Este trabalho foi financiado pelo NIH concede GM45916 e GM66834 para JCH e uma bolsa da Fundação Internacional de Síndrome de Rett para AK Este trabalho também foi financiado pelo NIH conceder GM088409 e do Instituto Médico Howard Hughes contribuições para KL

1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem. <ol><li> Purifica-se e liofiliza histonas centrais recombinantes (H2A, H2B, H3, H4), tal como descrito 13. </li><li> Dissolve-se cerca de 5 mg de cada grupo de histonas liofilizado em 3 ml de tampão de revelação (6 M de guanidina HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM de DTT). Permitir que cada alíquota para dissolver durante pelo menos uma hora. Certifique-se de que nenhuma proteína permanece nos lados do recipiente. </li><li> Medir a absorvância de cada histona a 276 nm, utilizando tampão de desdobramento como referência. </li><li> Calcula-se a molaridade de cada histona usando seus coeficientes de extinção (Ver Tabela 1 </strong&gt; para Xenopus coeficientes de extinção histona). Comparar a absorção determinada concentração de histona para o peso seco liofilizado, e estimar se a maioria da proteína é dissolvida. </li><li> Determine quais histona você tem o menor número de moles de, como este será o número-limite de moles de todos os histonas. </li><li> Combina-se as histonas em quantidades molares iguais e diluir com desdobramento tampão até uma concentração final de 1 mg / ml. </li><li> Coloque a amostra em 6-8 kDa MWCO tubos de diálise. Veda-se o tubo e colocar em 2 L de tampão de re-enrolamento a frio (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 5 mM de β-mercaptoetanol). </li><li> Dializar a amostra durante 18 horas a 4 ° C com agitação. Verifique se o tubo de diálise pode girar livremente e vigorosamente, ou então as histonas pode precipitar. </li><li> Altere o tampão de diálise duas vezes no período de 18 horas (ou seja, mudar o tampão de redobramento sobre cada 6 horas até feito). Mesmo se precipitado é formado não descartea amostra, alguns octâmero pode ser recuperado, embora o rendimento será diminuída. </li></ol> Nota: Veja o passo 2,1-2,2 para preparar a coluna de equilíbrio para o dia seguinte. 2. Purificação de histona octâmeros por cromatografia de exclusão de tamanho Justificativa: Depois de concluir com a secção 1, amostras conterá octâmeros histonas, bem como outros complexos de histona tais como agregados, tetrâmeros H3/H4 e dímeros H2A/H2B. Octâmeros histona vai ser purificado a partir destes outros complexos utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). <ol><li> Conectar um HiLoad 16/60 Superdex200 16/60 em coluna (S200) a um sistema de FPLC. Certifique-se que as bolhas de ar não entrar no sistema. </li><li> Limpe a coluna S200 com 0,2 m de água filtrada. Use uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min e definir um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Verifique se você tem água suficiente e permitir que a coluna para limpar durante a noite. </li><li> Equilibrar a coluna e a amostra circular do F S200PLC utilizando tampão de redobramento. Use 1 L de 0,2 um tampão de redobragem filtrada. Fluir tampão de redobragem através da coluna a uma taxa de 1 ml / min e uma pressão máxima de 0,5 Mpa durante cerca de 2 horas. </li><li> Equilibrar um concentrador centrífugo Vivaspin (50 kDa MWCO) com 1 ml de tampão de redobragem. Retirar a amostra do tubo de diálise e centrifugar a amostra a 4 ° C, para remover quaisquer precipitados. Pipetar o sobrenadante da amostra no concentrador. Concentra-se a amostra a um volume de aproximadamente 500 ul. </li><li> Retirar a amostra octâmero concentrada para um novo recipiente e enxaguar o concentrador com 1 ml de tampão de redobragem. Concentra-se a lavagem até 500 mL, e adicioná-lo à amostra octâmero. Isto ajuda a recuperar qualquer octâmero remanescente no concentrador. </li><li> Girar a amostra num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante 5 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo novo. Isso ajuda a remover qualquer precipitado antes de colocar a amostra no FPLC. </li><li> Carregar a amostra na coluna S200. Carregar um máximo de 1,5 ml de volume total, ou 15 mg de octâmero em um único purificação. </li><li> Eluir a amostra usando o tampão de redobramento feitos na hora. Use uma taxa de fluxo de 1 ml / min e um limite de pressão de retorno de 0,5 MPa. Usar dois volumes de coluna (400 ml) de tampão de redobragem e recolher fracções de 2 ml. Monitorar a absorvância a 280 nm durante a eluição. As espécies diferentes irá eluir por ordem decrescente de tamanho. Agregados histona normalmente elui a aproximadamente 45 ml, octâmero em cerca de 65 ml, e dímero de cerca de 84 ml (Figura 1). </li><li> Analisar as fracções de eluição de pico de interesse, executando as amostras em um 18-20% de SDS-PAGE. As fracções contendo octâmeros purificadas deve ter quantidades molares iguais das quatro proteínas histona nucleares (Figura 1). </li><li> Reunir as fracções que contêm octâmeros purificados, e concentrar a ≤ 15 mg / ml com um filtro centrífugo Vivaspin. Se não for diluído, octâmeros pode dissociar-idímeros nto H2A/H2B e tetrâmeros H3/H4. </li><li> Determinar a concentração de octâmero medindo a absorvância a 280 nm e calcula utilizando o coeficiente de extinção a partir da Tabela 1. </li><li> Octâmeros histonas pode ser mantido curto prazo em tampão de redobramento a 4 ° C. Se a ser armazenadas a longo prazo, os octâmeros será mais estável a -20 ° C e em uma solução de glicerol a 50%. Octâmeros armazenados em glicerol deve ser dialisado para tampão de re-enrolamento fresco, antes de medições de absorvância e utilizar em reconstituições matriz nucleossomais. </li></ol> 3. Reconstituição de nucleosomal matrizes de DNA e purificada octâmeros Justificativa: Reconstituição de matrizes nucleossomais exige que octâmeros histonas e DNA template ser combinados em proporções molares específicas. Misturas de DNA e histonas octâmeros em 2 M NaCl são dialisados ​​passo em buffers de diminuir a força iônica. Uma mudança gradual para reduzir sal garante formação nucleosome adequada. Obtenção de nmatrizes ucleosomal com o nível desejado de saturação histona octâmero do ADN molde requer reconstituições de teste em pequena escala, seguida por uma reconstituição em larga escala preparativa. As condições adequadas definidas pelos reconstituições de pequena escala são utilizados para orientar a reconstituição preparativa. <ol><li> Purifica-se em tandem repetido ADN posicionamento nucleossoma como descrito 4,12. Resumidamente, isolar o DNA de plasmídeo usando o kit Qiagen GigaPrep ou um produto semelhante. Defina-se uma enzima de restrição digerir a fim de libertar o DNA molde e digerir o ADN do plasmídeo a tamanhos menores (≤ 700 pb). O ADN molde pode, então, ser purificado a partir dos pequenos fragmentos de ADN de plasmídeo, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A coluna alimentada por gravidade, com uma altura de cerca de 115 cm cheia com Sephacryl S-1000 grânulos é suficiente para a purificação de 601 x de DNA 207bp 12mer. </li></ol> Notas: Para a purificação de DNA plasmídeo em redução de custos, mas aumentou effort, pode-se utilizar a lise alcalina com fenol / clorofórmio, a purificação do DNA a fim de isolar o ADN de plasmídeo a partir de E. coli 23,24. Estratégias para a separação do molde de DNA a partir de DNA de plasmídeo pode variar com mudanças no tamanho do ADN molde. Por SEC é importante estabelecer a enzima de restrição digerir de uma forma que maximiza a diferença no tamanho entre o molde e o DNA de plasmídeo. <ol start="2"><li> Determinar quais as relações molares (r) a ser usado para reconstituições. R é igual à razão de moles de octâmero de moles de repetição de DNA. Para os testes iniciais de pequena escala, os valores de r de 0,9, 1 e 1,1 são apropriadas se a intenção é obter matrizes nucleossomais saturadas. </li><li> Preparar as amostras em pequena escala por meio do cálculo da quantidade de octâmero para adicionar cerca de 18 ug de ADN para cada razão molar a ser testado. Misture o ADN e histonas octâmeros. A concentração final de NaCl, a amostra deve ser ≥ 2 M, e a concentração final de DNA deve ser em torno de 0,3 mg / mL. As condições finais de tampão de amostra devem também incluir 10 mM Tris pH 7,8, e EDTA 1 mM. </li><li> As amostras estão agora prontas para diálise. Coloque as amostras em 12k-14k MWCO tubos de diálise. Dializar as amostras contra 2L de tampão de diminuição da força iónica como se segue. </li></ol> Componentes em todos os tampões: 10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM. Tampão 1 (adicionar 1 M de NaCl, 1 mM de DTT) por 5-6 horas. Tampão 2 (adicionar NaCl 0,75 M, DTT a 1 mM) durante a noite. Tampão 3 (adicionar NaCl 2,5 mM, DTT 1 mM) durante 5-6 horas. Tampão 4 (adicionar NaCl 2,5 mM, PMSF 0,1 mM) durante a noite. <ol start="5"><li> Retirar as amostras do tubo de diálise e siga para seções 4-6. Se as amostras de pequena escala produzir os resultados desejados, repita os passos nas seções 3-6 em larga escala. </li></ol> Nota: A fim de preservar os recursos, as amostras de pequeno porte devem ter o volume mínimo necessário para bastar para testes de rastreio a jusante. Para ter enough amostra para as experiências de velocidade de sedimentação e AFM listados aqui, amostras de 50 ul a 0,3 mg / ml de DNA são apropriados. O tamanho de grande escala, amostras de preparação são dependentes do seu uso pretendido. Uma amostra de grande escala, devem ser preparados da mesma maneira que as amostras de pequena dimensão. 4. Sedimentação Velocity Análise de reconstituídos nucleosomal matrizes Razão: experiências de velocidade de sedimentação das informações rendimento ultracentrífuga analítica Beckman Xl-A / I do tamanho e forma das moléculas em solução. Experiências de velocidade de sedimentação realizadas sob condições de baixa de sal são usados ​​para determinar o grau em que as matrizes são reconstituídos saturado com nucleossomas. <ol><li> Dilui-se a amostra a uma absorvância de cerca de 0,5 a 260 nm, utilizando tampão TEN (10 mM Tris pH 7,8, EDTA 1 mM, NaCl 2,5 mM). Carregar 400 ul de amostra em uma célula com uma peça central de duas sector, com a amostra, de um lado e a referênce (tampão TEN) na outra 25. Mantenha as menisco referência mais elevados do que o menisco da amostra (ie adicione 420 mL solução de referência). </li><li> Carregar as células em que o rotor, e alinhar as células usando adequadamente os cerquilhas na parte inferior das células e o rotor 25. Cuidadosamente a poeira das lentes das células usando ar comprimido. </li><li> Ligue a centrífuga XL-A/XL-I, insira o rotor, e anexar e garantir a ótica conforme descrito no manual. Abra o software Proteome Lab e selecione o arquivo: novo. </li><li> Configurar uma única corrida de digitalização a 3.000 rpm e uma temperatura de 25 ° C. Em Opções, selecione Parar após a última verificação e calibração radial run (calibração radial não é necessário se o rotor foi o último rotor utilizado na AUC). </li><li> Para cada célula, o nome das amostras, selecione um comprimento de onda (260 nm), selecione absorção, e escolha um local em seu computador salvar o arquivo. Comece a única corrida de varredura. </li><li> Use o único exame para determinar a ra apropriadadiscar o comprimento da digitalização (Figura 2A). Diminuição do comprimento da célula que vai ser digitalizada diminui o tempo de execução. No entanto, não se esqueça de incluir o menisco amostra e estender o fim muito próximo, ou na parte inferior da célula. </li></ol> Nota: scans Solteiro permitir área de medição para ser reduzido por medidas a partir pouco antes do menisco da amostra (Figura 2A). A maioria das verificações gerados durante a execução AUC deve ter fracções de limite últimos menisco, bem como planaltos estável (Figura 2B). As lentes sujas sobre as células da AUC podem gerar scans com grandes picos, que podem afectar a análise dos dados. O software UltraScan inclui um manual, que é um grande recurso para obter informações sobre a análise de dados ultracentrifugação analítica 26. <ol start="7"><li> Usando o painel de controle XL-A/XL-I, digite uma velocidade de 0 e começar a pressionar. Isso fará com que a câmara de centrifugação para puxar um vácuo e todosow a temperatura da câmara para equilibrar. Espere 1 hora para permitir a temperatura de equilíbrio, antes de começar a correr. </li><li> Use o software para definir o prazo para a velocidade desejada eo número de exames. Velocidades mais altas aumenta a resolução, mas deve-se coletar pelo menos 20 exames (de preferência mais) antes de a amostra ter sedimentado para o fundo da célula. É conveniente para sobrepor os últimos exames realizados (no menu de opções), a fim de monitorar o progresso da execução e verificar se há problemas potenciais, tais como células vazando. Monitore o primeiro par de exames para garantir o funcionamento adequado. </li></ol> 5. Editar e analisar dados de sedimentação Velocity Justificativa: dados de velocidade de sedimentação Raw deve ser analisada por um programa que produz uma distribuição coeficiente de sedimentação com correção de difusão. Esta informação, por sua vez indica que a fracção de uma amostra reconstituída que contém um determinado nível de saturação, por exemplo, </em&gt; se estiver usando um modelo de DNA 12-mer, será possível determinar a fração de matrizes reconstituídos, que tem 10, 11 e 12 nucleossomos / DNA. <ol><li> Use AUC software de análise de dados, como UltraScan para editar os dados 26. Edição de dados de varredura deve ser feito para cada célula e cria um conjunto de dados para análise posterior. Edição adequada de varreduras envolve a definição de menisco da amostra, reduzindo os dados para uma região de interesse, e a definição de linha de base, bem como as regiões de planalto (Figura 2). Varreduras indesejadas pode também ser removido do conjunto de dados neste ponto. No entanto, uma vez que é possível remover as verificações não desejadas durante a análise, recomenda-se que todas as verificações de ser mantida a este ponto. </li><li> Nós recomendamos fortemente que o método van Holde-Weischet reforçada ser usado para analisar os dados 27. Este método de análise corrige os efeitos de difusão ao longo da corrida e produz a distribuição integrante dos coeficientes de sedimentação. Em especial, O método aprimorado van Holde-Weischet (implementada em UltraScan) vai permitir a inclusão de exames que faltam platôs estáveis, ou que contêm frações de fronteira que não limpou o menisco na análise 28. </li><li> Determinar a distribuição dos coeficientes de sedimentação para as matrizes montadas. Os resultados representativos para 601-12 (207bp, 12-mer) matrizes nucleossomais são mostrados na Figura 3. </li><li> Se uma das amostras em pequena escala contém matrizes com a faixa desejada de coeficientes de sedimentação, em seguida, repita o processo em um aumento da escala começando com a seção 3. Se nenhuma das amostras de pequena escala tem uma distribuição adequada dos coeficientes de sedimentação, em seguida, repetir os testes de pequena escala com uma nova gama r começando na seção 3. </li></ol> 6. Visualizando nucleosomal matrizes com Microscopia de Força Atômica (AFM) Razão: AFM permite a visualização do nível de saturação de nucleosomal matrizes. Esta técnica complementa velocidade de sedimentação com a AUC e a digestão com enzimas de restrição, como um ensaio de controlo de qualidade. <ol><li> Usando os métodos descritos acima, obter uma matriz de nucleossoma bem saturado (Figura 5A). </li><li> Preparar APTES tratada lâminas de mica, colocando ~ 30 ul de diluição de 1:1.000 comercial (Sigma-Aldrich (3-aminopropil) trietoxi-A3648-100 ml) em 0,22 um filtrado de água nanopura para 30 min. </li><li> Após 30 minutos lave as APTES com água filtrada e seque-os delicadamente em um fluxo de nitrogênio. </li><li> Coloque adequadamente diluído amostra variedade nucleosome (~ 1,5 ng / mL) no slide, e incubar coberto em temperatura ambiente por 15 min. </li><li> Enxágüe provar off com tampão de amostra filtrada, seque como antes, e lugar de slides no palco do AFM (neste caso, um Microscópio de Força Atômica Asylum Research MFP-3D). </li><li> Comece pela imagem 2 x 2 m scans com 512 linhas de varredura. Contar o número de nucleossomos para determinar nível de saturação (Figura 5B). </li><li> Idealmente, você deve áreas de imagem no slide com matrizes nucleossomos bem separados. </li><li> Para imagens de alta resolução, um nm de digitalização de 500 x 500 pode ser obtido (Figura 5C). </li><li> As imagens podem ser achatado e analisados ​​usando o software MFP-3D fornecido pelo Asilo. </li><li> Cada imagem pode ser dividida em quatro quadrantes e ampliada digitalmente para obter uma visão mais clara de matrizes bem separados e várias linhas de mão livre podem ser tiradas através das matrizes e perfis de altura são obtidos para os nucleossomos (Figura 5C, certo traço painel altura e 5D). </li><li> Várias dessas imagens deverá ser analisada para cada tipo de matriz que abrange várias centenas de nucleossomas. Altura perfis são registrados, classificados e plotados em MS Excel. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução 30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome 35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações...

Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sido referido como a fibra de 10 nm ou as &quot;pérolas num fio&quot; estrutura e está presente in vitro sob condições de baixo teor de sal 2. A fibra de 10 nm é capaz de condensar em estruturas de ordem superior através de compactação intra-array e / ou inter-array oligomerization 2. Estas estruturas de ordem superior pode ser induzida na presença de sais,ou pode ser influenciada por meio da ligação de proteínas de arquitectura da cromatina para a matriz nucleossomal 3,4. Os níveis de compactação da cromatina são inversamente correlacionada com a taxa de transcrição in vivo 5,6. Uma pesquisa recente destaca a importância da organização estrutural de genomas em processos como a diferenciação, o desenvolvimento de câncer, e outros 7,8. O uso de matrizes nucleossomais para estudar a estrutura e função da cromatina tornou-se generalizada. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e DNA posicionamento nucleosome. Usando DNA recombinante com repetições em série de sequências de posicionamento nucleossomas permite a reconstituição de matrizes que contêm nucleossomas regularmente espaçados. Duas das seqüências de posicionamento mais populares são a seqüência do gene 5S rRNA eo &quot;601&quot; seqüência 9,10. A sequência de 601 foi derivado de experiências de SELEX e more posiciona fortemente nucleossomos do que a seqüência 5S 11. Por conseguinte, o comprimento do DNA adaptador das matrizes 601 é mais homogénea. DNA posicionamento nucleosome tandem repetido é obtido por filtração em gel 4,12. Histonas recombinantes são purificados a partir de E. Coli sob condições de desnaturação 13. O uso de histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente a composição das histonas nucleossomais matrizes. Por exemplo, o núcleo histonas com mutações específicas 14 ou modificações pós-traducionais 15,16 pode ser substituído por histonas centrais de tipo selvagem. Experimentos de velocidade de sedimentação monitorar a taxa de sedimentação de macromoléculas em solução sob uma força centrífuga aplicada 17. Este fornece informação sobre o tamanho e forma de macromoléculas numa amostra. Experimentos de velocidade de sedimentação são, portanto, uma ferramenta adequada para o estudo de soluções mudanças de estado em fibras de cromatinaestrutura devido à condensação da cromatina 18. Importante, é primeiro necessário utilizar experiências de velocidade de sedimentação, como um passo de controlo de qualidade em nucleossomal reconstituição matriz. Se o DNA e nucleossomos não são combinados na proporção molar apropriado, os conjuntos podem ser sub-ou sobre-saturado com histonas do núcleo. Assim, a informação obtida a partir de experiências de velocidade de sedimentação é usado para garantir que o ADN está adequadamente saturada com nucleossomas. É importante a utilização de métodos alternativos para estimar a saturação de ADN com os nucleossomas, especialmente se a trabalhar com um molde de ADN anteriormente não caracterizada. Portanto, nós também descrevem um método para análise de matrizes nucleossomais usando microscopia de força atômica (AFM). AFM é uma técnica poderosa que permite a visualização dos efeitos de uma série de parâmetros, tais como o nível de saturação, o efeito da presença de variantes de histona ou os efeitos de MgCl2 19,20. AFM também tem sido aplied para estudar a dinâmica nucleossomos usando tempo de imagem lapso 21. In vitro montado nucleossomais matrizes 12-meros são particularmente passíveis de estudos de AFM, porque eles pertencem à faixa de tamanho certo para AFM 22. No presente estudo, utilizamos AFM de matrizes nucleossomais como um controle de qualidade, bem como um meio de afirmar os dados da AUC (&quot;ver para crer&quot;). Além de simples visualização, AFM permite a medição de perfis de altura de amostras como uma métrica adicional.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.

Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 207 x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados ...

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Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

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22.4K visualizações.  Colorado State University.  Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição. 

Vídeo: Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Combinando QD-FRET e microfluídica para monitorar Nanocomplex DNA Automontagem-in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...