A enxertia de semeadura em estágio inicial é uma ferramenta poderosa para definir a sinalização de longa distância em plantas. Esperamos que este método auxilie na adoção bem-sucedida da enxertia semeadeira sem treinamento prático. Comece preparando a placa de Petri quadrada, medindo 100x100 milímetros para fundição do elastômero de silicone.
Pegue o fio de calibre 29 em laços de torção depois de remover o revestimento de papel externo no fio com acetona. E endireitar totalmente o fio, enrolando-o em uma superfície dura e uniforme com um objeto plano pesado, como um rack de tubo de metal. Em seguida, coloque quatro pedaços de fios endireitados equidistantes um do outro na placa de Petri quadrada, garantindo que os fios fiquem achatados no fundo do prato.
Despeje a solução mista de elastômero de silicone sobre os fios na placa de Petri e coloque a tampa sobre a placa. Depois de deixar o silicone curar por 24 a 48 horas à temperatura ambiente, remova a folha de silicone da placa de Petri usando pinças limpas e mova-a para uma superfície limpa e plana. Retire os fios da folha de silicone.
Para garantir que os canais estejam abertos de um lado, use pinças de ponto fino para limpar a fina camada de silicone que bloqueia o lado aberto dos canais. Corte a folha de silicone perpendicularmente aos canais em tiras de três milímetros usando uma tesoura limpa. Coloque cada tira em um envelope de papel alumínio e lacre com fita autoclave.
Autoclave as tiras a 121 graus Celsius por pelo menos 30 minutos antes de armazená-las até que seja necessário. Para esterilizar e vernalizar as sementes, tomar um mililitro de solução de água sanitária a 50% contendo 0,1% de Tween 20 em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e suspender até 100 sementes de arabidopsis. Incubar a suspensão das sementes à temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos.
Após a incubação, aspirar ou pipetar a solução de água sanitária em condições estéreis. Enxágue as sementes com um mililitro de água destilada esterilizada. Certifique-se de inverter os tubos adequadamente enquanto enxagua as sementes.
Para remover qualquer solução de água sanitária deixada na parte superior do tubo, repita o enxágue quatro vezes. Deixe aproximadamente 250 microlitros de água com as sementes no tubo e guarde as sementes no escuro a quatro graus Celsius por três dias. Em seguida, antes de plaquear as sementes, coloque as tiras estéreis na superfície da placa MS preparada para orientar o alinhamento das sementes com os canais das tiras.
Em seguida, trabalhando em condições estéreis, use uma ponteira de pipeta de 20 microlitros para aspirar e transferir o número adequado de sementes preparadas para a placa. Uma vez que as sementes estão chapeadas, remova as tiras estéreis. Tampe o prato.
E sele um dos lados da placa paralelo às fileiras de sementes com parafilme. Enrole a fita respirável em cima do parafilme e ao redor de todas as outras bordas da placa para permitir a troca de ar durante a incubação. Oriente cuidadosamente duas placas verticalmente com seus lados selados com parafilme voltados para baixo.
Separe-os na parte inferior, colocando horizontalmente um tubo centrífugo de 15 mililitros no meio, enquanto os prende juntos por cima com um elástico. Certifique-se de que as superfícies da placa formem um ângulo de 100 a 110 com a superfície da bancada. Guarde as placas nessa orientação por 72 horas na escuridão total a 21 graus Celsius para permitir que os hipocótilos das mudas cresçam cerca de cinco milímetros de comprimento.
Depois disso, remova o setup do escuro e mantenha-o sob um ciclo claro de 16 horas e escuro de oito horas por dois a quatro dias na mesma temperatura antes da enxertia. Enxertar as mudas entre cinco e sete dias após o plaqueamento. Coloque uma faixa de enxertia sobre as mudas, encaixando seus hipocótilos nos canais.
Posicione suavemente a muda, de modo que a junção raiz-hipocótilo permaneça no fundo da tira de silicone para preparar a muda para o corte. Trabalhando em uma capa estéril com o auxílio de um escopo de dissecção, prepare as mudas para enxerto. Usando uma lâmina de bisturi fresca, faça um corte reto, limpo e perpendicular através do hipocótilo.
Evite pressionar e empurrar a muda para dentro do ágar. Em seguida, remova a calha e mantenha a parte cortada da calha hidratada, garantindo o contato com a superfície do meio. Alternativamente, a calha pode ser movida para uma placa de Petri cheia de água destilada estéril.
Para preparar os porta-enxertos, segure cuidadosamente a raiz dentro do espaço entre as pinças fechadas e gire suavemente para puxá-la, deixando a seção de corte dos porta-enxertos no meio da tira. Em seguida, pegue suavemente a calha desejada usando a pinça de ponta fina e insira-a na parte superior do canal. Visualmente, confirme o contato entre a copa e o porta-enxerto para obter um enxerto bem sucedido.
Após a confecção de todos os enxertos, envolver as placas com parafilme e fita adesiva respirável e montá-las da mesma forma demonstrada anteriormente, sem atrapalhar as mudas ou tiras de silicone. Mova cuidadosamente as placas para uma câmara de crescimento ajustada a 26 graus Celsius com um ciclo claro de 16 horas e escuro de oito horas. Após sete a 10 dias, avaliar as mudas enxertadas em condições estéreis utilizando pinças para descascar cuidadosamente a tira de silicone de um lado e liberar as mudas dos canais.
Remova quaisquer raízes adventícias que cresçam da copa, cortando-as com uma lâmina de bisturi fresca ou esmagando-as com pinças de ponta fina. Mais uma vez, avaliar visualmente se o porta-enxerto ficou firmemente aderido à copa, formando um enxerto bem-sucedido. Mover os enxertos bem-sucedidos para o solo de propagação de mudas e cobrir o solo com plástico transparente por alguns dias enquanto as mudas se estabelecem.
Permita que as plantas cresçam sob os ciclos claro e escuro mencionados anteriormente a 21 graus Celsius. Ensaios de enxertia para determinar o protocolo ótimo de enxertia revelaram uma taxa global de sucesso de enxertia de 25% quando as sementes germinaram diretamente sobre as tiras de silicone com canais fechados. A reorientação das sementes para manter os embriões cotilédones e o radical apontando para baixo durante a germinação aumentou ligeiramente a eficiência de enxertia para 33%Ao retirar o silicone que fecha os canais para permitir o contato entre a semente e o meio de crescimento, 85% das plântulas germinaram com sucesso.
No entanto, a taxa de sucesso de enxertia manteve-se em 31%, indicando que o crescimento ótimo das plântulas não pôde ser alcançado com a germinação em faixa. Curiosamente, o protocolo demonstrado, no qual as plântulas foram cultivadas verticalmente na placa de enxertia antes de serem inseridas nos canais abertos das tiras, produziu uma taxa geral de sucesso de enxertia de 48% durante os dois primeiros ensaios. Considerando a menor taxa de sucesso do terceiro e do ensaio relativamente pequeno, que pode ser atribuído a pequenas variações nos locais de enxertia, o sucesso geral da enxertia foi de 45%, comparável ao método em que as mudas foram cultivadas em placas horizontais, cortadas em superfície sólida e inseridas em tiras de enxertia.
No entanto, o protocolo demonstrado é comparativamente menos demorado. Usando este protocolo, os laboratórios novos na enxertia de mudas podem criar rapidamente um grande número de dispositivos de suporte de enxertia, ao mesmo tempo em que podem personalizar o dispositivo para atender às suas necessidades específicas facilmente.
