. </li><li> Usando um dos lados de duas pinças cruzadas em um movimento de tesoura, remover e descartar o rd 1/3 inferior da fatia de mandíbula. </li><li> Transformar a fatia de 90 ° para a direita (se destro) e, usando um corte de tesoura com o fórceps, cortar a parte superior da fatia da mandíbula (sem corte da língua) na metade da fatia. </li><li> Descascar o tecido em excesso e removê-la para expor as SMGs por baixo. Haverá um de cada lado, perto da base da língua. </li><li> Usando um par de fórceps para segurar o tecido pela língua, usar o fórceps outros para provocar a SMG longe da língua. Repita o processo para a glândula outro. </li><li> Recolher as glândulas salivares microdissecadas em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um tecido estéril 35 milímetros novoplaca de cultura. Nota: as glândulas submandibulares maiores (3-5 brotos epiteliais), juntamente com a mais pequena glândula sublingual conectado (1 bud) podem ser cultivadas intactas saltando a etapa 4 e realizando os passos 4.1, 4.3, e 4.4, como descrito anteriormente 2,8. </li></ol> 2. SMG Separação Rudiment epitelial <ol><li> Colocar 5 (ou mais) das glândulas salivares para um fundo de vidro de 50 mm de diâmetro de micropoços prato (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F), contendo 200 ul de solução salina equilibrada de Hank (HBSS sem Ca + + ou Mg + +, Life Technologies) contendo 0,4% (v / v) de dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, utilizando uma ponta de pipeta estéril de 200 ul, aspirar cuidadosamente a solução de dispase, sem perturbar as glândulas. Imediatamente adiciona-se 200 ul de meio DMEM/F12 contendo 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pré-esterilizado com um filtro de 0,22 ^ M) para neutralizar a dispase. </li> &lt;li&gt; Sob um microscópio de dissecação, usando um par de pinças com pontas finas (# 5 Dumostar, Ferramentas Ciência Fine, 11.295-20), gentilmente separar o mesênquima solto ao redor dos botões SMG epiteliais e dutos, tendo o cuidado de deixar o epitélio intacto . </li><li> Pré-molhada estéril 200 ponteira ul com DMEM/F12-BSA mídia e gentilmente pipetar os rudimentos epiteliais em um 50 milímetros de diâmetro novo prato micropoços contendo 200 ul de DMEM/F12 + caneta strep. Use uma alta qualidade de 200 ul de ponta da pipeta com uma extremidade lisa. </li><li> No prato que contém as peças mesênquima, descartar qualquer tecido não-mesenquimal, incluindo as glândulas sublinguais e quaisquer destacadas botões de glândulas submandibulares. </li></ol> 3. A infecção adenoviral de Rudiments Epiteliais <ol><li> Fazer 200 ul de meios de infecções virais através da diluição do adenovirus de interesse em DMEM/F12 + pen-strep em um tubo de microcentrífuga, de modo que o título da solução resultante é 1x10 8 -10 9 PFU. Otítulo óptimo requerido para diferentes vírus podem variar. É importante a utilização de cloreto de césio (CsCl), preparações purificadas virais para a eficiência de absorção óptima. </li><li> Remova a mídia do prato contendo os cinco rudimentos epiteliais. Rapidamente adicionar 200 ul do meio de infecção, mantendo-se os rudimentos húmida em todos os momentos. Tome precauções necessárias ao manuseio do vírus e eliminação de pontas de pipeta contaminados. Desinfectar as superfícies contaminadas com vírus solução de água sanitária a 10%. </li><li> Mover os rudimentos epiteliais longe um do outro, com uma pinça para evitar que fiquem colados e permitir que elas se depositem no fundo da placa. Incubar rudimentos em meios virais durante 1 hora à temperatura ambiente. Durante a incubação, a separação dos rudimentos, se eles se movem juntos. Balanço excessivo ou movimento vai permitir que as glândulas a se aglutinarem. </li><li> Após a incubação, remova a mídia viral contendo e descartar adequadamente, tendo o cuidado de não perturbar o rudiments. Adicionar 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep. Repita esta lavagem pelo menos mais duas vezes e substituir com 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep mídia. Estas lavagens são críticos para remover qualquer vírus que não está fortemente ligado ao epitélio e para evitar a infecção do mesênquima. </li><li> Incubar rudimentos epiteliais com 200 ml de DMEM/F12 contendo 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356231) durante 20 minutos. Descobrimos que esta incubação curto em Matrigel minimiza a regressão das fissuras existentes, durante o período de cultura inicial, mas este passo pode ser omitido se a exposição a Matrigel não é desejado. </li></ol> 4. Cultura ex vivo de SMGs recombinados <ol><li> Colocar cada rudimento, um de cada vez, usando uma pré-molhado 200 ul ponta de pipeta, em cima de um (pequeno corte) com entalhe 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) que flutuam mais de 200 uL de meio de cultura ( 5 rudimentos / filtro) em uma microplaca com fundo de vidro. Os meios de culturaé: DMEM/F12 + pen-strep contendo 50 ug / ml de transferrina e 150 mg de ácido ascórbico / ml, conforme descrito anteriormente 2,8. Transferrina é conhecido por estimular a sobrevivência e ramificação morfogénese de glândula salivar e de outros órgãos explantes 9. Adição de ácido ascórbico foi mostrado para estimular SMG ramificação. 10 É conhecido por actuar como um cofactor em reacções de hidroxilação de muitos processos metabólicos (tais como a hidroxilação de prolina durante a formação de colagénio fibra 11) e também estimula a produção de fibronectina e laminina em explantes de outros órgãos 12. </li><li> Remover como meios muito em cima do filtro que possível após a adição de cada um rudimento epitelial. Media muito em cima do filtro pode causar o filtro para afundar, enquanto meios menos torna a colocação dos rudimentos mesênquima e muito mais fácil. Mídia em excesso pode ser removido quer com uma ponta de pipeta ou usando uma pinça para agarrar os meios de comunicação entre as pontas. </li><li> Peças mesenquimais derivadas lugar from 3-4 glândulas na parte superior e / ou em torno de cada um rudimento epitelial. Remova qualquer mídia extra que está ao redor das glândulas para evitar o movimento do mesênquima longe dos rudimentos. Mesênquima derivado mais glândulas não é benéfico, mas pode ser menos prejudicial para o crescimento rudimento epitelial. </li><li> Incubar SMGs recombinados num incubador humidificado (95% de ar / 5% CO 2), a 37 ° C durante 48 -72 horas, conforme desejado. </li><li> Adquirir claro e / ou imagens fluorescentes das glândulas ao vivo a 0 h (se desejado), duas horas após a recombinação e cada hora 24, depois disso, um microscópio de luz invertida, na posição vertical, ou estéreo equipado com uma câmara digital, utilizando um objetivo de ampliação 4X ou 5X para capturar toda a glândula recombinada em um único quadro de vista. Imagens da glândula salivar mostrar o melhor contraste usando a configuração de campo claro ou o anel de fase apropriado colocado a meio caminho para o percurso da luz (que não é possível no totalmente automatizados microscópios). Contraste de fase normal hát necessário uma vez que a glândula é grossa e cria contraste. </li><li> Nas desejados pontos de tempo, SMGs recombinados pode ser fixo durante 20 minutos com solução de fixação constituídos por 2% de paraformaldeído (PFA) em 1X PBS contendo 5% (w / v) de sacarose (para melhor preservar a estrutura celular interna, mantendo as células em um estado isosmótica). Ao contrário de PFA a 4%, 2% PFA irá preservar uma quantidade significativa do sinal de GFP, se o fixador estiver completamente removido após a fixação. Glândulas pode ser armazenado durante até 1 semana, em 1X PBS no escuro a 4 ° C até que toda a imunocitoquímica de montagem e de imagem confocal é realizada, como relatado anteriormente 3,6,13-15. Idealmente, imunocitoquímica e imagem deve ser realizada logo após a fixação de obter imagens de melhor qualidade. Glândulas também podem ser lisadas em tampão RIPA para SDS-PAGE seguido por Western blotting. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O ex vivo técnica de recombinação epitelial-mesenquimal foi publicado em glândulas salivares submandibulares em 1981 16. Neste protocolo, expandir-se no método original, utilizando infecção adenoviral para manipular a expressão de genes das células epiteliais, no contexto de uma glândula recombinada. Mostra-se que a percentagem de células epiteliais infectadas com o adenovirus, enquanto que a percentagem de células que estão infectadas depende das propriedades do promotor viral, titulaç...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium sem vermelho de fenol </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina e estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> Estoque 10X </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Congelar em alíquotas de utilização única de 20C- </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> V fração, endotoxina baixo </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Deveria ser título elevado (1x10 10 pfu / ml). Vírus CsCl purificados são mais eficazes do que os vírus purificado coluna neste ensaio. </td></tr><tr><td> Paraformaldeído 16% </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Diluída a 2% em PBS com 5% de sacarose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X tampão de fosfato salino (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Preparado a partir estoque 10X </td></tr><tr><td> Solução Salina Equilibrada de Hank </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> sem cálcio, magnésio não, não Vermelho de Fenol </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media. Congelar de uso único alíquotas a-20C </td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico (Vitamina C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media.Freeze de uso único alíquotas a-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Lista dos reagentes necessários para a SMG protocolo recombinação. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 centímetros pratos de plástico estéreis </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados. </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio estéreo com base de luz transmitida </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Qualquer estéreo microscópio de dissecção podem ser utilizadas, que tem uma base de luz transmitida. </td></tr><tr><td> 35 placas de cultura de tecidos milímetros </td><td> Falcão </td><td> 353001 </td><td> Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados. </td></tr><tr><td> 50 mm de diâmetro pratos micropoços </td><td> MatTek Corporação </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch filtros de membrana </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,1 milímetros </td></tr><tr><td> Widefield microscópio de fluorescência </td><td> Carl Zeiss, EUA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Qualquer microscópio de fluorescência (de pé, inverted ou estéreo microscópio de dissecção) pode ser utilizado para monitorizar a expressão da GFP em baixa ampliação com uma câmara anexa digital. </td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Microscopia confocal é necessário ver estruturas celulares detalhados. Qualquer microscópio confocal pode ser usado. </td></tr><tr><td> Timed-fêmeas grávidas de ratinhos, tensão CD-1 ou ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Os embriões são colhidos no dia 13 (dia da descoberta com tampão designado como dia 0). </td></tr><tr><td> Lâmina de bisturi n º 11 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Cabo de bisturi n º 3 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 5 fórceps liga de inox, 0.05mm X 0,02 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal para a colheita de embriões glândulas </td></tr><tr><td&gt; Dumont n º 5 fórceps liga dumostar, 0.05mm X 0,01 milímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Pontas finas são necessárias para a remoção do epitélio mesênquima. Agulhas de tungsténio também podem ser usados. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento Tabela 2. Usado em SMG protocolo recombinação. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Ramificação morfogénese ocorre durante o desenvolvimento de muitos órgãos, e a glândula submandibular embrionário de rato (GSM) é um modelo clássico para o estudo da ramificação morfogénese. No desenvolvimento de SMG, este processo envolve passos iterativos de broto epitelial e formação de condutas, para finalmente dar origem a uma rede complexa ramificada de ácinos e ductos, que servem para produzir e modificar / transportar a saliva, respectivamente, para dentro da cavidade oral 1 - 3. A membrana basal epitelial associada e aspectos do compartimento mesenquimal, incluindo as células do mesênquima, factores de crescimento e da matriz extracelular, produzida por estas células, são essenciais para o mecanismo de ramificação, embora como os eventos celulares e moleculares são coordenadas permanece pouco compreendido 4 . O estudo dos mecanismos moleculares condução avanços morfogênese epiteliais nossa compreensão de mecanismos de desenvolvimento e fornece insights sobre Regener possívelAtive abordagens da medicina. Estes estudos têm sido dificultados pela falta de métodos eficazes de manipulação genética do epitélio salivar. Atualmente, a transdução adenoviral representa o método mais eficaz para os células epiteliais nas glândulas adultos in vivo 5. No entanto, em explantes de embriões, mesênquima densa e a membrana basal que envolve as células epiteliais viral impede o acesso às células epiteliais. Se o mesênquima é removida, o epitélio pode ser transfectado utilizando adenovírus, e rudimentos epiteliais pode retomar a morfogénese ramificação na presença de Matrigel ou laminina-111 6,7. Mesênquima livre de crescimento epitelial rudimento também requer suplementação adicional com factores de crescimento solúveis e não totalmente recapitular morfogénese de ramificação tal como ocorre nas glândulas intactas 8. Aqui descrevemos uma técnica que facilita a transdução adenoviral de células epiteliais e cultura do e transfectadaspithelium com mesênquima associado. Após microdissecção dos SMGs embrionárias, a remoção do mesênquima e infecção viral do epitélio com um adenovírus contendo GFP, vamos mostrar que o epitélio espontaneamente recombina com mesênquima não infectado, recapitulando estrutura intacta SMG glandular ea ramificação morfogênese. A população de células geneticamente modificadas epitelial pode ser facilmente controlada por meio de métodos padrão de microscopia de fluorescência, se fluorescentemente marcado com construções adenovirais são utilizados. O método de recombinação tecido aqui descrito é actualmente o método mais eficaz e acessível para a transfecção de células epiteliais com um vector do tipo selvagem ou mutante no interior uma estrutura de tecido complexo 3D que não requer a geração de animais transgénicos.

O fluxo dos principais passos experimentais é apresentada na Figura 1. Um exemplo de um SMG intacto, um rudimento isolado epitelial, e sua mesênquima correspondente são mostrados na Figura 2. As imagens de campo claro de SMGs recombinadas, que continuam a sofrer de ramificação morfogénese quando cultivadas ex vivo para os tempos indicados, são mostrados na Figura 3. Glândulas recombinados cultivadas durante 48 horas expressando GFP epitelial são mostra...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivadas glândulas embrionárias de camundongos submandibulares (SMGs) utilizando transferência de gene viral é descrito. Este método tira vantagem da capacidade inata de SMG epitélio e mesênquima para recombinar-se espontaneamente, após a separação e a infecção de rudimentos epiteliais com vectores adenovirais.

Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K visualizações.  University at Albany, SUNY. Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade Ex vivo Cultivadas glândulas embrionárias de camundongos submandibulares (SMGs) utilizando transferência de gene viral é descrito. Este método tira vantagem da capacidade inata de SMG epitélio e mesênquima para recombinar-se espontaneamente, após a separação e a infecção de rudimentos epiteliais com vectores adenovirais.

Vídeo: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissecção das glândulas salivares e intestino médio de Ae. aegypti mosquitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissecção e Imunostaining de Glândulas Salivares Larvais de Anopheles gambiae Mosquitos

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...