Discussões úteis com Isja de Feijter e Matt Baker são reconhecido agradecimento.

1. Síntese dos Sensores <ol><li> Na seção seguinte, nós fornecemos um procedimento para a conjugação de indicadores de pH de dendrímeros PAMAM. O mesmo protocolo pode ser aplicado com modificações mínimas para dendrímeros de amina alternativas de rolamento. 5,17,13,14 dendrímeros e corantes comercialmente disponíveis pode ser usada sem mais purificações. </li><li> Dissolve-se o dendrímero, em DMSO anidro (50 uM de concentração final). Prepare as soluções de 10 mM de fluoresceína-NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) em DMSO anidro. </li><li> Adicionar à solução de dendrímero a quantidade desejada de fluoresceína e TMR. A relação molar na mistura irá reflectir a quantidade de corantes carregados no dendrímero. Tipicamente, 1 mL de solução de dendrímero PAMAM G4 num tubo de microcentrífuga é feito reagir com 8 eq (40 ul) de fluoresceína e 8 eq (40 ul) de TMR. Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 12 horas. </li><li> Dilui-se a 1:10 com água desionizada e carregar a reacçãomistura em um saco de diálise (MWCO = 10 kDa). Dializar durante 24 horas contra água desionizada substituindo frequentemente a água no reservatório. </li><li> Transferir a solução para um frasco e seca por congelação durante 24 horas. Um pó de cor purpúrea deve ser obtida. Peso do sólido obtido e dissolvê-lo em água MilliQ a uma concentração final de 10 uM. Alíquota da solução e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. In Vitro medições de pH <ol><li> Para in vitro calibração preparar uma solução 500 nM de dendrímero em PBS (fosfato de 2 mM) numa cuvete de quartzo. Recomenda-se o uso de um tampão PBS muito diluídas (2 mM), para evitar alterações bruscas de pH durante a titulação. </li><li> Medir o espectro de emissão da fluoresceína (488 nm, exc) e TMR (iva de 550 nm) e optimizar as configurações ópticas do fluorímetro para conseguir uma boa relação de sinal-para-ruído. </li><li> Realizar uma titulação de pH pela adição de pequenas quantidades de NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N. Após cada adição agitar a cubapara misturar, esperar um minuto para o equilíbrio e medir o pH, por meio de um microeléctrodo de pH. Espectros de emissão de fluoresceína e TMR devem ser registradas para cada etapa, sem qualquer alteração nas configurações ópticas. </li><li> Traça-se a intensidade de fluorescência vs pH para a titulação. O sinal de rodamina não deve ser afectada pelo pH (&lt;10%). O sinal de fluoresceína deve ser uma curva sigmoidal e deve ser equipado com um modelo de ligação único com pK = 6,4. </li></ol> 3. Cultura Celular e Eletroporação <ol><li> Cultivar as células HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100 U / ml de penicilina, e 100 mg / mL de estreptomicina (Invitrogen). Manter a cultura das células a 37 ° C em atmosfera húmida 5% de CO2. </li><li> Para dendrimer eletroporação, quando as células são confluentes, remova a mídia e lavar as células usando DPBS (fosfato de Dulbecco-Buffered Saline). Remover o DPBS e adicionar tripsina-EDTA. Neutralizar o Tryppecar pela adição de meio contendo soro, mas não antibióticos. Centrifugar a 900-1,200 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente. Remova a mídia e lavar as bolinhas usando DPBS. </li><li> Contar as células e levar 4 * 10 6 células. Centrifugar a 1.200-1.500 rpm durante 2 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de tampão de formação de microporos (fornecido pelo fabricante de microporos) e transferência de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar solução aquosa de dendrímero em células ressuspensas. A quantidade de dendrímero é necessária por exemplo dependente do tipo de PAMAM (tipicamente de 250 nM para o catiónico e 2 uM de dendrímeros neutros). </li><li> Adicionar tampão de electroporação (fornecido pelo fabricante de microporos) em um tubo de formação de microporos. Pipeta as células e os dendrímeros misturas com ponta eletroporação de volume de 100 mL de tamanho. Inserir a pipeta de microporos na estação pipeta. Defina a condição de pulso para formação de microporos: Tensão de pulso = 1.005 V; wid pulsoº = 35 ms; número pulso = 2. </li><li> Após as células de transferência de impulsos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de centrífuga e as células durante 5 min a 1200 rpm para remover o excesso de dendrímero no meio. Placa 10 ml de células eletroporados Onto 35 milímetros pratos com fundo de vidro (Willco-prato GWSt-3522) com meio fresco w / o antibióticos. </li></ol> 4. Sensing pH em Viver Células HeLa <ol><li> Células de imagem com um microscópio confocal 12 horas após a eletroporação. </li><li> Conjunto de filtros padrão para fluoresceína e rodamina podem ser usados. Se os filtros são ajustáveis ​​conjunto disponível um canal verde 500-550 nm e um canal vermelho de 580 nm a 650 nm. Excitação a 488 nm é óptimo para a fluoresceína, enquanto rodamina pode ser trabalhada, quer com a 543nm ou a linha de laser 561. </li><li> Concentre-se na amostra e ajustar lasers e detectores de poder ganhar a maximizar a relação sinal-ruído. Se a electroporação foi células bem sucedidos devem ser fluorescentes brilhantes em ambos os canais. Olocalização depende do tamanho e da carga do dendrímero utilizado. Muitas vezes, algumas localizações lisossômico (pequenas vesículas perinuclear) está presente devido a endocitose ou compartimentalização. Se a localização lisossomal é predominante, isto é, a maior parte da fluorescência está localizada dentro de vesículas e sinal fraco é observado no citossol, isto significa toxicidade e medição deve ser descartado. Adquirir sequencialmente os dois canais, se necessário adquirir vários imagens e calcular a média das imagens para melhorar a qualidade da imagem. </li><li> Para braçadeira de calibração de pH celular utilizando tampões com ionóforos a pH diferente e adquirir pelo menos 20 células por pH tal como descrito acima. Para uma descrição detalhada do procedimento e da composição dos buffers consulte Bizzarri e colegas de trabalho 16. Sugerimos para medir pelo menos 5 pontos de pH = 5,5 a pH = 7,5. pH inferior a 6 são tóxicos para as células, mas tolerada para curto espaço de tempo, sugerimos a aquisição das imagens o mais rápido possível. Se as célulasdemonstrar sinais de apoptose, descartar as pilhas e reinicie. </li><li> Use ImageJ ou software similar para análise de dados. Importe as imagens do canal verde e vermelho, subtrair fundo e criar um pixel por pixel proporção de imagens com a ferramenta &quot;calculadora de Imagem&quot;. </li><li> Desenhe uma região de interesse (ROI) selecionar a célula desejada e medir a taxa de verde a vermelho-intracelular. Analisar todas as imagens adquiridas e, em seguida, traçar a proporção em relação ao pH. Na gama de 5,5-7,5 a tendência deve ser linear. O ajuste linear dos pontos obtidos dará a curva de calibração, que serão utilizados para converter proporção verde para vermelho para pH. </li><li> Quanto mais controle adquirir várias células não tratadas (não ionóforos) e tentar calcular o pH com a curva de calibração obtida. Um valor entre 7.2 e 7.4 devem ser obtido. </li></ol> 5. In Vivo Preparação da Amostra <ol><li> Os experimentos foram realizados em C57Bl/6J (machos e fêmeas), entre pós-natal day 28 e 70. Anestesiados o rato com uma injecção intraperitoneal de uretano (isto é, acetato de carbamato) (20% w / v em solução salina fisiológica, 20 mg / kg de uretano). Os animais foram sacrificados após a experiência com uma dose excessiva de uretano seguido por uma injecção intracardíaca do mesmo anestésico. </li><li> Realizar uma injecção intramuscular de fosfato sódico de dexametasona (2 mg / kg de peso corporal) para reduzir a resposta de stress cortical e edema cerebral durante a cirurgia. </li><li> Raspar a cabeça do animal e aplicar gel de lidocaína 2,5% para o couro cabeludo. </li><li> Use a tesoura para cortar o retalho de pele cobrindo o crânio de ambos os hemisférios </li><li> Lave o osso exposto com soro fisiológico e retire cuidadosamente o periósteo com a pinça. Isto irá fornecer uma base melhor para cola e cimento dental para aderir com. </li><li> Aplique uma cabeça poste de aço feitos sob medida com uma câmara de imagem central e cola-lo com cianoacrilato em um plano aproximadamente paralelo com o crânio sobre a região cortical de interest e corrigi-lo no lugar com cimento dental branco (Paladur). </li><li> Fixe a cabeça do mouse, a fim de realizar uma craniotomia de 2-3 mm de diâmetro perfurado sobre a região de interesse. </li><li> Tente minimizar o aquecimento do córtex durante a cirurgia, as lágrimas da dura-máter, ou sangramento. </li><li> Manter o córtex superfundidas com ACSF estéril (NaCl 126 mM, KCl a 3 mM, 1,2 mM, KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO4, 26 mM de NaHCO 3, 2,4 mM de CaCl2, 15 mM de glicose, HEPES 1,2 mM em H2O destilada , pH = 7,4). </li></ol> 6. imaging pH no cérebro do rato <ol><li> Durante o experimento ajuda animais respiração fornecendo O ar 2-enriquecido. O oxigénio é enriquecido até 80%. O 2 pressão parcial eo fluxo é frequentemente ajustado para obter uma ajuda de respiração adequada. Manter constante a temperatura do corpo a 37 ° C com um cobertor de aquecimento controlado de feedback. </li><li> Corrigir o animal através do poste de aço no âmbito do objectivo de um dois-fotoconfiguração de n imagens. </li><li> A fim de injectar o sensor no córtex cerebral carregar uma pipeta de vidro contendo um AgCl (ponta de 4 mm de diâmetro) com a solução de dendrímero (1 uM). O eléctrodo permitirá a gravar os potenciais de campo extracelulares. </li><li> Com uma configuração de microinjecção inserir a pipeta no córtex de aproximadamente 150 microns de dimensão. Injectar de 1-2 min a uma pressão de 0,5 psi. </li><li> Otimizar a configuração óptica para imagens. Poder do laser deve ser ajustado para minimizar a fotodegradação e fotoenvelhecimento. Normalmente potência do laser empregado é de cerca de 20 mW e ganho PMT foi mantida constante em 667 V desde calibrações anteriores mostraram que esta tensão dá a melhor relação S / N. </li><li> Para excitar o sensor de imagem a 820 nm e detectar simultaneamente a fluoresceína e rodamina fluorescência através de filtros FITC e TRITC normais. </li><li> Para o tempo de medições resolvidos adquirir séries lapso de tempo entre 2 Hz. </li><li> Para a correção de fundo adquirir um quadro escuro com a laser obturador fechado para medir o ruído térmico média resultante nas PMT eo pedestal geralmente adicionados pela eletrônica. </li><li> Para análise dos dados seguem o mesmo procedimento relatado na seção 4. </li></ol>

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	<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Toolbox+for+Assessing+Protein+Location+and+Function.">The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH.">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+imaging+using+fluorescent+dyes:+artefacts+and+limits+to+resolution.">Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).</li><li>Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Subcellular+Targeting+of+Dendrimer-Based+Fluorescent+pH+Sensors+in+Living+Cells.">Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).</li><li>Lee, C. C., MacKay, J. A., Fr&#233;chet, J. M. J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+dendrimers+for+biological+applications.">Designing dendrimers for biological applications.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).</li><li>Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+doxorubicin-functionalized+bow-tie+dendrimer+cures+mice+bearing+C-26+colon+carcinomas.">A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).</li><li>Caminade, A. -. M., Turrin, C. -. O., Majoral, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimers+and+DNA:+combinations+of+two+special+topologies+for+nanomaterials+and+biology.">Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology.</a> Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).</li><li>Rakow, N. A., Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+sensor+array+for+odour+visualization.">A colorimetric sensor array for odour visualization.</a> Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).</li><li>Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrocatalytical+properties+of+polymethylferrocenyl+dendrimers+and+their+applications+in+biosensing.">Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing.</a> Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).</li><li>Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., H&#228;gerh&#228;ll, C., Vinogradov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin+and+tetrabenzoporphyrin+dendrimers:+tunable+membrane-impermeable+fluorescent+pH+nanosensors.">Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).</li><li>Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer+internalization+and+intracellular+trafficking+in+living+cells.">Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).</li><li>Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+bioactivity+of+internally+functionalized+cationic+dendrimers+with+PEG+cores.">Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores.</a> Biomacromolecules. , (2012).</li><li>Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Functionalization+of+Dendrimers+Regulates+Internalization+and+Intracellular+Trafficking+in+Living+Cells.">Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells.</a> Bioconjugate chemistry. , (2012).</li><li>Sakadzi&#263;, S., Roussakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nature. 7 (9), 755-759 (2010).</li><li>Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+GFP-based+ratiometric+excitation+and+emission+pH+indicator+for+intracellular+studies.">Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies.</a> Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).</li><li>Albertazzi, L., Brondi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+fluorescent+indicators:+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications.</a> PloS one. 6 (12), e28450 (2011).</li><li>Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Trackable+Dendritic+Scaffolds+and+Delivery+Agents.">Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).</li><li>Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intracellular+chloride+and+pH+measurements+using+a+GFP-based+sensor.">Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor.</a> Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).</li><li>Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+Needle+in+a+Haystack:+Identification+of+EGFP+Tagged+Neurons+during+Calcium+Imaging+by+Means+of+Two-Photon+Spectral+Separation.">Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).</li><li>Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a.">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li></ol>

Padrão: Autores têm nada a revelar.

Os passos críticos para imagiologia de pH bem sucedido com sensores à base de dendrímero são: i) a selecção do andaime dendrítica correcta e o número de indicadores conjugados com ele e ii) a optimização de um protocolo de entrega do sensor nas células ou in vivo. O procedimento de síntese é relativamente fácil e pode ser aplicado virtualmente a qualquer polímero hiper-rolamento amina. Os sensores podem ser obtidos a partir de dendrímeros disponíveis comercialmente ...

O uso de moléculas fluorescentes para identificar moléculas biologicamente relevantes específicos mudou completamente a nossa forma de estudar sistemas biológicos. Widefield e microscopia confocal permitiu uma visualização em tempo real de alta resolução de processos biológicos e hoje estão entre as técnicas mais populares para estudar eventos biológicos in vitro, em células e in vivo. 1 Uma melhora significativa foi representado pelo desenvolvimento de indicadores de fluorescência , ou seja, corantes cuja fluorescência é dependente da concentração de uma entidade molecular específico. indicadores de pH e cálcio, em particular, teve um impacto dramático sobre o estudo da fisiologia da célula devido à enorme relevância de 2 + íons H + em biologia e Ca. 2,3 Entretanto, a maioria dos corantes sensíveis apresentam várias limitações intrínsecas relacionadas com a sua pequena molécula comportamento, tais como: i) dificuldades em targeti subcelularng; ii) pouca solubilidade em água e, consequentemente, pobre biocompatibilidade;. e iii) o vazamento de células e, assim, falta de capacidade de imagem de lapso de tempo longo 4 Por outro lado, o sinal de muitas sondas não pode ser corrigido para a dependência da concentração de corante (não- imagiologia raciométrica) e, por conseguinte, uma medição absoluta nas células ou in vivo, não é possível. Recentemente, descreveu um método simples e eficaz para ultrapassar estas limitações, com base na conjugação de corantes de detecção sobre um andaime de dendrímero. Cinco dendrímeros são polímeros hiper monodispersas com propriedades muito atraentes para aplicações biológicas. 6 Em particular, várias arquitecturas dendríticas têm sido desenvolvidos e utilizados para a droga 7 e entrega do gene. 8 Só muito recentemente vários grupos começaram a explorar o potencial dessas moléculas como suporte para dispositivos de detecção. 9,10,11 Anteriormentedescrita uma via de síntese simples para a funcionalização de poliamidoamina (PAMAM) diferentes suportes com base em ésteres de NHS-activada. Conjugados 12 pode ser obtido num único passo, por meio de diálise como a purificação. Curiosamente, este método pode ser facilmente aplicado a uma variedade de suportes poliméricos ou dendríticas. 13,14 Para alcançar os dendrímeros de imagem raciométrica foram duplamente marcado com dois conjuntos de corantes: i) um indicador de pH (ou seja, a fluoresceína) e ii) uma porção fluorescente independente do pH (ou seja, a rodamina). Isto permitiu-nos realizar imagem pH preciso como o rácio entre a fluoresceína e rodamina é só dependente do pH e não mais sobre a concentração da sonda. Outra abordagem interessante para esta questão é representado pelo uso de sondas à base de toda a vida 15. À medida que a vida não depende de concentração da sonda essas medidas não precisam de uma correção radiométrica. No entanto, lifmedições Etime requerem uma configuração instrumental mais complicado e sua resolução temporal é sub-ótima para processos fisiológicos rápidos, o que limita as suas aplicações potenciais. A fim de executar imagiologia intracelular, a sonda tem de ser entregue através da membrana plasmática para o citoplasma. Como os dendrímeros não são membrana permeável devido ao seu tamanho e hidrofilicidade, a entrega intracelular pode ser conseguida por meio de electroporação. Por meio desta técnica, amplamente utilizados em biologia, para a transfecção, as macromoléculas marcadas podem ser eficazmente entregues nas células para realizar imagem de alta qualidade. Além disso, com a electroporação as complicações relacionadas com a dendrímero endocitose pode ser evitado que as macromoléculas são entregues directamente para o citoplasma. Curiosamente após eletroporação diferentes dendrímeros mostra localizações distintas no interior das células, mesmo em ausência de qualquer seqüência de alvos específicos. 5 Este passive direccionamento, apenas devido às propriedades físico-químicas do dendrímero, pode ser explorado para atingir o pH de imagem específicos de organelos. Imagiologia Raciometrico pode ser realizado utilizando microscopia confocal. A fluoresceína e rodamina, covalentemente conjugado com o andaime dendrítica, foram separadamente trabalhada e um pixel-a-pixel proporção mapa foi criado. Vários procedimentos para controlar o pH intracelular em células vivas por meio de ionóforos foram relatados. Os ionóforos são pequenas moléculas hidrófobas capazes de transportar iões através da membrana plasmática; ionóforos de iões H +, tais como nigericina, estão disponíveis e podem ser utilizadas para calibrar os sensores baseados em dendrímero 16 Estas medições revelaram uma resposta linear ao pH de forma semelhante ao que foi descrito. in vitro. Na base do pH intracelular de calibração pode ser medido com precisão. Estas medições demonstraram que o sensor baseado em dendrímero pode ser uma ferramenta valiosa no estudo H + homeostasis em células vivas e processos patológicos que envolvem falhas de regulação de pH. Recentemente, demonstrou que os sensores de pH à base de dendrímero também pode ser aplicada, in vivo, a realização de imagens de pH no cérebro de ratos anestesiados. 17 Devido ao ambiente complexo de tecidos vivos de elevada qualidade na detecção in vivo é tecnicamente exigente. Aqui nós mostramos uma descrição detalhada do procedimento experimental para a imagem in vivo pH com ênfase das questões cruciais a serem abordados para realizar uma imagem pH precisas no cérebro. Microscopia de dois fótons tem sido empregada por duas razões principais: i) o uso de luz infravermelha permite superar a falta de penetração nos tecidos da microscopia confocal padrão; ii) a ampla absorção de dois fótons de fluoresceína e rodamina permitir a sua excitação simultânea evitando a complicações relacionadas com o uso de dois comprimentos de onda para excitação. medições de pH no cérebro de camundongos foramrealizado com sucesso; sensores prontamente responder à hipóxia induzir mudança de pH no espaço extracelular cerebral. Estas medições demonstram que os indicadores baseados dendrímero pode ser utilizado com êxito para destacar as alterações fisiológicas e patológicas do pH in vivo num modelo animal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

O desenvolvimento de indicadores fluorescentes representado uma revolução para as ciências da vida. Geneticamente codificados e fluoróforos sintéticos com capacidade de sensoriamento permitiu a visualização de espécies biologicamente relevantes com alta resolução espacial e temporal. Os corantes sintéticos são de particular interesse, graças à sua alta tunability e da ampla gama de analitos mensuráveis. No entanto, estas moléculas sofrem várias limitações relacionadas com a pequena molécula de comportamento (baixa solubilidade, as dificuldades de segmentação, muitas vezes não há imagem raciométrica permitido). Neste trabalho, introduzir o desenvolvimento de sensores baseados em dendrímero e apresentar um processo para a medição do pH in vitro, em células vivas e in vivo. Nós escolhemos dendrímeros como plataforma ideal para os nossos sensores para suas muitas propriedades desejáveis ​​(monodispersity, propriedades ajustáveis, multivalência) que lhes um andaime amplamente utilizado por vários dispositivos biomédicos feitas. A conjugação de pH fluorescenteindicadores para o cadafalso dendrimer levou a um aprimoramento de suas performances de detecção. Em particular dendrímeros exposição reduzido vazamento celular, melhor direcionamento intracelular e permitir medições raciométrica. Estes novos sensores foram utilizados com sucesso para medir o pH em células HeLa vivo e in vivo em cérebro de ratinho.

A Figura 1 mostra uma representação esquemática da conjugação de corantes para detectar diferentes andaimes dendríticas. Os indicadores resultantes podem ser obtidos num passo sintético fácil a partir de produtos disponíveis comercialmente. Os dendrímeros de rolamento-amina reagem com corantes NHS-activada em DMSO e purificada por meio de diálise. Este procedimento geral já foi usado com sucesso para a rotulagem de vários dendrímeros: i) geração dendrímero PAMAM 2, 4 e 6; 12 ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção.

Síntese, Entrega Celular e<em&gt; In vivo</em&gt; Aplicação de sensores de pH à base de Dendrímero

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K visualizações.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR.  Sensores de fluorescência são ferramentas poderosas nas ciências da vida. Aqui, descrevemos um método para sintetizar e utilizar os sensores fluorescentes baseados em dendrímero para medir o pH em células vivas e in vivo. O andaime dendríticas aumenta as propriedades de corantes fluorescentes conjugados levando a melhores propriedades de detecção. 

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Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

Síntese de hipervalente iodónio Alquinilo triflatos de Aplicação de Geração Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Química

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Avaliação do dopado com boro Diamante Eletrodo de Qualidade e Aplicação de<em&gt; In Situ</em&gt; A modificação de pH local pela eletrólise da água

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Síntese e esfoliação da discotic Zircônio Fosfatos obter cristais coloidais líquidos

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de agentes de contraste à base de dendrímeros para Ressonância Magnética

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

Síntese de Core-shell Lanthanide dopados com nanocristais de Upconversion para aplicativos de celulares

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Um método de síntese rápida para Au, Pd e Pt Aerogels através de redução direta baseada em solução

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Síntese de elastômeros de silicone macio-ureia para aplicação de lente intra-ocular

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Síntese de Nanopartículas de ouro modificada Aptamer-PEI-g-PEG carregadas com doxorubicina para entrega de drogas direcionadas

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...