Informações estruturais sobre como enzimas de reparo por excisão de base removem lesões de DNA no contexto da cromatina têm sido escassas. Isso constitui uma lacuna significativa em nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na etiologia das doenças humanas. A principal vantagem do nosso protocolo é que otimizamos a preparação da amostra usando equipamentos laboratoriais padrão.
Isso permitirá que outros bioquímicos da área complementem seu trabalho bioquímico com estudos crio-EM tecnicamente viáveis. Nosso protocolo também pode ser usado para investigar como outros fatores, incluindo fatores de transcrição pioneiros, envolvem o nucleossomo. Esta é uma área em que a informação estrutural também tem sido limitada.
Otimizar a preparação da amostra antes de passar para as condições de congelamento foi fundamental para levar nosso projeto adiante, e isso é melhor feito com ensaios bioquímicos padrão em condições de projeto, ligação e reticulação de substratos. Para começar, incube o NCP e o fator de reparo de DNA de interesse no gelo por 15 minutos usando um tampão ideal para o complexo específico. Em seguida, adicione o glutaraldeído a uma concentração final de 0,005% Depois de misturar bem, incubar em temperatura ambiente por 13 minutos.
Temperar com um molar Tris-CL até uma concentração final de 20 milimolares Tris-CL com pH 7,5. Em seguida, concentre para aproximadamente 50 microlitros e troque o tampão por tampão de congelamento usando uma coluna de dessalinização. Em seguida, determine as absorbâncias na densidade óptica de 280 e 260 nanômetros e concentre-se ainda mais, se necessário, para atingir 1,3 a 3 miligramas por mililitros, com base na densidade óptica de 280 nanômetros.
Após o preparo do botão de diálise, coloque o botão que contém a amostra em cima de um leito de polietilenoglicol com a membrana voltada para baixo. Para realizar a purificação por cromatografia de exclusão de tamanho, lavar e equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com 60 mililitros de água destilada, seguida de 80 mililitros de tampão de congelamento durante a noite a uma taxa de 0,4 mililitros por minuto. Em seguida, analise imediatamente as frações de pico e concentre as frações contendo a proteína de infusão de histona MBP-PolBeta-APE1.
Demonstrando os seguintes procedimentos estará Elizabeth Viverette, uma estagiária de pós-bacharelado do núcleo de crio-EM aqui no NIH. Depois de ligar o congelador de imersão e encher o umidificador com 50 mililitros de água destilada, ajuste a temperatura da câmara para 22 graus Celsius e a umidade para 98% Em seguida, coloque o copo de etano e o copo de nitrogênio líquido nos respectivos suportes de espaço. Depois, cubra o copo de etano com o dispensador da tampa de etano e despeje cuidadosamente nitrogênio líquido sobre ele, enquanto também enche o copo de nitrogênio com nitrogênio líquido.
Quando o nível de nitrogênio líquido tiver se estabilizado e atingir 100% e a temperatura atingir 180 graus Celsius negativos, abra cuidadosamente a válvula de etano e encha o copo de etano até formar uma bolha na tampa transparente. Em seguida, remova o dispensador de etano. Coloque dois papéis de filtro no dispositivo de mancha e prenda-os com um anel de metal.
Vá para a configuração e defina os parâmetros de blotting conforme descrito no manuscrito, selecione A-Plunge e clique em OK. Na tela principal, clique em Load Forceps e carregue-os com uma grade com o lado de aplicação de carbono voltado para a esquerda. Calibre as pinças, ajustando o eixo Z para garantir uma mancha sólida. Clique em Câmara Inferior e aplique três microlitros do complexo.
Em seguida, clique em Blot A-Plunge, que girará a grade para manchar a partir da frente e irá mergulhá-la. Após a transferência, guarde a grade na caixa de grade na câmara de nitrogênio líquido. Quando todas as quatro grades tiverem sido congeladas e colocadas na caixa de grade, gire a tampa para a posição neutra, onde todas as grades estão cobertas pela tampa e aperte o parafuso.
Antes de carregar as amostras no microscópio, coloque as grades vitrificadas em um anel e fixe-o usando um C-clip sob nitrogênio líquido em uma sala com umidade controlada para evitar a contaminação do gelo. Ao carregar o microscópio, insira as grades em um de 12 slots. Embaralhe o em uma cápsula nanocab e carregue-o no carregador automático.
Em seguida, transfira a grade do para o estágio do microscópio. Ajuste o estágio para a altura eucêntrica oscilando o estágio em 10 graus e, simultaneamente, movendo a altura Z até que um deslocamento planar mínimo seja observado nas imagens. Uma vez atingida a altura eucêntrica, inicie a criação de imagens tomando uma imagem de montagem 3 por 3 da grade na qual cada montagem é feita com aumento de 62x para obter o atlas.
Depois de escolher três quadrados de tamanhos variados e tomar a altura eucêntrica, imagem em ampliação de 210x. Uma vez que um quadrado é fotografado, escolha um buraco cada da borda, centro e entre dentro dos quadrados. Em seguida, imagine cada furo com ampliação de 2,600x.
Pegue a imagem de alta ampliação do centro do furo com ampliação de 36.000x e tempo de exposição de 7,1 segundos, 60 quadros, tamanho de 1,18 pixel e desfoco de três micrômetros. Veja imagens representativas da triagem. Para determinar a razão entre NCP e MBP-PolBeta-APE1 para formar complexo estável, foram realizados ensaios de deslocamento da mobilidade eletroforética, que mostraram uma banda isoladamente deslocada do NCP com excesso molar de cinco vezes de MBP-PolBeta-APE1.
Em menor volume, a montagem do complexo NCP-PolBeta-APE1 demonstrou que a amostra foi excessivamente reticulada e resultou em agregados sem complexos individuais discerníveis. No entanto, a diluição de dez vezes em PCN resultou em agregação significativamente reduzida e melhor estabilidade de partículas. Os métodos de exclusão de gel preparativo e tamanho podem ser combinados onde o gel preparativo melhora a qualidade dos PCN quando eles contêm uma quantidade significativa de agregados de alto peso molecular, seguido pela purificação do complexo via exclusão de tamanho.
Os resultados mostram que ambos os métodos podem ser usados independentemente para gerar complexos estáveis. Além disso, os dados coletados de ambas as grades mostram classes bidimensionais quase idênticas e mapas tridimensionais com resolução de aproximadamente 3,2 angstroms. Uma relação ótima entre NCP e fator de reparo de DNA deve ser determinada primeiro, em seguida, a reticulação do complexo com glutaraldeído deve ser realizada pelo menos 10 vezes mais diluída do que a concentração necessária para o congelamento.
Depois de obter um mapa 3D crio-EM do complexo, um refinamento estrutural adicional será necessário para determinar como o fator de reparo de DNA é encontrado e identificar quais regiões são importantes para essas interações.
