Gostaríamos de agradecer ao Dr. Wesley Wang por estabelecer as bases para este protocolo e sua valiosa mentoria. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e pela Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Construção plasmid
<ol><li>Comece decidindo qual proteína de histona será acetilada e em qual sítio de lise. Mutação do site para o codon de parada âmbar (TAG) usando mutagênese direcionada ao site. NOTA: Existem quatro plasmídeos previamente projetados utilizados para a expressão de proteínas histonas. Todas as quatro proteínas histonas foram clonadas no vetor pETDuet-1 com uma etiqueta de histidina n-terminal. Histone H4 também inclui uma tag SUMO, a origem do colE1 de replicação com um número de cópia de aproximadamente 40, resistente à ampicilina, e um promotor T7.<ol>
<li>Projete primers para frente e reverso que contenham uma mutação TAG no local desejado (substituindo um codon de lysina existente pelo codon de parada âmbar) em um dos quatro plasmídeos de proteína histona.</li>
		<li>Use PCR de plasmídeo inteiro para amplificar o TAG contendo plasmídeo. Determine uma temperatura de ressarcial apropriada para os primers. Em geral, a temperatura de fusão (Tm)dos primers menos 5 °C será suficiente. Se houver dificuldade para obter um produto PCR, um gradiente de temperatura em torno de Tm - 5 °C pode ser usado para otimizar a temperatura de ressarcimento para amplificação. NOTA: Neste experimento foi utilizada uma polimerase pfu expressa internamente para 30 ciclos com as seguintes condições: 94 °C para 30 s (desinaturação), temperatura de ressarcial para 30 s e 72 °C para 6 min (ou 1 min por quilobase-pares). Para obter mais detalhes sobre este tipo de método PCR, consulte Liu e Naismith7.</li>
		<li>Limpe o produto PCR com um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante. Analise o produto PCR por eletroforese de gel agarose e posterior coloração de brometo de ethidium.</li>
		<li>Liga o plasmídeo incubando com liga ligase T4 durante a noite a 16 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Primeiro transforme a TAG contendo plasmídeo (AmpR)em Escherichia coliquimicamente competente . Escolha um mínimo de 4 colônias da transformação e purifique o plasmídeo. Faça estoques de células de cada um com glicerol usando métodos padrão e armazene a -80 °C. Envie para sequenciamento para confirmar a mutação TAG desejada.</li>
	<li>Uma vez confirmada a sequência, co-transforme o plasmídeo contendo TAG (AmpR) com pEVOL-AckRS (ChlR) em CobB quimicamente competente (a única deacetylase histone lysine conhecida em células BL21 de E. coli.) usando o método de choque térmico. pEVOL é um plasmid com um número de cópia média para baixo número de cópia p15A de origem. NOTA: A série pEVOL de plasmídeos foi construída com base em estudos anteriores que mostraram uma expressão aumentada do par ortogonal aaRS/tRNATyr foi eficaz na diminuição da truncação proteica e no aumento do rendimento global das proteínas mutantes8. Se as células de exclusão de CobB não estiverem acessíveis, proceda com células BL21 quimicamente competentes. CobB é uma deacetilase de histonina de histonina e nicotinamida semelhante a histuina sirtuina e nicotinamida pode ser adicionada a uma concentração final de 5 mM durante a expressão da proteína histona para inibir o CobB como uma abordagem alternativa9.</li>
	<li>Faça um estoque de celular e armazene a -80 °C.</li>
</ol>2. Expressão de proteína histona acetilada
<ol><li>Prepare 1 L de mídia 2YT autoclaved (ou volume de escolha) em um frasco de cultura.</li>
	<li>Inocular 20 mL de mídia 2YT contendo os antibióticos apropriados com o estoque de células co-transformadas que tem o plasmídeo contendo TAG (AmpR) e pEVOL-AckRS (ChlR) e crescer a 37 °C a OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Adicione os antibióticos apropriados ao 1 L de mídia 2YT autoclaved e inoculada com a cultura inicial de 20 mL. Cresça a 37 °C a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Adicione agentes indutores e acetilizesina (AcK) às concentrações finais de IPTG 1 mM, 0,2% arabinose e AcK 5 mM.</li>
	<li>Cresça a cultura a 37 °C para 6-8 h.</li>
	<li>Células de pelota a 2.700 x g por 15 min.</li>
	<li>Armazene a pelota da célula a -80 °C durante a noite.</li>
	<li>A partir deste passo em diante mantenha a amostra no gelo o tempo todo. Dissolva a pelota celular em 50 mL de tampão de histona por 1 L de cultura.</li>
	<li>Sonicate de acordo com o seguinte ciclo: 1 s on, 1 s off, total at time: 3 min a 60% de amplitude.</li>
	<li>Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 45 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão de supernasciente e resuspend em 30 mL de tampão de histona. A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 30 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão supernasce e resuspend em 30 mL de tampão de lavagem de pelotas. Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 30 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão supernasce e dissolvido em 25 mL de 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl). Incubar com agitação a 37 °C por 1h. NOTA: Se necessário, os corpos de inclusão podem ser incubados com agitação durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 45 min. Incubar o supernaente com 1 mL de resina Ni-NTA equilibrada com tampão guhcl de 6 M por 2 h.</li>
	<li>Prossiga com a purificação ni-NTA em condições desnaturadas. Lave a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem de coluna. Elute acetilou proteína histona com 10 mL de tampão de eluição. NOTA: Tentar concentrar a proteína aqui é uma opção, mas histones acetilados são muito imprevisíveis e podem facilmente precipitar. Não é recomendável concentrar-se além de 2 mL em volume total.</li>
	<li>Digele extensivamente a proteína histona acetilada contra 5% de tampão de ácido acético para remover sais. Dialisar por 3h de cada vez a 4 °C, trocando por tampão fresco mínima de 6 vezes. NOTA: Para uma melhor pureza proteica, há a opção de diálise contra água pura. No entanto, isso causa precipitação significativa e redução no rendimento que pode ser indesejável para proteínas histonas acetiladas de baixo rendimento.</li>
	<li>Aliquot e proteína liofilizada, e armazenar indefinidamente a -80 °C. As proteínas histonas do tipo selvagem geralmente produzem 10-50 mg/L, enquanto as proteínas de histona acetiladas produzem menos de 10 mg/L, dependendo do local específico da lise. Por exemplo, H3K79Ac tem uma média de 5 mg/L.</li>
</ol>3. Expressão de proteína histona tipo selvagem
<ol><li>Para montar nucleossomos completos, expresse todas as 4 proteínas histonas. Ao expressar e purificar histones do tipo selvagem, o protocolo é o mesmo que as histonas acetiladas, exceto as seguintes:<ol>
<li>Não realize a co-transformação. Não use pEVOL-AcKRS para expressão histona tipo selvagem. Ajuste os antibióticos de acordo.</li>
		<li>Não use uma linha celular de exclusão de CobB ou adicione nicotinamida, AcK ou arabinose durante a indução da expressão celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparação de 601 DNA
NOTA: Uma sequência de DNA otimizada previamente projetada para o posicionamento nucleossomo direto é montada com octamers de histona para produzir mononucleossomo com alta eficiência. Esta sequência é referida como 601 DNA ou a sequência de Widom. Esta sequência tornou-se a sequência padrão de DNA para estudos in vitro de nucleososos desde ensaios de remodelação de cromatina até medições de molécula única10.
<ol><li>Para preparar quantidades significativas de DNA 601 para montagem nucleosômica, transforme pGEM-3z/601 em células Top 10 e cresça 10 mL de cultura para amplificação e extração plasmóides. Use um kit de extração de plasmídeos e siga a recomendação do fabricante.</li>
	<li>Use uma polimerase PFU expressa internamente (mais eficiente) para este protocolo de amplificação. Configure uma reação pcr: Para uma reação de 250 μL, use 207,5 μL autoclaved MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccgg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. Normalmente corremos 60 reações de uma vez para obter DNA suficiente para montar.</li>
	<li>Use uma temperatura de ressarção de 52 °C para 30 s e um tempo de extensão de 30 s se usar polimerase PFU. Caso contrário, siga as condições recomendadas pelos fabricantes.</li>
	<li>Uma vez feito o PCR, use um kit de limpeza PCR para purificar o produto PCR.</li>
</ol>5. Montagem de histone octamer
<ol><li>Dissolva alíquotas de pelotas de proteína histona H2A, H2B, H3 e H4 para que haja um estoque separado de cada proteína histona em Tampão guhcl com um volume total de 100 μL.</li>
	<li>Calcule a concentração de cada proteína histona medindo a absorvância A280.</li>
	<li>Se a absorvância for maior que 1 para qualquer proteína, dilui com o tampão guhcl para obter uma concentração mais precisa.</li>
	<li>Combine proteínas H2A e H2B em uma razão molar de 1:1 e dilua para uma concentração proteica total de 4 μg/μL. Repita para H3 e H4.</li>
	<li>Dialyze sequencialmente a 4 °C contra 2 M TE tampão durante a noite, 1 M TE tampão por 2 h e 0,5 M TE tampão por 5 h. NOTA: O segundo e terceiro passos da diálise faz com que as conformações instáveis de proteínas precipitam. Espera-se que haja precipitação pesada nestas etapas.</li>
	<li>Remova precipitados por centrifugação a 16.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Novamente, calcule a concentração de dimers de histona (mistura H2A/H2B) e tetramers (mistura H3/H4) medindo a absorvância A280.</li>
	<li>Misture dimers e tetramers em uma relação molar de 1:1 e ajuste NaCl para 2 M pela adição de NaCl sólido.</li>
	<li>O octamer histona pode ser armazenado a 4 °C e é mais estável do que os dimers e tetramers. Nunca congele a octamer de histona, pois isso pode causar desmontagem.</li>
	<li>Se montar com histones acetilados, basta substituir a proteína do tipo selvagem pela proteína acetilada no procedimento.</li>
</ol>6. Montagem nucleossomo
<ol><li>Use tampão 100x TE e NaCl sólido para ajustar 601 DNA ao buffer te de 2M. Adicione o DNA 601 em tampão 2M TE ao octamer histona em uma razão molar de 0,85:1 a 0,90:1. Uma menor proporção de DNA pode ser adicionada se o DNA livre estiver presente na análise de mudança de gel.</li>
	<li>Transfira a mistura DNA-histona de um saco de diálise e coloque em cerca de 200 mL de tampão de 2M TE (ou mais se montar várias amostras) e mexa suavemente a 4 °C.</li>
	<li>Ajuste uma bomba peristáltica para limpar para gotejar lentamente sem tampão de TE de sal. Quando o volume tiver aproximadamente dobrado, despeje metade do volume. Faça isso pelo menos 4 vezes no total. Com uma bomba, pode levar de 4 a 8 h, dependendo do volume inicial. Os nucleosmos formam-se quando a concentração de sal é reduzida para 150 mM (medida pelo medidor de salinidade).</li>
	<li>Após a concentração de sal ser reduzida para 150 mM, dilíque contra um buffer TE de 20 mM durante a noite.</li>
	<li>Remova precipitados por centrifugação e meça a concentração dos nucleosmos por uma leitura260 usando um leitor de placas.</li>
	<li>Adicione protease His-TEV (TEV: nucleossomo 1:30, w:w ) e incubar durante a noite a 4 °C para remover todas as tags de histidina. Remova as impurezas da tag histidina da solução nucleossom pela resina Ni-NTA puxada para baixo.</li>
	<li>Para posicionar o nucleossomo e homogeneizar a amostra, incubar a 60 °C por 1h. NOTA: Para locais acetilados que são particularmente instáveis, esta etapa pode não ser aconselhável.</li>
	<li>Armazene nucleososomos por curto prazo (algumas semanas) a 4 °C.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, dilyze nucleossomos contra buffer de armazenamento e armazene a -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysyl-tRNA+synthetase:+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool.">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li><li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo.">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li><li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7.">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91 (2008).</li><li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli.">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li><li>Gallego-Jara, J., &#201;cija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., C&#225;novas D&#237;az, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide.">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689 (2017).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol.">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li><li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

Não há interesses financeiros concorrentes para declarar por nenhum dos autores.

É essencial seguir este protocolo em cada detalhe durante um experimento. Os nucleosmos não são muito estáveis e muita tentativa e erro foi para determinar este protocolo. É fundamental remover precipitados a cada passo (ou sempre observado) porque as partículas podem interferir facilmente nos processos de montagem. Sempre mantenha amostras de histona no gelo. Se os nucleosómos são armazenados a 4 °C por muito tempo, eles podem desmontar espontaneamente. Certifique-se de verificar quaisquer amostras por Native P...

Utilizamos PylRS e tRNAPyl para sintetizar e montar mononucleosmos reconstituídos com histones acetilados específicos do local. A PylRS provou ser inestimável como uma ferramenta de expansão de código genético para produzir proteínas com modificações pós-translacionais (PTMs) e foi geneticamente evoluída para incorporar cerca de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora em um códon de parada âmbar, removendo a concorrência de outros aminoácidos durante a tradução. PylRS foi descoberto pela primeira vez na arquiaia metogênica, e desde então tem sido utilizado em biologia química para incorporar novos grupos químicos reativos em proteínas1,2.
O MMAcKRS1 foi evoluído de Metanoosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizado em nosso laboratório para a síntese de proteínas acetiladas3,4,5,6. MmAcKRS1 fornece AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica foi usada anteriormente para incorporar ack em k4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, e K79 histone H3 lysine sites para estudar a atividade de Sirtuin 1, 2, 6, e 7 em mononucleosmos acetilados4,5,6. Aqui detalhamos este método para expressar histones acetilados e nucleosómos acetilados reconstituídos.

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Column Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histone Lysis Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td></td><td></td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Storage Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

Proteínas histonas acetiladas podem ser facilmente expressas em Escherichia coli codificando um mutante, Nε-acetil-lysine (AcK)-específica Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) e seu tRNA cognato (tRNAPyl) para reunir mononucleosmos estabelecidos com histones acetiladas específicas. MmAcKRS1 e tRNAPyl entregam AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica tem sido usada extensivamente para incorporar AcK em locais de lise H3. A sithetase pirrolysíl-tRNA (PylRS) também pode ser facilmente evoluída para incorporar outros aminoácidos não-orônicos (ncAAs) para modificação ou funcionalização de proteínas específicas do local. Aqui detalhamos um método para incorporar o AcK usando o sistema MmAcKRS1 no histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas em mononucleosmos reconstituídos. Mononucleososes reconstituídos acetilados podem ser usados em ensaios bioquímicos e de ligação, determinação da estrutura e muito mais. A obtenção de mononucleosmos modificados é crucial para projetar experimentos relacionados à descoberta de novas interações e compreensão da epigenética.

Dimers, tetramers e octamers podem ser avaliados executando um gel de PÁGINA SDS de 12%(Figura 1 e Figura 2). Aqui você pode ver que alguns dos tetramers acetilados têm um rendimento menor do que outros(Figura 1). De fato, quanto mais perto da região central, menor o rendimento observado. Isso é mais provável devido à acetilação interferindo na montagem do tetramer quanto mais perto você ch...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

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3.9K visualizações.  Texas A&M University. Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.

Vídeo: Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Bioquímica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Química

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Biologia

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Bioengenharia

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstituição de nucleossomos in situ para estudos de molécula única

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Reconstituição eficiente de nucleossomos para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Imunologia e Infecção

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

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Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina