Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

1. Crescimento de Células de Levedura <ol><li> Escolha as estirpes de levedura adequadas para ser utilizadas para as medições da taxa de decaimento do mRNA. Para inibir a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, utilização de estirpes de levedura portadores da mutação rpb1-1 1. Obter essa cepa de levedura de um laboratório que já tem um, ou gerá-la em laboratório, utilizando técnicas padrão se uma base genética específica é necessária 9. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, preparar a mídia de levedura usando procedimentos padrão 10. Se nenhuma seleção for necessário, preparar rich media como YPD. Em alternativa, preparar meios selectivos, se as células de levedura são transformadas com plasmídeos e selecção é necessária. Autoclave da mídia. </li><li> Crescer as células de levedura, a 28 ° C, que é a temperatura permissiva para esta estirpe de levedura. Faça isso em duas etapas: <ol><li> Pela primeira O / N, crescer as células de levedura em 5 ml de meio de crescimento para a saturação.</li><li> Configurar o segundo O / N no final do segundo dia. Para o segundo O / N, inocular quantidades diferentes de células de levedura a partir da primeira O / N em 100 a 150 ml de meio de crescimento (variando de 100 ul de 1 ml, 2 ml ou mais, dependendo de quando as células de levedura necessita de ser colhido no dia seguinte). Fazer este passo para garantir que uma das culturas é o OD a 600 correcta do dia seguinte. </li></ol></li></ol> 2. colher as células de levedura <ol><li> Preparar a colheita das células de levedura. O tempo para este passo é crítico; rotular todos os tubos necessários e recolher todos os equipamentos e materiais necessários em um só lugar. Pré-aqueça um banho de água a 39 ° C e pré-aquecer dois tubos de ensaio de 15 ml do meio de crescimento a 28 ° C e a 60 ° C. NOTA: O volume do meio de crescimento de 15 ml pode ser variada, dependendo do número de pontos de tempo que as células estão a ser colhida. </li><li> Colher as células de levedura quando atingem uma DO 600 de 0,4 a 0,7. Transfer as células para 4-6 estéreis 50 ml parafuso garrafas cap. Centrifugar a 7.500 xg numa centrifugadora de alta velocidade durante 5 min à TA. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em 15 mL de meio de crescimento que foi equilibrantes, a 28 ° C. Reúnem-se os células de levedura num balão de 250 mL estéril e equilibrar-los durante ~ 5 min à temperatura de crescimento 28 ° C. </li><li> Após as células de levedura foram equilibradas à temperatura de crescimento, adicionar imediatamente os 15 ml do meio de crescimento equilibrado a 60 ° C para elevar a temperatura a 39 ° C (a temperatura não permissivas) e colocar imediatamente o frasco no banho de 39 ° C a água . Certifique-se de que o meio de cultura continua a 39 ° em banho de água C durante os passos de colheita de células restantes para assegurar que a transcrição é desligado. </li><li> Colher as células em diferentes momentos após a colocação do balão no 39 ° C banho de água. Para o primeiro ponto temporal, a colheita das células imediatamente após a colocação do balão a 39 &amp; #176; C. Colheita de uma alíquota de 3 ml e distribuir a 3 ml em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregar as células para 10 segundos em um mini centrífuga ou picofuge com rápida desaceleração e derramar o sobrenadante. </li><li> Imediatamente congelar o sedimento em um banho de gelo seco / etanol ou em azoto líquido. Designar o primeiro ponto de tempo, as células são colhidas em que o ponto de tempo zero. </li><li> Experimentalmente determinar os pontos de tempo, as células são colhidas a partir daí através de uma experiência piloto, dependendo dos mRNAs de interesse. Normalmente, as células de levedura colheita nos seguintes pontos de tempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 e 35 minutos (Figura 2B). Se a meia-vida do mRNA não pode ser determinada utilizando os pontos de tempo acima mencionados, ajustar esses pontos de tempo. Por exemplo, para os mRNAs com meias-vidas curtas antecipados, usar mais curtos vezes pontos, (ou seja, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 e 18 min) e para os mRNAs com antecipadas longas semi-vidas, estender os pontos de tempo. </li><li> Depois as células são harvested, armazená-los em um freezer -80 ° C até a extração de RNA é realizado. </li></ol> 3. Extracto de ARN a partir de células de levedura <ol><li> Para a parte de extracção de ARN do protocolo, utilizar técnicas de RNase livres para evitar a degradação do ARN por RNases. Prepare soluções livres de RNase, copos e utensílios de plástico para ser usado na extracção do ARN. </li><li> Extrai-se o ARN a partir de células de levedura de acordo com protocolos padrão. Normalmente, utilize o método de fenol quente 12. Em alternativa, utilizar kits que podem ser utilizados para extrair ARN a partir de células de levedura. </li><li> Determinar a quantidade e a pureza do RNA, normalmente através da medição da absorvância a 260 A e 280 A de 2 ul de RNA usando uma Nanodrop. Determinar a concentração do RNA a partir do A 260. Com base na concentração, dilui-se o ARN a 1 mg / mL usando água tratada com DEPC. NOTA: O rácio da A 260 / A 280 fornece informação sobre tele pureza do RNA. Uma amostra de ARN é pura, se a razão A 260 / A 280 é de 2,0 ± 0,1. </li></ol> 4. Análise de Northern Blot NOTA: Use transferências de Northern para quantificar os níveis de ARNm e obter informação sobre o tamanho dos transcritos. Além disso, utilizar transferências de Northern para detectar ARNm que produzem várias isoformas do mesmo ARNm. <ol><li> Preparar um gel de agarose-formaldeído a 1,0%. Executar quantidades iguais de ARN da amostra no gel de agarose por electroforese em formaldeído de acordo com protocolos padrão 12. Executar uma escada RNA ao lado das amostras de RNA e usá-lo para determinar os tamanhos do RNA que são detectados no blot norte. Antes de transferir o RNA separado em gel de agarose formaldeído a uma membrana, cortar a faixa com a escada de RNA a partir do gel e visualizar usando brometo de etídio. NOTA: Como alternativa, todo o gel pode ser corado com brometo de etídio antes da transferência do ARN. </li><li> AD epois de amostras de ARN a migraram até uma distância apropriada sobre o gel, a transferência do ARN para uma membrana utilizando técnicas livres de ARNase. Use um dos vários protocolos disponíveis para transferir RNA às membranas 12-13. Para transferir o ARN para uma membrana, a membrana de corte de aproximadamente o mesmo tamanho que o gel. Transferir o ARN de acordo com protocolos padrão 12. </li><li> UV cruzada ligar a RNA para a membrana utilizando um reticulador de UV seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, cozer a membrana num forno regulado para 80 ° C durante 1 h. Armazenar a membrana a -20 ° C em um saco de plástico indefinidamente até que seja hibridada com sondas específicas. NOTA: A membrana seca também pode ser armazenada à temperatura ambiente entre os papéis de filtro. </li></ol> 5. Hibridizar sondas complementares ao RNA de Interesse para o Membrane NOTA: Uma forma de detectar ARNm sobre a membrana é de hibridar 32 P sondas de ADN marcadas. CUIDADO: Researchers que trabalham com 32 P precisar usar os procedimentos de proteção para evitar a contaminação. Siga as orientações institucionais sobre o uso de material radioativo. <ol><li> Preparar a sonda de DNA por etiquetagem 25 - 50 ng de ADN para hibridar com a membrana de acordo com protocolos padrão 12. Gerar o fragmento de ADN por PCR ou digestão do plasmídeo. Determinar a actividade específica da sonda de ADN por contagem 1 ul de sonda de DNA marcado radioactivamente após os nucleótidos não incorporados são removidos 12. </li><li> Tampão de pré-hibridação / hibridação pré-aquecimento a 42 ° C. Use ~ 10 ml de tampão de pré-hibridação a / hibridação por 100 cm2 da membrana 12. </li><li> A hibridização 1-5 x 10 6 cpm de sonda de DNA marcado radioactivamente por ml de tampão de hibridação para a membrana S / N em um forno de hibridação para detectar o mRNA de interesse 12. Certifique-se de que a hibridização durante a rotação do forno de hibridação é um em que direcçãofaz com que toda a membrana a ser exposto à solução de hibridação, para assegurar a hibridação correcta. </li><li> Lava-se a membrana duas vezes à TA durante 15 min com 50 ml de 2x SSPE e uma hora a 65 ° C com 50 ml de 2x SSPE / SDS a 2% durante 15 min 12. Enrole a membrana na película de plástico para assegurar que não seque ou contaminar o ecrã de fósforo. </li><li> Utilizando um contador Geiger, estimar a intensidade de radioactividade na membrana. NOTA: Esta estimativa assegura que a membrana está exposta ao ecrã de fósforo para a quantidade apropriada de tempo. Use longos tempos de exposição para as membranas com baixas quantidades de radioatividade. </li><li> Para transferências de Northern, usar um controlo de carga para confirmar que quantidades iguais de ARN são carregados em cada local. Para fazer isso, a tira de membrana e reprobe com um ARN que não é afectado pelo processo a ser analisada. Tira a membrana, colocando-o em uma bandeja de vidro contendo 200 ml de solução de extracção de ebulição (0,1% SDS / 0,01 XSSC) durante 2 min. Despeje a solução de separação e repita o procedimento cinco vezes 12. NOTA:. Um exemplo de um ARN utilizada como um controlo de carga é SCR1 SCR1 é um transcrito de ARN polimerase III, que é estável e abundante SCR1 abundância de ARN não deve mudar significativamente durante curtos períodos de inibição da ARN-polimerase II.. </li></ol> 6. Quantificar o RNA que é ligado à membrana NOTA: Para quantificar a quantidade de radioactividade na membrana, expor a membrana de uma tela de fósforo. Após o tempo de exposição adequado, digitalizar a tela de fósforo usando um phosphorimager. <ol><li> Digitalize a tela de fósforo utilizando as instruções fornecidas pelo fabricante do phosphorimager. </li><li> Quantificar mRNA em cada ponto de tempo. Quantificar os níveis de mRNA usando software ImageQuant ou software relacionado. Normalizar o ARNm em cada ponto de tempo para o controlo de carga. Se SCR1 foi usado como o carregamentocontrole, normalizar os northerns meia-vida para SCR1. </li><li> A semi-vida do ARNm é calculado dividindo-se a quantidade restante de ARNm em cada ponto de tempo pela quantidade de ARNm presente no ponto de tempo 0 (o ponto de tempo inicial). Representar graficamente a percentagem restante em função do tempo de ARNm numa trama semi-logarítmica (Figura 2C). Calcular ARNm meias-vidas pela seguinte equação: t 1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693) </li><li> k é a inclinação da linha de melhor ajustamento e t 1/2 representa a semivida do ARNm. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

A inibição da síntese de mRNA e monitorar o volume de negócios mRNA na ausência de nova síntese é um método que é frequentemente utilizado para medir as taxas de decomposição de mRNA. Em S. cerevisiae, a medição de taxas de decaimento de ARNm, inibindo a transcrição usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II é um dos métodos mais utilizados. Este método inibe especificamente a RNA polimerase II. Os passos mais críticos para a determinação das taxas de degradação de mRNA ...

A transcrição e decadência de mRNA específicas são determinantes cruciais da expressão gênica. A taxa de síntese e decaimento do ARNm específicos determina o nível de estado estacionário de ARNm que em particular. Os níveis estáveis ​​de mRNAs governar a abundância de mRNAs e determinar quanto de cada mRNA está disponível para a síntese de proteínas. Medições de ARNm de semi-vida são usados ​​extensivamente para determinar a taxa de decomposição de mRNAs. MRNAs deterioração específica a taxas diferentes que estão relacionadas com características do ARNm, a função da proteína codificada pelo mRNA e as condições ambientais. Dependendo da técnica utilizada para determinar as taxas de decomposição de mRNA, medições da taxa de decaimento pode ser determinada globalmente ou para transcrições individuais. Na levedura S. cerevisiae, as técnicas que são mais comumente usados ​​para medir as taxas de decomposição de mRNA mundial incluem a utilização de uma cepa de levedura abrigando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II e transc químicainibidores riptional como thiolutin e 1,10-fenantrolina 1-5. Estes métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decomposição de mRNA indivíduo 4. Outros métodos também podem ser utilizados para medir as taxas de decaimento de mRNA. Estes métodos incluem a abordagem da rotulagem estado estacionário ou a utilização de moléculas de ARNm que são expressas a partir de um promotor regulado que é expresso apenas em determinadas condições. Cada uma destas técnicas tem certas vantagens e limitações. A técnica aqui descrita utiliza o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Este método utiliza S. cerevisiae como o modelo, mas podem foi modificado e utilizado em outros sistemas usando técnicas de inibição da transcrição específicos 6. mRNA medições de semi-vida utilizando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II são amplamente utilizados para ambas as medições de todo o genoma e individuais de ARNm decaimento 4-5. Esta técnica requer a utilização de uma especific a estirpe de levedura que abriga um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1 1. A justificação para esta técnica é que a exposição da estirpe de levedura sensível à temperatura para a temperatura não permissivas inibe a síntese de ARNm. Subsequentemente, decaimento do mRNA preexistentes é monitorizada em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi inibida. O desaparecimento do ARNm de pré-existentes é monitorizada através da extracção de ARN a partir de células de levedura em diferentes pontos de tempo após a transcrição foi desligado. Os pontos de tempo em que as células de levedura são colhidos são predeterminados por uma experiência piloto, e dependerá das transcrições e sistema a ser investigado. Tempos mais rápidos são utilizados para transcrições de curta duração, enquanto que os pontos de tempo mais longos são usados ​​para transcrições já viveu. Depois disso, o decaimento do mRNA é monitorizada quer por análise northern blot, PCR quantitativo ou RNAseq. A medição de mRNA de meia-vida utilizando a temperatura alelo sensível da RNA polimerase II tem as suas vantagens. Em primeiro lugar, essa técnica é fácil e direto. Em segundo lugar, uma vez que a estirpe de levedura é adquirido ou gerado no laboratório as medidas de meia-vida pode ser determinada de ARNm em diferentes condições de crescimento; permitam determinar a influência do ambiente na decadência mRNA. Em terceiro lugar, as taxas de decomposição de mRNA pode ser monitorado todo o genoma. A utilização de outras técnicas de inibição da transcrição também tem vantagens e limitações. Por exemplo, a utilização de um promotor indutível requer subclonagem para gerar um ARNm que está sob o controle do promotor regulado. Thiolutin não é prontamente disponível e é caro quando disponível. Além disso, o modo de thiolutin de acção não está completamente compreendido e tem sido relatado em afectar outros processos celulares, incluindo a inibição do decaimento do ARNm 7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, é mais prontamente disponível. Além disso, todas as técnicas utilizadas para inibir a transcrição pode pertUrb função celular e pode afetar diferentes mRNAs de maneiras distintas. Um investigador precisa determinar o método mais adequado para usar em suas condições experimentais para atingir os resultados mais fiáveis. Para determinar qual é o método mais adequado para a sua aplicação, um pesquisador precisa identificar as transcrições e função das proteínas codificadas pelas transcrições sendo investigados. As medições da taxa de decaimento mRNA mais confiáveis ​​são aqueles que são determinados utilizando várias técnicas e mostrar a mesma taxa de decaimento. Isoladamente, nenhuma técnica é sempre a melhor, e a técnica mais apropriada depende da situação específica. Numerosos estudos em S. cerevisiae mediram as taxas de decomposição de mRNA em diversas condições e origens genéticas. As condições de que as taxas de decaimento mRNA são medidos em depender da experiência específica que está sendo investigado. Medir o índice de cáries de mRNA em diferentes ambientes celulares determina se as condições de serexaminadas preferencialmente afetar as taxas de decaimento de mRNAs específicos. As taxas de decaimento de ARNm pode também variar dependendo da estirpe de levedura a ser utilizado. Por exemplo, as taxas de decaimento do mRNA pode ser determinada em células de levedura do tipo selvagem e as células de levedura com uma via de degradação do mRNA não funcional mediado por mutações nonsense (NMD). Esta via de degradação do mRNA é encontrado em todos os organismos eucarióticos que foram examinadas até agora e que desencadeia a degradação de ARNm que terminar prematuramente a tradução 8. NMD foi inicialmente identificado como um caminho que degrada mRNAs com códons de terminação prematuros ou codões sem sentido, mas agora é reconhecido como um caminho que também regula a expressão de não-nonsense contendo mRNAs naturais. mRNAs que são alvos da via são rapidamente degradados em células de levedura com uma via de NMD funcional e estabilizado em células de levedura com uma via não-funcional NMD. Deste modo, as meias-vidas de mRNAs que são alvos directos desta via são mais curtos na levedura do tipo selvagem cells em comparação com as células de levedura com uma via não-funcional NMD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA níveis de estado de equilíbrio variam dependendo das condições ambientais. A regulação dos níveis de acumulação de estado estacionário de ARNm de um garante de que a quantidade correcta de proteínas é sintetizado para as condições específicas de crescimento da célula. Uma abordagem para medir as taxas de decaimento é de ARNm inibindo a transcrição e, subsequentemente, o acompanhamento do desaparecimento do ARNm já presente. A taxa de decaimento do ARNm pode então ser quantificado, e uma meia-vida preciso pode ser determinado utilizando várias técnicas. Em S. cerevisiae, os protocolos que medem ARNm meias-vidas foram desenvolvidos e incluem inibição da transcrição de mRNA usando estirpes que abrigam um alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II, rpb1-1. Outras técnicas para a medição de ARNm de meia-vida incluem a inibição da transcrição com inibidores da transcrição, tais como thiolutin ou 1,10-fenantrolina, ou alternativamente, por utilização de mRNAs que estão sob o controlo de um promotor regulávelcomo o sistema de-off TET promotor induzido e galactose. Aqui, descrevemos a medição de S. cerevisiae taxas de decaimento de mRNA usando o alelo sensível à temperatura da RNA polimerase II. Esta técnica pode ser usada para medir as taxas de decomposição de mRNA de mRNAs individuais ou de todo o genoma.

<html> A capacidade deste protocolo para medir com precisão o índice de cáries de mRNA depende de inibição da transcrição, a colheita de células de levedura nos momentos apropriados, e utilização de RNase técnicas gratuitas durante a extração de RNA e blotting norte. Sondagem por dois mRNAs de controle conhecidos por serem instáveis ​​e estável, respectivamente, fornece confiança de que o experimento funcionou. Por exemplo, isto pode ser conseguido por sondagem com uma sonda que detecta tanto a CY...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

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Vídeo: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Monitorado Redox Titulação de cofatores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...