Os autores agradecem a José Luis De la Vega, Erika Melchy e Dr. Takuya Nishigaki para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-México) (99.333 e 128.566 para CT); Dirección General de Asuntos del Pessoal Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 para CT).

<ol>
	<li>Bouschet, T., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+as+an+extracellular+signalling+molecule:+perspectives+on+the+Calcium+Sensing+Receptor+in+the+brain.">Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain.</a> Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).</li><li>Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+the+development,+maturation,+and+function+of+spermatozoa.">Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa.</a> Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).</li><li>Esposito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+soluble+adenylyl+cyclase+are+infertile+because+of+a+severe+sperm-motility+defect.">Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).</li><li>Avenarius, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+male+infertility+caused+by+mutations+in+the+CATSPER1+channel+protein.">Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein.</a> American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).</li><li>Carlson, A. 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Cell Biol. 7, 690-696 (2006).</li><li>Strunker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2++influx+in+human+sperm.">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li><li>Lishko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Male+Fertility+by+Spermatozoan+Ion+Channels.">The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels.</a> Annu. Rev. Physiol. , (2011).</li><li>Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemically+generated+cytosolic+calcium+pulses+and+their+detection+by+fluo-3.">Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3.</a> J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).</li><li>Kilic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+progesterone:+a+new+tool+for+studying+rapid+nongenomic+actions+of+progesterone.">Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).</li><li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+activates+the+principal+Ca2++channel+of+human+sperm.">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li><li>Xia, J., Ren, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BSA-induced+Ca2++influx+during+sperm+capacitation+is+CATSPER+channel-dependent.">The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).</li><li>Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+sperm+capacitation:+assessment+of+phosphodiesterase+activity+and+intracellular+alkalinization+on+capacitation-associated+protein+tyrosine+phosphorylation.">Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation.</a> Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).</li><li>Baldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+accumulation+and+responsiveness+to+progesterone+in+capacitating+human+spermatozoa.">Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa.</a> J. Androl. 12, 323-330 (1991).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Sinalização intracelular é vital para a maioria das atividades celulares; Ca2 + é um mensageiro ubíquo que acompanha células de mamífero ao longo de toda a sua vida útil, a partir da sua origem no momento da fertilização, ao fim do seu ciclo de vida. Em resposta a diferentes estímulos, [Ca 2 +] i aumenta, oscila e diminui com a codificação espaço-temporal e, consequentemente, diversos processos são ativados, modulados ou denunciado por Ca 2 + mensagens codificadas. Ca <sup...

Ca2 + é um segundo mensageiro universal das vias de transdução de sinal em células eucarióticas. Intracelular de Ca2 + (Ca2 + i) participa na regulação de vários processos fisiológicos fundamentais tanto em células excitáveis ​​e não excitáveis. A importância e da universalidade da Ca2 + como segundo mensageiro durante eventos de transdução de sinal é obtido a partir da sua versatilidade espácio-temporal, na transmissão de informação no interior da célula. Enquanto Ca2 + não podem ser sintetizados de novo ou degradada no interior da célula, a sua concentração intracelular ([Ca 2 +] i) é mantida dentro de limites muito restritos por diferentes mecanismos celulares que tampão continuamente, sequestram, compartimentar, e / ou acumular Ca2 +. As alterações na concentração do ião pode ocorrer em regiões altamente localizadas dentro da célula 1, e decifrar tais flutuações é essencial para a obtenção de umeper compreensão de (1) a sua função no mecanismo de sinalização (2), o seu significado fisiológico, e (3) mecanismos gerais de sinalização celular. Ca 2 + sinalização mediada é de particular importância na fisiologia esperma 2. A motilidade espermática é uma das funções mais importantes para o sucesso de fertilização, e, de fato, vários defeitos motilidade dos espermatozóides pode causar esterilidade 3-5. A importância de Ca 2 + em circulação flagelar tem sido reconhecida 6, no entanto, o mecanismo de como Ca 2 + controla a forma específica de flagelar flexão não é totalmente compreendido. Antes da fusão com o ovo, os espermatozóides devem sofrer capacitação, um processo complexo que depende de residência de esperma dentro do trato genital feminino. Durante a capacitação, arquitetura lipídica da membrana de esperma e de organização são modificados, principalmente como um resultado da remoção do colesterol a partir da membrana plasmática. Além disso, várias proteínas são tirosina-fósforoylated 7. Importante, durante capacitação há um aumento do pH intracelular (pH I) e na [Ca 2 +] i, e o potencial de membrana em algumas espécies hiperpolariza 2. Capacitação só ocorre em uma subpopulação de espermatozóides (20-40%), e os mecanismos envolvidos em todas estas alterações celulares estão longe de ser clara. É geralmente aceite que apenas uma sub-população de esperma capacitada sofrer a reacção do acrossoma (AR), quando exposto a indutores fisiológicas. A AR é também um evento de Ca 2 +-regulada necessária para a fertilização em todas as espécies que possuem um acrossoma (organela especializada, com membranas externas e internas). Durante este processo, os fusíveis da membrana acrossomal exteriores com a membrana plasmática do espermatozóide, libertando enzimas hidrolíticas que permitem que a célula de esperma para penetrar na matriz de glico-proteico que rodeia o óvulo (zona pelúcida, ou ZP). A AR também expõe uma nova superfície de células de esperma, que interage com fusogénicoa membrana plasmática do ovo para que a fusão final de ambos os gâmetas. Existem vários ligandos celulares que induzem o AR, progesterona a ser uma das mais estudadas entre eles. Neste trabalho, apresentamos quatro diferentes técnicas que envolvem o uso de um corante fluorescente Ca 2 + sensível para medir [Ca 2 +] i alterações no esperma humano provocado pela progesterona (com exceção de citometria de fluxo, no qual medimos a [Ca 2 + ] i induzida aumentam durante o processo de capacitação in vitro). Neste caso específico utilizou-Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), um corante de membrana permeável com um K d = 325 nm. In vitro foi monitorada alterações de fluorescência como uma função do tempo com três das metodologias, e com a quarta técnica medimos valores de fluorescência a um único ponto no tempo. Estas diferentes abordagens se complementam, uma vez que eles fornecem completamente res espaciais e temporaislução em ambos os níveis de população de células de uma única célula e. População celular ou Experimentos em massa Técnicas de massa são amplamente utilizados, não só porque os instrumentos que requerem estão facilmente disponíveis, mas também porque são simples e bem estabelecido, e para permitir o cálculo da média da informação a partir de medições feitas em milhões de células numa única experiência. Técnica n º 1. Fluorometria convencional Esta técnica monitoriza as alterações na fluorescência como uma função do tempo, as experiências são realizadas em cuvetes de vidro, com volumes de amostra variam de 200 a 1000 ul. A mistura adequada de reagentes adicionados requer agitação magnética, e por conseguinte a resolução temporal obtida é da ordem de segundos. O intervalo de concentração típica de células das amostras analisadas é de 10 5 -10 8 células / ml. Técnica n º 2. Parado Fluorometria Fluxo Ta técnica também monitoriza as alterações na fluorescência como uma função de tempo, mas os reagentes são misturados rapidamente (através de pressão) numa cuvete de gravação que contém um volume de amostra muito pequena (variando 25-100 ul). Portanto, a homogeneização dos reagentes é instantânea, permitindo uma resolução temporal maior, na ordem de milissegundos. Análise da fluorescência vs tempo vestígios resultantes são adequados para a determinação da taxa de reacção, a elucidação da complexidade do mecanismo de reacção, obtendo-se informações sobre a vida curta intermediários da reacção, etc A gama de concentração de células comum das amostras analisadas é de 10 5 a 10 7 células / mL. Experiências de uma única célula Experimentos Granel relatar o comportamento médio de um grande número de células, no entanto, uma população podem frequentemente exibem propriedades que são heterogéneos negligenciado durante este tipo de medições. Técnicas de células individuais são então usadas para complementar thinformações e obtidos com as experiências da população de células. Técnica # 3. Citometria de Fluxo Apesar da importância da informação resultante a partir de medições de célula única, que é importante para analisar um grande número de células, a fim de impedir que a extrapolação errónea de propriedades específicas de células de uma população inteira. Por esta razão, as técnicas de alto rendimento são favorecidos e o método mais popular é a citometria de fluxo, em que 10.000 células por condição, são convencionalmente analisados. Este método permite uma análise multi-paramétricos de populações heterogêneas, uma vez que categoriza as células de acordo com seu tamanho (dispersão frontal (FSC)), granularidade (dispersão lateral (SSC)) e intensidade de fluorescência (rotulagem específico com um anticorpo, marcador de viabilidade, etc) , fornecendo assim informação sobre a distribuição dos parâmetros para um grupo de células. A citometria de fluxo fornece informações instantâneas ao invés de dependente do tempo 8. Para a frente e de lado valores dispersão arE também útil para a selecção de um portão que inclui células, mas discrimina os detritos celulares, a poeira, etc, para medições de fluorescência, fluorescência de controlos negativos e positivos devem também ser incluídos. Se mais de um canal de fluorescência é usada, um processo conhecido como a compensação deve ser realizada (ver detalhes <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensação permite a sobreposição espectral discriminação entre fluoróforos. A citometria de fluxo também permite a discriminação de células mortas, geralmente por meio de coloração com iodeto de propídio. Técnica n º 4. Única célula de imagem Microscopia é outro método comum para estudar o comportamento de célula única, que é bem adequado para estudos dependentes do tempo e também fornece uma resolução espacial. A principal desvantagem é que a análise de alto rendimento é de apenas incipiente no momento presente <sup&gt; 9.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ham's F-10</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N-6013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A-7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-3881</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Makler Counting Chamber</td>
 <td>SEFI Medical Insruments LTD</td>
 <td>SEF-MAKL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>20 vials/50 &mu;g each</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ionomycin</td>
 <td>Alomone</td>
 <td>I-700</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Progesterone</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P0130</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S-9888</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P-3911</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium bicarbonate</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3506</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M-2670</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C-1016</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H-3125</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>1906-01</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium pyruvate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P-2256</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium L-lactate (aprox. 99%)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L- 7022</td>
 <td>Reagents for human sperm medium (HSM)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L-7011 </td>
 <td>Component B</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)</td>
 <td>Sigma- Aldrich</td>
 <td>X-100</td>
 <td>2.4 mM solution in water </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Round coverslip </td>
 <td>VWR</td>
 <td>48380 080</td>
 <td>25 mm diameter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine solution </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manganese chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M-3634</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Attofluor; Cell Chamber, for microscopy</td>
 <td>Life technologies</td>
 <td>A-7816</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>5x5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

measuring intracellular ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging

Os espermatozóides são células reprodutoras masculinas, especialmente concebidos para alcançar, reconhecer e fundir-se com o ovo. Para executar essas tarefas, os espermatozóides precisam estar preparados para enfrentar um ambiente em constante mudança e superar várias barreiras físicas. Sendo na sua essência transcriptionally e translação em silêncio, estas células móveis dependem profundamente sobre diversos mecanismos de sinalização para orientar-se e nadar de forma dirigida, e de lidar com difíceis condições ambientais durante a sua jornada para encontrar o óvulo. Em particular, o Ca 2 + sinalização mediada é essencial para várias funções do esperma: activação de motilidade, capacitação (um processo complexo, que se prepara de esperma para a reacção do acrossoma), e a reacção do acrossoma (um evento exocitótica que permite a fusão espermatozóide-ovo). A utilização de corantes fluorescentes para controlar flutuações intracelulares deste ião é de extraordinária importância, devido à sua facilidade de aplicação, a sensibilidade, e versatilidade de detexão. Usando um único protocolo corante de carregamento de nós utilizamos quatro técnicas fluorométricos diferentes para monitorar esperma Ca 2 + dinâmica. Cada técnica fornece informações distintas que permite a resolução espacial e / ou temporal, gerando dados, tanto a nível da população de células de uma única célula e.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do protocolo experimental para a preparação de amostras de espermatozóides pelo método aquático. Os principais passos para a separação de espermatozóides móveis e para ajustamento da sua concentração são ilustrados. O último passo de incubação é realizado apenas quando a c...

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Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinâmica são muito importantes na fisiologia do esperma e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensíveis corantes fluorescentes constituem uma ferramenta versátil para estudá-los. Experiências da população (fluorometria e parou fluorometria fluxo) e experimentos com células individuais (citometria de fluxo e de imagem única célula) são usados ​​para rastrear espaço-temporal [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Alterações nas células de espermatozóides humanos.

Medindo intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Mudanças no esperma humano, utilizando quatro técnicas: fluorometria convencional, Parado Fluorometria fluxo, citometria de fluxo e única célula de imagem

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

measuring-intracellular-ca2-changes-human-sperm-using-four-techniques

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

20.1K visualizações.  Instituto de Biotecnología-Universidad Nacional Autónoma de México. Intracelular de Ca 2 + Dinâmica são muito importantes na fisiologia do esperma e Ca 2 + Sensíveis corantes fluorescentes constituem uma ferramenta versátil para estudá-los. Experiências da população (fluorometria e parou fluorometria fluxo) e experimentos com células individuais (citometria de fluxo e de imagem única célula) são usados ​​para rastrear espaço-temporal [Ca 2 +] Alterações nas células de ...

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