Este trabalho foi financiado por doações do Nacional de Ciência e Pesquisa de Engenharia Council of Canada para XAC e AFP

1. Preparação de Materiais para extracção <ol><li> Preparação de Células <ol><li> Semente células de cultura de tecidos tratados com ácido sobre lamelas durante pelo menos um dia antes da experiência. Usamos COS-7 ou U2OS, como estas duas linhas de células exibem robusta de produção de proteína segregada e tem um ER bem definida. Note-se que para obter a eficiência de extracção elevado, as células não deve exceder 80% de confluência no lamela no dia da experiência. </li><li> Se um mRNA específico exógeno está a ser investigada, as células são transfectadas um dia após a sementeira com plasmídeos contendo o gene de interesse, utilizando protocolos de transfecção convencionais. As células são então deixadas a expressar o mRNA durante pelo menos 18 horas antes da extracção. </li></ol></li><li> Tratamento das células com inibidores de tradução <ol><li> Para testar o efeito de ribossomas intactas na manutenção de mRNAs associação com o ER, as células podem ser tratadas com inibidores de tradução que perturbam a associaçãode ribossomas com o ARNm 11. </li><li> Inibidores de iniciação da tradução, tais como homoharringtonin (HHT), pactamycin, ou 2 - (4-metil-2 ,6-dinitroanilino) - N-metilpropionamida (MDMP), evitar novas ribossomas de se associar com a transcrição enquanto simultaneamente permite a ribossomas envolvidos completar tradução 12-14. Uma vez que a taxa de conversão para a maioria das proteínas em células de mamífero é de 5 aminoácidos por segundo, independentemente do comprimento ou da utilização de codões de RNAm 15, um tratamento de 30 min deve limpar ribossomas fora de mensagens com grelhas de leitura abertas, enquanto 27.000 nucleótidos (que codifica para as proteínas contanto que 9000 aminoácidos). </li><li> Inibidores tais como a puromicina promover a expulsão prematura da cadeia nascente e, portanto, perturbar polissomas 12. No entanto, para interromper completamente a associação dos ribossomas puromicina-tratados com o mRNA, agentes quelantes tais como EDTA de magnésio tem de ser adicionada à extracção digitonina 11 buffer. </li> &lt;li&gt; Neste ensaio, as células são tratadas com 200 uM de puromicina, 5 HHT uM, ou meio de controlo, durante 30 minutos antes da extracção. </li></ol></li><li> Preparação de digitonina tampão de extração. Para visualizar ER-localizadas mRNAs sem obstrução da livre (isto é, não-citoplasmáticos ER-associados) transcritos, que selectivamente permeabilizar as células com digitonina, um glicósido esteróide que interage preferencialmente com 3β-hydroxysterols. Em baixas concentrações, digitonina permeabilizes selectivamente porções da membrana de plasma, fazendo com que &#39;leakiness&#39; 16. Em contraste, a membrana do RE e do envelope nuclear, que é pobre em colesterol, são deixadas intactas 16,17. <ol><li> Digitonina pó (Sigma Aldrich) é dissolvido em água destilada a 5% peso / volume, e esta solução estoque é separado em alíquotas para pequenos volumes e armazenado a -20 ° C. Na nossa experiência, múltiplos ciclos de congelação-descongelação diminui a eficiência da digitonina dissolvido. </li><li> Uma solução de estoque deCHO tampão 10x (1x concentração da solução de trabalho: 115 mM de KAc, HEPES 25 mM pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2, 2 mM EGTA e 150 mM de sacarose) é preparado com RNase-free reagentes e armazenado a -20 ° C. A solução de trabalho (1x tampão CHO) é preparada por diluição da solução de reserva com RNase isento de água e pode ser armazenado a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Extração digitonina <ol><li> Preparar soluções de extracção <ol><li> Um bloco de aquecimento com uma superfície plana, é pré-aquecida a 40 ° C e mantida a esta temperatura durante a extracção. </li><li> Para formar uma superfície de trabalho plana, que é livre de RNase, o bloco de aquecimento é humedecido com um pouco de água e revestida com um novo pedaço de Parafilm M (Bemis Company, Inc). As bolhas de ar entre a folha de parafilme e do bloco de aquecimento estão suavizados utilizando RNase livre de luvas e kimwipes (VWR). </li><li> 1x CHO tampão é aquecido a 37 ° C por incubação num banho de água. </li><li> Placas de 6 poços são usadas para lavare corrigir as células. Cada linha de 3 poços é usado para uma tampa deslizante. Para os dois primeiros poços na fila, 2 ml de tampão de CHO aquecido é adicionado. Para o bem último, 2 ml de solução de fixação (PBS paraformaldeído a 4%, + (microscópio electrónico Sciences)) é adicionado. Este tabuleiro pode ser armazenado na incubadora a 37 ° C até que as células estão prontas para a extracção. </li><li> Digitonina solução de extracção é preparada por diluição da solução estoque digitonina a 0,025% com tampão de CHO quente, imediatamente antes de usar. Novamente, note que para células tratadas com puromicina, o tampão de extracção deve conter, adicionalmente, 20 mM de EDTA a perturbar eficientemente ribossomas 11. Gotas de 100 ul da solução de extracção, são colocados no bloco de aquecimento parafilme coberta imediatamente antes da extracção. </li></ol></li><li> Extracção digitonina e fixação das células <ol><li> Remover as células da incubadora a 37 ° C. </li><li> Durante o processo de extracção, lamelas são manipulados com a ajuda de uma pinça de joalheiro. Coma pinça pegar a lamela e mergulhá-lo no buffer primeiro e depois o segundo poço contendo CHO para lavar do meio de crescimento. </li><li> Rapidamente blot o tampão em excesso para fora do lado de trás da lamela com um Kimwipe e colocar imediatamente a lamela lateral da célula, virado para baixo, sobre a solução de extracção. </li><li> Depois de 10 segundos, pegar a lamela com a pinça e imediatamente transferi-lo, lado da célula para cima, para o bem contendo tampão de fixação de 4% paraformaldeído. </li><li> Deixe que a amostra incubar em fixador durante pelo menos 15 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparação de células de controlo não extraído. Para determinar a quantidade total de mRNA no citoplasma é uma boa ideia para preparar uma amostra de controlo não extraído. <ol><li> As células cultivadas sobre lamínulas são preparadas como acima (ver seção 2.2), exceto que a etapa de extração digitonina (2.2.3) é ignorado. </li><li> Após a fixação, as células não-extraídos devem ser permeabilizadas em PBS + 0,1% de TritonX-100 durante 15 min à temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 3. Coloração FISH <ol><li> Concepção de sondas para hibridação in situ fluorescente <ol><li> A sequência primária do mRNA de interesse é dobrada utilizando RNA software predição estrutura secundária, tais como RNAstructure 5,0 18. As dobras de mRNA são avaliadas visualmente para identificar uma região de cerca de 50 nucleótidos, que é livre de grandes estruturas secundárias. </li><li> O complemento reverso desta região é sintetizado com um fluoróforo ligado Alexa546 para a extremidade 5 &#39;da sonda (adquirido a partir de Integrated DNA Technologies). </li><li> A sonda é diluída com RNase isento de água a uma concentração de caldo de 100 | iM, que pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol></li><li> A coloração com sondas FISH <ol><li> Note-se que embora as células digitonina extraídos não requerem a permeabilização adicional, o tratamento destas amostras fixadas com 2 ml de 0,1% de Triton X-100 diluído emPBS durante 15 min à temperatura ambiente antes da coloração FISH, ajuda a reduzir o sinal de fundo. </li><li> Os slides são depois lavadas duas vezes com PBS para remover qualquer resíduo de paraformaldeído ou Triton X-100. </li><li> As células são então lavadas duas vezes com 25% a 60% de formamida em 1X tampão de citrato de sódio (150 mM de NaCl e 15 mM de citrato de sódio). Geralmente, para sondas FISH específicos que são 50-60 nucleótidos de comprimento, de formamida a 60% é utilizada, mas para a coloração de ARNm de poli (A) com a sonda oligo FISH (dT), o nível de formamida é reduzida para 25%. </li><li> Para preparar a câmara de coloração, o fundo de um prato de 150 milímetros de Petri é coberta com água e um pedaço de Parafilm é flutuou na água. A água é removido girando o prato por cima, permitindo assim que o parafilme a aderir ao fundo do prato. As bolhas de ar são removidos manualmente com kimwipes. </li><li> Para cada lamela de serem coradas, pipetar uma gota 100 ul de solução de hibridação contendo a sonda de FISH de interesse para o parafilm na câmara de coloração. A sonda de FISH estoque é diluída com 25% de formamida a 60% em tampão de hibridação (1 x SSC, 100 mg / ml de sulfato de dextrano, 1 mg / ml de ARNt de levedura, complexo vanadil riboside 5mM, 25-60% de formamida) a uma concentração de trabalho de 0,2 uM. Note-se que a quantidade de formamida deve ser optimizada para a sonda em particular a ser utilizada, e está presente na mesma concentração que no tampão de lavagem SSC (ver o passo 3.3.3). </li><li> A lamela é colocada com a face para baixo no lado da célula a solução FISH na câmara de coloração e foram incubadas durante 5-24 horas a 37 ° C numa câmara húmida, tais como a cultura de tecidos incubadora. </li></ol></li><li> Lavagem e montagem das amostras coradas <ol><li> Para preparar uma RNase área de lavagem livre, fixar uma tira de parafilme em uma superfície plana, como uma mesa de laboratório. Para garantir que o parafilm é plana, a superfície molhada nível, coloque o parafilme em cima e remover manualmente as bolhas de ar com kimwipes. </li><li> A câmara de coloração éremovida da incubadora e colocado sobre uma superfície plana. As lamelas são depois flutuou por pipetagem cerca de 500 ul de tampão de lavagem FISH perto da borda de cada lamela. A solução vai ser desenhado em entre as lamelas eo parafilme por ação capilar. </li><li> Para cada lamela, 1 ml de tampão de lavagem (1x SCC com 25-60% de formamida, ver o passo 3.3.3) são pipetados para a zona de lavagem parafilme (ver o passo 3.4.1). </li><li> Usando fórceps, as lamelas de cobertura são removidas da câmara de coloração e cada uma é colocada sobre a gota de tampão de lavagem e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. O processo de lavagem é repetido três vezes. </li><li> Lâminas de vidro são lavadas com etanol a 70% e secou-se com kimwipes. </li><li> Para cada lamela, 25 ul de solução de montagem (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) é pipetado para o slide. Note-se que esta solução contém 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), o qual DNA manchas e permite a visualização dos núcleos. </li><li> Usifórceps ng e kimwipes, a parte de trás da lamela é seco e de tampão de lavagem em excesso FISH é blotted fora sem secar a amostra. Cada lamela é então colocado com o lado das células para baixo, para a gota de solução de fixação. </li><li> As amostras montadas são então marcados e pode ser armazenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Imagem e Quantificação <ol><li> Imagem <ol><li> Um microscópio de epifluorescência, é utilizada para a imagem das células após coloração de FISH. A célula transfectada podem ser diferenciados a partir das células não transfectadas pelo sinal de fluorescência brilhante no canal apropriado. Idealmente, cada campo adquirido também conterá uma célula não transfectada para ser utilizado para determinar a fluorescência de fundo para a quantificação. </li><li> Para cada imagens de campo do Peixe e do canal DAPI são adquiridos. Além disso, se as células forem co-coradas com marcadores de proteína, uma imagem do canal de imunofluorescência é também adquirido. Note-se que a extracção digitonina também pode ser usadopara visualizar ER-bound ribossomas e proteínas 11. </li><li> Para assegurar que as intensidades de fluorescência entre os campos podem ser comparados entre si, o tempo de exposição para cada canal devem permanecer constantes para cada conjunto de experiências. </li><li> Mais uma vez para assegurar que as intensidades de fluorescência entre as células em lamelas de diferentes podem ser comparados entre si, as mudanças do dia-a-dia de intensidade epiluminescence ou decaimento do sinal de FISH deve ser minimizada por imagem de todas as lamelas de cobertura em uma única sessão. </li></ol></li><li> Quantificação. Para quantificar a quantidade de mRNA que é localizada no RE, que usa o software Nikon Elemento NIS. Contudo software de análise de imagem, tal como outros ImageJ pode ser usado. <ol><li> Usando o elemento NIS Nikon ferramenta de análise de imagem, a periferia da célula e do núcleo são descritos como região separada de Interesses (ROI). </li><li> Para cada ROI, a intensidade de fluorescência (I T para a intensidade total de células e para o i nintensidade nuclear) ea área (A e T A N) são gravados e exportados para uma planilha Excel. </li><li> Para cada imagem, a intensidade de fluorescência de fundo (I B) é determinado com base na intensidade de uma célula não-transf ectada. Se os níveis de poli (A) do mRNA estão a ser analisados, uma área livre de células é seleccionado. </li><li> A quantidade total de ER (em células extraídas) ou citoplasmático (em células não extraído) da fluorescência é calculada pela seguinte fórmula: [A T] [I T - Eu B] - [A N] [I N - I B] </li><li> A intensidade da coloração nuclear também pode ser calculada e utilizada como controlo interno entre os vários tratamentos. Uma vez que os núcleos não são afectadas pelo tratamento digitonina 17 ou ruptura do ribossoma 11, a quantidade de mRNA nuclear deve permanecer constante entre cada um desses tratamentos. Para calcular a fluorescência nuclear a seguinte fórmula é utilizada: [A N] [N I - IB] </li><li> A percentagem de ARNm citoplásmico que é ER-alvo pode ser calculada com base na fluorescência ER média de 30-40 células extraídas (ver 4.2.4), dividido pela média de fluorescência citoplasmática 30-40 células (não extraído novamente ver 4.2.4) . É fundamental que as células extraídas e não extraído são preparados, corados e fotografada em paralelo. </li></ol></li></ol>

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	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li><li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation.">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li><li>Grlich, D., Rapoport, T. 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Não há conflitos de interesse declarados.

A localização dos mRNAs para vários locais subcelulares, através da interacção com proteínas de transcritos de mRNA de localização, é um fenómeno generalizado importante para a triagem adequada de proteínas para o seu destino final, e para o ajuste fino da expressão de genes com os requisitos locais de uma subcelular região 19,20. Utilizando o ensaio aqui descrito, revisitamos a questão de se os ARNm que codificam para proteínas de secreção pode ser mantida no ER...

Nos eucariotas, a codificação de mRNA e proteínas da membrana secretada pode ser orientada para o ER por co-tradução do sinal de reconhecimento 1,2 partícula e pode ser mantido no ER via das interacções directas entre os ribossomas e translocons durante a tradução 3,4. No entanto, se mRNAs podem ser direcionados e mantido na ER independente de ou ribossomos ou a tradução não estava claro até muito recentemente. Estudos anteriores tentaram abordar se há tradução independente de associação com o mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamento celular. Como as condições químicas severas eram necessárias para desassociar ribossomos de ER vesículas derivados, que podem interromper o potencialmente delicado mRNA-ER associação, esses estudos não foram conclusivos, fornecendo provas para 5-8 e contra 9,10 ribossomal independente de ancoragem de mRNA para o pronto-socorro . Para contornar estes problemas, desenvolvemos um protocol para isolar e imagem ER ligados mRNAs. Este procedimento envolve um tratamento de extracção suave, que remove eficazmente todo o conteúdo citoplasmático da célula (incluindo os não-ligado ER mRNAs), ao mesmo tempo preservando a morfologia ER e todas as suas moléculas associadas. Usando este protocolo, demonstramos que um subconjunto de mRNAs são orientados e, em seguida, mantido na ER independentemente de ribossomas ou de tradução 11.

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

Nos eucariotas, a maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs), que codificam proteínas de membrana e segregadas são localizados na superfície do retículo endoplasmático (ER). No entanto, a visualização destes mRNAs pode ser um desafio. Isto é especialmente verdadeiro quando apenas uma fracção do mRNA é ER-associado e a sua distribuição a esta organela é obstruída por não-segmentados (isto é, &quot;livre&quot;) transcrições. A fim de controlar ER-associados mRNAs, foi desenvolvido um método no qual as células são tratadas com uma exposição de curta duração a uma solução de extracção que digitonina permeabilizes selectivamente a membrana do plasma e, portanto, remove o conteúdo citoplasmático, mantendo simultaneamente a integridade do ER . Quando este método é acoplado com hibridação in situ fluorescente (FISH), pode-se visualizar claramente ER-bound mRNAs por microscopia de fluorescência. Usando este protocolo o grau de ER-associação, quer para a granel de poli (A) ou transcritos de ARNm específicos podem ser avaliadose ainda quantificado. No processo, pode-se utilizar este teste para investigar a natureza do mRNA do ER-interacções.

Para determinar a percentagem de mRNA que é ER-associado, células COS-7 que foram transfectadas com os plasmídeos que continham a fosfatase alcalina de placenta (ALPP) ou citocromo P450-8b1 (CYP8B1) ou foram extraídas com digitonina e, em seguida, fixo, ou fixo directamente (ver Figura 1, comparar &quot;não extraído Ctrl&quot; para &quot;Extraído Ctrl&quot;). A fluorescência não nuclear foi quantificada em ambas as amostras e a fracção de ER-associated mRNA foi calculado <st...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

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Biology

14.2K visualizações.  University of Toronto. Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido fluorescente In situ Hibridação para detectar ou poli granel (A) mRNA ou transcritos específicos.

Vídeo: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biologia

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...