Agradecemos Osman Kaftanoglu para o conselho útil e assistência durante as filmagens. Gostaríamos de agradecer aos revisores anônimos pelos comentários perspicazes. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega (concede 180504, 191699, 213976 e), Marie Curie/FP7 (ref projeto. 238665), o Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA concessão P01 AG22500) e Pew Charitable Trusts.

1. A dissociação Senescence de idade cronológica Esta seção descreve a instalação de colônias de coorte duplas, que consistem em um grupo de indivíduos identificados que compartilham a mesma idade cronológica (&quot;faixa etária single&quot;) e um grupo de abelhas ninho. Indivíduos com Mesmas do único grupo etário acabará por separar-se em diferentes tipos de trabalho com diferentes dinâmicas de envelhecimento - estas são as abelhas enfermeira com abelhas diminuiu e forrageiras com declínio funcional acelerado. Todos os procedimentos são descritos de uma colónia experimental. Aconselhamos, no entanto, para realizar experimentos, pelo menos, dois colônia replica para que os efeitos da colônia pode ser controlado por (-design-dois repetição). <ol><li> Preparar caixas de colméia para as colônias duplas de coorte: Prepare uma caixa normal colméia que recebe dois pentes de alimentos com mel, outro pente de alimentos com o pólen, e dois pentes vazios. Certifique-se de localizar uma rainha acasalou, bem como uma colônia de doadores com mais de 3.000abelhas ninho. Ambos serão introduzidos mais tarde (1.3). </li><li> Obtenção e marcação indivíduos com idade cronológica semelhante: Colete favos com criação selada que está prestes a emergir. Para uma réplica esperar para coletar pentes com um total de 3.000-5.000 células de cria tampado. Para cada replicar usar uma quantidade equilibrada de ninhada de pelo menos três fontes diferentes de colméia para evitar distribuição heterogênea de genótipos maternos (origem colméia). <ol><li> Coloque favos numa incubadora a 34 ° C, com 60-70% de humidade relativa. Certifique-se de armazenar pentes de tal forma que a ninhada emergente não pode escapar. </li><li> Vamos abelhas surgir por dois dias e marcar essas abelhas com uma pequena tag pintura no tórax (por exemplo Uni Posca, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). A marca de tinta vai permitir identificar as abelhas da faixa etária única (dia da emergência), e para distingui-las de outras colônias idênticas. </li></ol></li><li> Configurar uma colônia coorte duplo, que inclui o grupo de identified, abelhas idade único: No dia abelhas jovens foram marcados, coletar cerca de 2.500-3.000 abelhas ninho de uma colônia de doadores (compare seção 1 em Discussão.), e adicionar essas abelhas não marcado para a caixa de colméia que foi preparado antes (ver Passo 1.1). As últimas pessoas vão constituir a não identificado ninho de abelha coorte. <ol><li> Adicionar a rainha, o que será inicialmente confinado a uma gaiola rainha (disponível comercialmente). Selar a gaiola com doces comestíveis (por exemplo Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Alemanha) para fazer abelhas operárias liberam lentamente a rainha. </li><li> Adicione as abelhas recém-emergidas e marcados, que constituirão o único grupo etário. Essas abelhas são os indivíduos apenas marcadas, e são o grupo de foco para todas as etapas a seguir. </li></ol></li><li> Monitoramento forrageamento início e marcação forrageiras: Avaliar aparecimento e dinâmica da transição enfermeira-forager na única faixa etária, acompanhar o desenvolvimento demográfico da atividade de forrageamento emuito outro dia para cada colônia. Comece contando cinco dias após as colónias foram estabelecidas (Figura 1). <ol><li> Contar o número total de abelhas que retornam de forrageamento vôos (contagens de entrada) dentro de 3 x 20 min períodos de observação em horários fixos. Certifique-se de não contar abelhas durante os períodos de vôos de orientação (ver Discussão). </li><li> Quando a contagem de entrada indicam atividade de forrageamento considerável para começar (&gt; 100 contagens de entrada / dia), iniciar a marcação forrageiras. Para fazê-lo, Forrageiras da coorte de idade único (indivíduos marcados individuais) receber uma segunda marca de tinta em cima do retorno de seus primeiros vôos de forrageamento. Esta marca de tinta vai especificar o dia de início de forrageamento, e permitirá identificar mais tarde a idade de forrageamento para cada forrageira. </li><li> Repetir marcações diárias até que um número suficiente de abelhas tem sido marcado. Para estimar um número suficiente de forrageiras marcadas, esperar uma taxa de recuperação de não mais de 5-10% após estas abelhas foram idade, geralmente após 14 dias deforrageamento. </li></ol></li><li> Amostragem: Uma vez que todas as abelhas inicialmente marcadas têm uma idade cronológica semelhante, os grupos pareados por idade dos enfermeiros e forrageiras antigos podem ser coletados simultaneamente, quando forrageiras têm forragearam por ≥ 14 dias. <ol><li> Abelhas Solteiro enfermeira marcados são coletadas dentro da colméia, e são identificados pelo comportamento de enfermagem (alimentação e limpeza de larvas com cabeças de colocar para baixo em células de cria abertas). </li><li> Duplo forrageiras marcadas também são coletadas dentro da colméia antes do início da atividade diária de forrageamento. </li><li> Colete as abelhas em gaiolas (tubos, caixas) que fornecem ventilação suficiente, e manter escuro até posterior processamento. Alternativamente, para transcriptomic, epigenética ou estudos de proteômica, encaixe diretamente abelhas congelamento em nitrogênio líquido. Colete números equilibrados de indivíduos de todos os grupos de teste e replicar colônias. </li></ol></li></ol> 2. Reversão dos Trabalhadores com rápida para Trabalhadores com o envelhecimento retardado por mudança da Hive Demografia &lt;/ P&gt; Esta seção detalha como a reversão de trabalhadores com envelhecimento acelerado (forrageiras) aos trabalhadores com o envelhecimento retardado (abelhas enfermeira) é executada. Tal inversão de comportamento é induzido, quando forrageiras experimentar uma falta de abelhas enfermeira, que normalmente se envolver nos cuidados ninhada. O procedimento de reversão irá separar uma única colônia replicar-se em duas seções: uma colméia com a fração enfermeira abelha (&quot;enfermeira-derivado&quot;), e outro com a fração forager (&quot;forager derivados&quot;). Após a reversão bem sucedida, possíveis sintomas de plástico e envelhecimento revertido pode ser estudado na faixa etária única com os trabalhadores revertidos, Forrageiras continuada, continuando abelhas enfermagem e forrageiras recrutados. Como antes, as abelhas identificadas da faixa etária única, e não o grupo de abelhas ninho não identificados, constituem o grupo focal experimental. <ol><li> Preparação: Replicar colmeias com enfermeiros (único marcado) e forrageiras (duplo marcado) são disponibilizados conforme descrito na seção anterior. Certifique-se de não começar a reversão com menos de 500 forrageiras marcadas por repetição colônia para garantir a recuperação suficiente após a reversão foi concluída. <ol><li> Para a identificação segura de grupos de teste após a reversão, é fundamental que toda a população forrageira na colméia original foi marcado antes de reversão. O procedimento a seguir é descrito por uma réplica. </li><li> Um dia antes de reversão, preparar uma caixa colméia adicional para a colmeia derivados de forager (veja o passo 1.1). Localize duas rainhas e dois favos de colmeia doadores. Antes da transferência para as colônias experimentais afastar todas as abelhas adultas destes pentes. Uma rainha enjaulado (veja o passo 1.3) e um pente ninhada irá substituir rainha e favos de cria na caixa de colméia de origem. O outro conjunto de rainha e ninhada pente será utilizado no dia seguinte para a nova caixa de colméia. Similar alocação de novos favos de cria e rainhas alienígenas para ambos, o original ea nova colméia é aconselhável ter certeza de que forrageiras separados e enfermeiras vai igualmente experiência mudou pistas Hive (&quot;cheiro colméia&quot;). </li></ol></li><li> Reversão: Na parte da manhã, pouco antes da reversão, adicione a rainha enjaulado e favos de cria para a nova caixa que receberá a fração proveniente-forager. Aguarde até que o horário de pico de forrageamento começa. Em seguida, passar a colônia original com forrageiras marcadas e abelhas enfermeira pelo menos 100 m de distância do local original. <ol><li> No local original, configure a nova caixa para a colmeia derivados de forager com ninhada e só rainha. </li><li> Foragers vai deixar a caixa de colméia originais deslocado, e volte para o local original. Permitir forrageiras para voltar à posição original, durante 2 horas, a fim de alcançar a seguinte para completar a separação da população forrageira de abelhas do ninho. </li><li> Então, para finalizar a separação, fechar o original, agora &quot;enfermeira-derivada&quot; colméia, e transferi-lo para um apiário pelo menos 3 km. </li></ol></li><li> Hive manutenção e monitoramento de tarefa social bem-sucedidainversão: Verifique as colméias experimentais regularmente para saudável, ninhada aberto. <ol><li> Durante os primeiros dias após a manipulação colônia substituir ninhada autônoma e morto para reduzir a carga potencial patógeno. </li><li> Para validar a reversão bem sucedida dentro da colméia derivados de saqueadores, tirar fotos de favos de cria antes da sua introdução, e novamente quando pentes são substituídos ou quando o experimento de reversão estiver concluído (Figura 2). Áreas com ninhada anteriormente não nivelada e com aberto, ninhada ao vivo são marcadores confiáveis ​​de atividade de enfermagem nas colônias derivadas de forrageiras. </li></ol></li><li> Amostragem: Efeitos fisiológicos que acompanham inversão social, pode ser detectado 3-8 dias depois de forrageiras e enfermeiros foram separados. <ol><li> Aconselhamos amostragem todos os grupos de teste, ou seja, os trabalhadores revertidos e forrageiras continuadas (colmeia derivados de forager), bem como contínuas enfermeiros e forrageiras recém-recrutados (colmeia derivados de enfermeira) 8 dias após a reversão é iniciado. </li><li> ColLECT amostras, conforme descrito no passo 1.5. </li></ol></li></ol> 3. Analisando Trabalhador tipo Padrões Senescência celular específica pela quantificação de lipofuscina A lipofuscina é um biomarcador universal de senescência celular. Como uma intrínseca acúmulo do produto, autofluorescência específico de lipofuscina (emissão máxima = 530-650 nm) pode ser usado para a detecção de 18. <ol><li> Dissecção e fixação: abelhas Frio no gelo até imóvel; remover e dissecar a amostra de tecido desejado. <ol><li> Transferir para o fixador (4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino, PBS, pH 7,2) por incubação durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar as amostras 3 vezes com PBS. </li></ol></li><li> Processamento de tecidos e montagem: Corte amostras de tecido em seções com mais de 40 m de espessura, por exemplo, utilizando um micrótomo lâmina vibrando, por exemplo, Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemanha). <ol><li&gt; Para compensação, incubar cortes de tecido durante a noite em 30% de glicerol (PBS), e outra de 2 horas em 50% de glicerol (PBS). </li><li> Monte seções sobre lâminas microscópicas em 50% de glicerol (PBS). Para vedação de armazenamento a longo prazo lamínulas com unha polonês. </li></ol></li><li> A aquisição de imagens: Para detectar lipofuscina, sugerimos o uso de um microscópio confocal de varredura a laser que fornece linhas de laser com λ = 514, 561nm ou similar para a excitação, e com a largura de banda detector ajustado para 570-650 nm. <ol><li> Para uma melhor identificação de lipofuscina, incluir um segundo canal e fazer uma varredura simultânea em espectros menor comprimento de onda (excitação = 405 nm; emissão = 410-450 nm). O canal de comprimento de onda mais longo irá revelar tanto, lipofuscina granular, mas também não específica &quot;amarelo&quot; devido a traquéia autofluorescent e outras estruturas não-granulares. O segundo, mais curto canal de comprimento de onda só vai revelar autofluorescência inespecífico, mas não lipofuscina. Assim, a identificação de lipofuscina pode ser faci<html> tated comparando os sinais de ambos os canais, sendo que apenas um deles revelando os grânulos com fluorescência específica lipofuscina. </li><li> Para a aquisição de imagens de alta resolução usar uma objetiva com ampliação de 40X ou superior, e de preferência uma abertura numérica de 1,25 ou superior. Digitalizar imagem empilhamentos com dimensões de cerca de 100 x 100 x 10 m 3. Cada amostra individual e tecido tem que ser representado por várias pilhas de imagens. </li><li> Para reduzir a variação intra-individual e inter-individual causado pela variação técnica, sempre manter a potência do laser e constante sensibilidade do detector. </li><li> Para reduzir o viés por dia a dia variações técnicas analisar números de amostras iguais de todos os grupos de teste em cada uma das várias sessões de digitalização. </li></ol></li><li> Processamento de imagem: Use pacotes de software com módulos que permitem o processamento avançado de pilhas de imagens microscópicas, por exemplo ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA dos Estados Unidos,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Gerar uma máxima projecção 2D de cada uma das pilhas de imagens em 3D. </li><li> Aplicar um filtro de Gauss com um tamanho modesto do kernel, a fim de atenuar o ruído de alta freqüência, e para preservar as estruturas com dimensões de grânulos de lipofuscina. </li><li> Mesclar os dois canais de cores para facilitar a identificação de lipofuscina (veja o passo 3.2). </li></ol></li><li> Analisa Image: Certifique-se de que o sujeito executar os passos de quantificação será cego para testar a identidade do grupo. <ol><li> Para todas as imagens, primeiro seleccionar uma região de interesse (ROI) que cobre as estruturas relevantes, e tem dimensões semelhantes às da ROI a partir de outras imagens. </li><li> Em seguida, selecione o número desejado de grânulos de lipofuscina que representam cada ROI. Ao selecionar grânulos de lipofuscina dentro de uma ROI, a aplicação das seguintes regras vão reduzir o viés subjetivo. <ol><li> Escolha um local consistente para a seleção do primeiro granule. Este pode ser, por exemplo, a aresta mais à esquerda de uma ROI, e o grânulo que está mais próxima da aresta será sempre a primeira selecção. </li><li> Um após o outro, os grânulos são escolhidos que estão mais próximos da seleção anterior (vizinho). </li><li> Ao escolher o próximo vizinho, mover-se apenas em uma direção, por exemplo, pesquisar apenas o direito da seleção anterior. Esta regra impede que a seleção é dominada por grupos ocasionais de grânulos densamente. </li><li> Quando a seleção estiver completa, avaliar o tamanho de cada partícula de lipofuscina, destacando e medir a respectiva área de grânulos. Use testes estatísticos apropriados para comparar indivíduos dos diferentes grupos de teste. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

Nós aqui adotar previamente descrita aproxima 8,16,17,19,20, e integrá-los em um único fluxo de trabalho que irá facilitar a estudar o envelhecimento flexível em abelhas. Nosso objetivo é fornecer aos cientistas que são novatos neste campo com uma ferramenta padronizada definida para obter material de amostra relevante, e para melhorar a reprodutibilidade experimental entre as diferentes equipas de investigação. Enquanto os nossos procedimentos são simplificados e não requerem equipamento especial,...

As estruturas complexas colônia de animais altamente sociais são mantidas através da interação de uma casta reprodutiva e uma casta de ajudante tipicamente trabalhadores não-reprodutores com diferentes comportamentos de tarefa social. Nos diferentes trabalhadores, adaptações fisiológicas específicas permitir comportamentos de cuidados sib distintos, e também estão ligados às diferenças tempo de vida extremas. As abelhas e os ratos-toupeira representam os modelos animais mais bem desenvolvidos para estudar como a sociabilidade está ligada a padrões de aceleração, insignificante ou revertida envelhecimento 1-3. Em colônias de abelhas, uma única rainha de postura é assistido por milhares de trabalhadores que tendem a ninhada, forragem para alimentar, e se envolver em guarda, termorregulação ou comportamentos de higiene 4. Entre esses trabalhadores são as forrageiras extremamente curta duração, abelhas enfermeira com intermediário, e de inverno (diutinus) abelhas com longos tempos de vida. Os indivíduos, no entanto, não são permanentemente ligado a uma certa wotipo rker, mas exibir uma ontogenia comportamental flexível: eles mudam de um comportamento tarefa social para outro (&quot;castas temporais&quot;). Abelhas Callow pode mudar a ninhada tendendo abelhas enfermeira, que eventualmente pode mudar para forrageamento fora. No entanto, as abelhas ninho inexperiente também pode se transformar em abelhas de inverno de vida mais longa, e forrageiras de curta duração pode até mesmo reverter em enfermeiros tipicamente de vida mais longa. Trabalhadores com extrema (abelhas de inverno) e intermediário (abelhas enfermagem) têm vida útil bem desenvolvido de produção e armazenamento de alimentos órgãos com recursos abundantes - ao contrário de forrageiras de curta duração (revisada em 1,5). No entanto, que a regulação da vida indivíduo vai além simples mudanças no equilíbrio dos recursos de um indivíduo é sugerida por pesquisas sobre uma proteína da gema, que tem diversas funções adaptadas na casta trabalhador não-reprodução, tais como a produção de geléia 6, controle hormonal 7, imune 8 e anti-oxidante de defesa 9. Padrões de fdeclínio unctional (senescência) disparidades espelho expectativa de vida entre os trabalhadores, estabelecido para olfativo, e também para outras funções motoras do cérebro ou 10-13. Especificamente, a redução significativa da função de aprendizagem após apenas duas semanas de procura de alimentos corresponde a uma progressão de mortalidade semelhante em forrageiras 14, ao contrário da falta de redução detectável (senescência negligenciável) em abelhas de longa vida de inverno 15. Para identificar as impressões digitais moleculares do envelhecimento flexível adaptamos paradigmas experimentais estabelecidas que permitem monitorar e manipular transições do tipo de envelhecimento 8,16,17. Experimento 1 detalhes como obter amostras em que os efeitos da idade cronológica e comportamentos sociais específicos do tipo trabalhador sobre o envelhecimento podem ser separadas. Experimento 2 descreve a reversão de forrageiras com acelerados em abelhas enfermeira com dinâmica de envelhecimento mais lento. Experimento 3 fornece uma abordagem para efeitos da senescência celular sondagem por anatomical quantificação de um biomarcador estabelecido para o envelhecimento celular (lipofuscina) 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apifonda</td>
 <td>S&uuml;dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>phosphate-buffered saline</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.04094.1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

obtaining specimens with slowed, accelerated and reversed aging in the honey bee model

Sociedades de animais altamente sociais apresentam grandes diferenças expectativa de vida entre os indivíduos intimamente relacionados. Entre os insetos sociais, a abelha é o melhor modelo estabelecido para estudar como plasticidade na expectativa de vida e envelhecimento é explicado por fatores sociais. A casta dos trabalhadores das abelhas inclui abelhas enfermeira, que tendem a ninhada, e as abelhas forrageiras, que coletam néctar e pólen. Os trabalhos anteriores mostraram que as funções cerebrais e desempenho de vôo senesce mais rapidamente em forrageiras que em enfermeiros. No entanto, as funções do cérebro pode se recuperar, quando forrageiras voltar às tarefas de enfermagem. Tais padrões de senescência funcional acelerada e reverteu estão ligadas a níveis alterados de recursos metabólicos, a alterações na abundância de proteínas e função imunológica. Vitelogenina, uma proteína da gema com funções adaptadas no controle hormonal e de defesa celular, pode servir como um importante elemento regulador em uma rede que controla as diferentes dinâmicas de envelhecimento em trabalhadores. Aqui nós descrevemos como o surgimento de enfermeiros e forrageiras podem ser monitorados, e manipulado, incluindo a reversão de forrageiras geralmente de curta duração para os enfermeiros de vida mais longa. Nossos resultados representativos mostram como indivíduos com idade cronológica semelhante diferenciar em forrageiras e abelhas de enfermagem em condições experimentais. Nós exemplificar como reversão do comportamento de forrageiras de volta para enfermeiros pode ser validado. Por último, que mostram como diferentes senescência celular pode ser avaliada pela medição da acumulação de lipofuscina, um biomarcador universal de senescência. Para estudar os mecanismos que podem ligar as influências sociais e envelhecimento plasticidade, este protocolo fornece uma ferramenta padronizada definida para adquirir material de amostra relevante, e para melhorar a comparabilidade dos dados entre os estudos futuros.

Seções 1 e 2 do Protocolo de detalhes como grupos de teste pode ser obtido para estudar atributos acelerado, desacelerou e inverteu o envelhecimento em colônias com uma única faixa etária. Para monitorar o tipo de trabalhador diferenciação que acompanha a ontogenia normal, avaliada a contagem de forrageiras (&quot;contagens de entrada&quot;) por 6 colônias (Figura 1, comparar seção 1). Os gráficos mostram que a mudança considerável de enfermeira para o estado forager geralmente não é obse...

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Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Em trabalhadores da abelha do mel, o envelhecimento depende de comportamentos sociais, em vez de idade cronológica. Aqui nós mostramos como trabalhador-tipos com padrões muito diferentes de envelhecimento podem ser obtidas e analisadas para a senescência celular.

Obtenção de amostras com retardado, acelerado e invertida Envelhecimento no Modelo Bee Mel

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences.  Em trabalhadores da abelha do mel, o envelhecimento depende de comportamentos sociais, em vez de idade cronológica. Aqui nós mostramos como trabalhador-tipos com padrões muito diferentes de envelhecimento podem ser obtidas e analisadas para a senescência celular. 

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In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imagem de Neurônios Corpo Mushroom durante o aprendizado olfativo no Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Biologia

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizar o coração batendo no Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Métodos para comparar Nutrientes na beebread Feito por africanizadas e mel europeu abelhas e os efeitos sobre Títulos Hemolinfa Proteína

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissecção e Observação de Honey Bee Dorsal navio de Estudos da função cardíaca

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Monitoramento de nível de colônia os efeitos da exposição de pesticidas subletais em mel de abelhas

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Uma armadilha de pólen impresso em 3D para entradas de colmeias de abelhas bumble(Bombus)

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate pesticide exposure of bees via pollen. Described herein is an effective pollen-trapping method for collecting corbicular pollen from honey bees returning to their hives. This collection method results in large quantities of corbicular pollen that can be used for research purposes. Honey bees collect pollen from many plant species, but typically visit one species during each collection trip. Therefore, each corbicular pollen pellet predominantly represents one plant species, and each pollen pellet can be described by color. This allows the sorting of samples of corbicular pollen by color to segregate plant sources. Researchers can further classify corbicular pollen by analyzing the morphology of acetolyzed pollen grains for taxonomic identification. These methods are commonly used in studies related to pollinators such as pollination efficiency, pollinator foraging dynamics, diet quality, and diversity. Detailed methodologies are presented for collecting corbicular pollen using pollen traps, sorting pollen by color, and acetolyzing pollen grains. Also presented are results pertaining to the frequency of pellet colors and taxa of corbicular pollen collected from honey bees in five different cropping systems.

We describe methods for collecting corbicular pollen from honey bees as well as protocols for color sorting, acetolysis, and microscope slide preparation of pollen for taxonomic identification. In addition, we present pellet color and taxonomic diversity of corbicular pollen collected from five cropping systems using pollen traps.

Coleta e Identificação de Pólen das Colônias de Abelhas

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...