Esta pesquisa foi apoiada por fundos do Yale Clima e Instituto de Energia e os EUA National Science Foundation.

1. Grasshoppers de criação sob estresse e de estresse Grátis <ol><li> Utilizar 0,5 m 2 circular, mesocosmos fechados para evitar a emigração ou imigração de espécies animais (Figura 1). Construir mesocosmos usando 2,4 m de comprimento de 1,5 m de altura ¼ &quot;malha cerca de alumínio como um andaime. Cubra a esgrima com 2,5 m de comprimento 1,75 m de altura seleção da janela de alumínio dobrado sobre a parte superior e inferior da cerca e grampeadas ao longo dobra. Junte-se à esgrima acaba de formar um círculo fechado e grampeado a janela de sobreposição triagem em conjunto para criar um selo. Definir os mesocosmos no solo em campo, cavando a 10 cm de profundidade por 4 cm de largura trincheira ao redor da base do mesocosom, afundar o mesocosmos em da vala e, em seguida, apertar o sod da trincheira ao redor da parte submersa do mesocosmo. uma peça do grampo circular de triagem janela para a parte superior do mesocosmo. </li><li> Mesocosmos matriz em uma replicados desig emparelhado experimentalN no campo. Plot locais devem ser selecionados para coincidir com a identidade de espécies de plantas e cobertura relativa planta. Pia gaiolas 10 centímetros no chão no local trama. </li><li> Usando uma rede de varredura, coleta iniciais (2 ª) ninfas de gafanhoto e armazená-las para os mesocosmos em densidades naturais de campo. </li><li> Usando uma rede de varredura, a captura de indivíduos de uma caça sentar-e-espera dominante (não web tecelagem) espécies de aranhas predadoras. Cola fechou a quelíceras aranha (peças bucais utilizados para subjugar presas) com cimento de secagem rápida, para efeitos de risco dissociados da seleção própria sobrevivência favorecendo gafanhotos individuais com melhores habilidades para escapar da predação de aranha. Estocar as aranhas em densidades de campo a um mesocosmos de cada par. Este será o tratamento do stress. Mesocosmos sem aranhas será o tratamento livre de estresse. </li><li> Permitir ninfas gafanhoto para desenvolver a final estágios (4 º e 5 º) estádio. Colete todos os indivíduos das gaiolas e RAndomly atribuir indivíduos de cada gaiola para um dos três grupos de ensaio seguintes: (1) validação do estado de estresse fisiológico, (2) validação da mudança de estequiometria corpo elemental, (3) a decomposição microbiana. </li></ol> 2. Estado de tensão validar Grasshopper <ol><li> Meça gafanhoto taxa metabólica padrão (SMR), como a taxa de emissão de dióxido de carbono ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ) Num fluxo através do sistema incurrent respirometria com uma taxa de fluxo de ar de 200 ml / min. Remover o vapor de água pela passagem do ar que flui através de um agente de secagem. </li><li> Depois da privação de alimentos de 16 horas (a água deve estar disponível), pesar gafanhotos individuais (± 0,1 mg), e colocá-los em 50 ml transparente (9,2 cm L x 2,0 cm D) câmaras respirômetro e permitir-lhes recuperar de manipulação para, pelo menos, 10 min antes do começo das medições. </li><li> Sob constante ambiente média ma<html> tura (temperatura ± 1% variação de erro padrão) no interior da câmara respirômetro, analisar o ar respirado usando uma infra-vermelho analisador de CO 2 (por exemplo, resolução ppm Qubit S151-1). Medir a média mínima no estado estacionário <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> durante 10 min. </li><li> O analisador fornece CO fracionário 2 concentração (partes por milhão), ainda SMR deve ser relatado como uma taxa, por isso deve-se transformado as gravações como <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> FR = i ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ) / {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - (1/RQ)]}, em queiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt; = concentração incurrent fracionário de CO 2; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = Concentração excurrent fracionário de CO 2; FR = taxa de fluxo (ml min -1); RQ = quociente respiratório, assumido igual a 0,85 em animais herbívoros. </li></ol> 3. Mudança em validar Estequiometria Corpo Elemental <ol><li> Avaliar de carbono: azoto (C: N) conteúdo de uma amostra de gafanhotos recolhidos dos mesocosmos campo. </li><li> Reduzir a variação em C: N, devido ao consumo de alimentos, eliminando recente conteúdo intestinal gafanhoto sob um microscópio de dissecação. </li><li> Liofilizar o estômago vazio e do corpo durante 48 horas e, em seguida, triturar a carcaça individual e intestino de um pó homogéneo. </li><li> Medida C: conteúdo de N do pó, utilizando um auto-analisador CNH. </li></ol> 4.A decomposição microbiana <ol><li> Lugar replicado pares de colares de PVC (15,4 cm-diâm., Inserido ~ 4 cm no solo), na localização do campo (Figura 3C). Remova toda a vegetação dentro deles via corte, a superfície do solo. Estes colares são usados ​​para medidas de decomposição. Além disso, estabelecer um conjunto de colares de PVC em todo o local de campo para atuar como 13 C natural abundância controles (ver abaixo), a que nem os gafanhotos nem grama maca-são adicionados. </li><li> Para uma coleira em cada par adicionar duas intactas, liofilizadas carcaças de gafanhotos (gravar a biomassa adicionado) criados com o risco de predadores, como descrito acima, usando-campo gaiolas. Para o colar outro em cada par adicionar 2 intactas liofilizadas carcaças criados sem risco predador. </li><li> Cubra os colares de PVC com uma tela para impedir a remoção gafanhoto por catadores de parcelas e deixe as carcaças gafanhoto decompor por 40 dias. </li><li> Enquanto carcaças estão se decompondo rótulo, grama-litter com 13 C. <ol><li> Construir uma câmara de plexiglass claros (60 cm x 60 cm x 1,5 m), com uma entrada e uma válvula de saída (Figura 3B). </li><li> Afundar uma quadrícula com 60 cm x 60 centímetros moldura de madeira com um selo de borracha revestida com silício graxa 5 cm no solo (Figura 3B). </li><li> Deslizar a câmara na parte superior do caixilho de madeira, de modo que a câmara fica vedado pela borracha (Figura 3B). </li><li> Ligam as entradas de câmara de cilindros de gás comprimido que contenha 99% 13 átomo de CO 2. Plantas no interior da câmara vai ser marcado com 13 C, em que as concentrações de CO 2 são mantidos a níveis ambientais (porque as concentrações de elevação altera particionamento de carbono da planta). Níveis de ambiente são mantidos por apenas pulsando CO 2 marcado por curtos períodos de tempo. Além disso, as temperaturas na câmara são controladas e as câmaras são removidas se atingir temperaturas de 5 ° C umabove ambiente. </li><li> Uma semana depois de rotulagem, compare C 13 δ da erva-lixo com valores de abundância naturais coletados de uma amostra aleatória de espécies de gramíneas idênticos usando um Thermo DeltaPlus razão isotópica espectrômetro de massa (Thermo, San Jose, CA, EUA). </li></ol></li><li> Depois de 40 dias, adicione 10 g de ar seco marcada com 13 C grama-lixo para cada colar que haviam sido alterado com carcaças de gafanhoto. </li><li> Monitorar a taxa de mineralização da erva-lixo in situ através de 75 dias por cada colar nivelamento e acompanhamento, tanto a respiração do solo e da respiração de 13 de CO 2. Isto é realizado utilizando um fluxo através de técnica de câmara onde amostras de gás a partir de cada anel são monitorizados em tempo real, durante 8 minutos de cada cavidade utilizando espectroscopia de anel-down (CRDS; Picarro Inc., Santa Clara, CA, EUA; Modelo: G1101 -i). CRDS permite que se rastrear simultaneamente tanto total como δ 13 Cde respiração do solo. </li><li> Estimar a contribuição de 13 C-rotulado grama-lixo para a respiração total do solo por meio de equações de isótopos de mistura. A quantidade de erva-lixo derivado de CO 2 é calculado da seguinte forma: (. Δ 13 C respiração - δ 13 C nat.abn) C grama-lixo derivado = C total × / (δ 13 C grama-lixo - δ 13 C nat . abn), onde C total é a quantidade total de C respirado durante uma dada medição, δ 13 C respiração é a C 13 de δ respirados-C para os colares alteradas com ninhada grama rotulados, δ 13 C nat.abn. é a média δ 13 C de C respiratórios em três colares de abundância natural (ou seja, aqueles que não foram alterados com a maca), e δ 13 C grama-lixo é o C 13 δ da ninhada grama adicionado ao collars. </li><li> Monitorar a temperatura ea umidade do solo em todo o experimento utilizando de mão sondas para corrigir diferenças de respiração do solo, devido a diferenças de temperatura e umidade. </li><li> Embora destinado a utilização no campo, a cavidade do instrumento de espectroscopia de anel para baixo (Picarro Inc., Santa Clara, CA, EUA; Modelo: G1101-i) As leituras são sensíveis ao movimento. Portanto, deve-se construir uma estação de medição de base central para todos os lotes contendo colares de PVC, e conectar o instrumento para os colares com comprimentos de tubos de PVC. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodical+cicadas+and+resource+pulses+in+North+American+forests.">Periodical cicadas and resource pulses in North American forests.</a> Science. 306, 1565 (2004).</li><li>Belovsky, G. E., Slade, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+herbivory+accelerates+nutrient+cycling+and+increases+plant+production.">Insect herbivory accelerates nutrient cycling and increases plant production.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14412 (2000).</li><li>Frost, C. J., Hunter, M. 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Não temos nada a revelar.

A seqüência de métodos apresentados aqui devem permitir a medição sistemática do estresse maneira de espécies que compõem teias acima do solo de alimentos podem comunidades microbianas em solos principais caminhos que levam à alteração da subsequente decomposição do lixo planta. Os métodos são ideais para estudar os ecossistemas compostas por consumidores de artrópodes e plantas herbáceas porque teias alimentares inteiros pode ser espacialmente circunscrito e contido dentro mesocosmos. Variabilidade espacial podem existir devido a gradientes de umidade do solo residual, a temperatura do solo, teor de nutrientes de plantas, etc O desenho do estudo permite mescosms matriz e colares de PVC para bloquear espaciais ao longo de gradientes ambientais e, assim, conta a variação ambiental, ao analisar os efeitos. Embora destinado a utilização no campo, a cavidade do instrumento de espectroscopia de anel para baixo (Picarro Inc., Santa Clara, CA, EUA; Modelo: G1101-i) se as leituras sãonsitive ao movimento. Portanto, deve-se construir uma estação de medição de base central para todos os lotes contendo colares de PVC, e conectar o instrumento para os colares com comprimentos de tubos de PVC. Decomposição do solo tem sido tradicionalmente medido colocando quantidades conhecidas de ninhada em sacos de malha de fibra de vidro, depositando os sacos para a superfície do solo no campo e, periodicamente, re-medir os sacos de areia para quantificar taxa desaparecimento (decomposição). A limitação deste método é que a pessoa é capaz de rastrear o destino da matéria em decomposição, ou para determinar a contribuição de CO 2 a mineralização da alteração do solo (areia adicionado) de fundo mineralização CO 2. O método de rastreamento usando rotulado CO 2 apresentou aqui ajuda a aliviar esta restrição logístico. Ecologia ecossistema e biogeoquímica têm operado sob o paradigma de trabalho que por causa planta uneaten-Maca compreende a maioria dos detritos, processos ecossistêmicos subterrâneos são apenas marginalmente influenciado por entradas de biomassa de níveis tróficos superiores na cadeia alimentar acima do solo, tais como herbívoros próprios 6. No entanto, há evidências crescentes de que espécies de níveis tróficos superiores dos ecossistemas pode ter uma profunda influência sobre processos subterrâneos 1,4,5. O método aqui apresentado representa para melhorar a quantificação da contribuição de níveis tróficos superiores, quer directamente através da biomassa da deposição de carcaça (por exemplo, 12, 13) ou excreção e egestion (por exemplo 14, 15) ou indiretamente através da alteração da composição da comunidade vegetal (por exemplo, 9 ) no ciclismo ecossistema de nutrientes. Essa quantificação pode ajudar a revelar os mecanismos pelos quais os animais controlam dinâmica do ecossistema, como parte de um esforço concertado para melhorar e rever o paradigma atual de trabalho de controle biótico sobre o funcionamento do ecossistema.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Anel cavidade para baixo espectroscópio </td><td> Picarro Inc., Santa Clara, CA, EUA </td><td> # Modelo G1101-i </td><td></td></tr><tr><td> CO2 respirômetro </td><td> Qubit Systems, Kingston, Ontário, Canadá </td><td> Modelo S151 # </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Thermo, San Jose CA, EUA </td><td> Modelo: Delta V Plus Spectrophotometer de massa de razão isotópica </td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

A quantidade e qualidade dos detritos entrem no solo determina a taxa de decomposição por comunidades microbianas, assim como as taxas de reciclagem de azoto (N) e 1,2 a fixação do carbono (C). Ninhada planta compreende a maioria dos detritos 3, e assim presume-se que a decomposição é apenas marginalmente influenciado por entradas de biomassa a partir de animais tais como os herbívoros e carnívoros 4,5. No entanto, os carnívoros podem influenciar decomposição microbiana de lixo planta através de uma cadeia de interações em que o risco de predação altera a fisiologia da sua presa herbívoro que, por sua vez funcionamento microbiana do solo altera quando as carcaças de herbívoros são decompostos 6. A resposta ao estresse fisiológico por herbívoros ao risco de predação pode alterar o C: N composição elementar da biomassa herbívoro 7,8,9 porque o estresse de risco de predação aumenta exigências herbívoros basais de energia que em nutrientes limitada herbívoro forças sistemass para mudar o seu consumo de N-ricos recursos para apoiar o crescimento e reprodução de recursos C-ricos em carboidratos para apoiar o metabolismo aumentado seis. Herbívoros têm capacidade limitada para armazenar o excesso de nutrientes, tão estressado herbívoros excretam N, pois aumentam o consumo de carboidratos-C 7. Em última análise, presa salientada por risco de predação aumentar o seu corpo razão C: N 7,10, tornando-os recursos de qualidade inferior para o compartimento microbiano provavelmente devido à baixa disponibilidade de N lábil para a produção de enzima microbiana 6. Assim, a decomposição de carcaças de herbívoros estressados ​​tem um efeito primário sobre o funcionamento de comunidades microbianas que diminui a capacidade subseqüente ao de micróbios para se decompor lixo planta 6,10,11. Nós apresentamos a metodologia para avaliar as ligações entre o risco de predação e decomposição por microrganismos do solo. Nós descrevem como: induzir estresse em herbívoros de risco de predação; meacerteza que essas respostas ao estresse, e medir as conseqüências sobre a decomposição microbiana. Usamos idéias a partir de um modelo de ecossistema pastagem compreendendo a caça aranha predador (Pisuarina mira), um herbívoro dominante gafanhoto (Melanoplus femurrubrum), e uma variedade de grama e plantas forb 9.

Uma parcela exemplo de gafanhoto padrão taxas metabólicas em condições de estresse e estresse livres são apresentados na Figura 2. Devido às diferenças de massa corporal entre gafanhotos individuais, eo fato de que a taxa metabólica varia de acordo com a massa corporal, as parcelas devem apresentar taxas metabólicas em relação ao gafanhoto de massa corporal. Tendências paralelas para os diferentes tratamentos indicam que a taxa metabólica aumenta como um múltiplo constante da taxa metabólica padrão (ou seja, não há um corpo de massa x interação taxa metabólica) para todos os indivíduos estressados. Gafanhoto corpo C eo N elementares em risco e condições livres são apresentadas na Tabela 1. É de notar que existe uma diferença muito pequena (4%) no corpo de C: N rácios entre os tratamentos. No entanto, essas pequenas diferenças podem se traduzir em grandes diferenças na decomposição grama à beira da piscina microbiana do solo (Figura 3). </p&gt; Adicionando ninhada grama para colares de PVC previamente alterada com gafanhotos estressados ​​ou livre de estresse leva a diferentes graus de decomposição, como refletido nas curvas cumular descrevendo liberação de CO 2 do solo devido à respiração microbiana (Figura 3). Experimentos devem ser monitorizados até acumular curvas começam a saturar. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Estresse </td><td> Stress Free </td></tr><tr><td> De carbono (%) </td><td> 48,44 ± 0,32 </td><td> 44,73 ± 0,46 </td></tr><tr><td> Nitrogênio (%) </td><td> 12,11 ± 0,08 </td><td> 11,62 ± 0,12 </td></tr><tr><td> Carbono: Nitrogênio </td><td> 4,00 ± 0,03 </td><td> 3,85 ± 0,04 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparação da composição química das gafanhoto carro herbivorecasses de condições em que eles enfrentam o risco de predação (stress) e em que o risco de predação estava ausente (sem stress). Os valores são média ± 1 erro padrão. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Ilustração do desenho do campo mesocosmos usado na experiência e o esquema geral de avaliação experimental do efeito de risco em decomposição. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Uma parcela de herbívoro taxa metabólica padrão em relação à massa corporal herbívoro. Os dados são divididos em duas classes de acordo com o tratamento experimental: gafanhotos de mesocosmos contendo predadores (predação) para induzir estresse e mesocosmos sem predadores (controle) e, portanto, sem estresse induzido. Os dados são do D. HalwenaSchmitz e JO 2010, não publicado. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> Figura 3. Curvas descrevendo cumulativo CO 2 release à beira da piscina enquanto decomposição microbiana entradas grama experimentais de decomposição em colares de PVC. Valores representados são a média ± um erro padrão. O gráfico demonstra que os solos preparados com carcaças estressados ​​gafanhoto (predador) resultam em 19% menor (ANOVA F 1,6 = 9,06, P &lt;0,05) as taxas de decomposição de plantas de solos imunizadas com carcaças sem stress gafanhoto (controle). A inserção mostra o aparelho de colarinho PVC no campo. Figura reproduzida de Hawlena et al. 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">Cick aqui para ver figura maior</a> .

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Nós apresentamos métodos para avaliar como o risco de predação podem alterar a qualidade química da presa herbívoro induzindo mudanças na dieta para atender às demandas de estresse elevado, e como a decomposição de carcaças desses herbívoros estressados ​​retarda a decomposição da leitegada subsequente planta por micróbios do solo.

Ligando o risco de predação, Stress herbívoro fisiológica e decomposição da maca Usina

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

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12.9K visualizações.  Yale University. Nós apresentamos métodos para avaliar como o risco de predação podem alterar a qualidade química da presa herbívoro induzindo mudanças na dieta para atender às demandas de estresse elevado, e como a decomposição de carcaças desses herbívoros estressados ​​retarda a decomposição da leitegada subsequente planta por micróbios do solo.

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Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Biologia

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Monitoramento hormônios vegetais Durante Respostas ao Estresse

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Microcosmos Bloco de decomposição controlada de Tecidos Vegetais por fungos aeróbicos

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbívoro induzida Voláteis Blueberry e planta-Intra Sinalização

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizando Frequency Stromule com microscopia de fluorescência

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Combinando Microscopia de Limpeza e Fluorescência para Visualização de Mudanças na Expressão Gênica e Respostas Fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...