Os autores agradecem à Sra. Lourdes Carreon G Tan por sua ajuda na criação de peixes. Este trabalho foi financiado pela NMBU, Grants-in-Aid da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e bolsa para Projetos básicos de Pesquisa científica da Fundação Sumitomo para S.K.

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305).
NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por distinguir as características sexuais secundárias, como o tamanho e a forma da barbatana dorsal e anal, conforme descrito em42,47.
1. Preparação de instrumentos e soluções
<ol><li>Prepare a solução de estoque anestésico (0,6% Tricaine).<ol>
<li>Diluir 0,6 g de Tricaine (MS-222) em 100 mL de 10x Phosphate Buffer Saline (PBS).</li>
		<li>Distribua 1 mL da solução de estoque tricaine em vários tubos plásticos de 1,5 mL e armazene a -20 °C até usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a água de recuperação (solução nacl de 0,9%) adicionando 18 g de NaCl em 2 L de água de aquário. Armazene a solução em temperatura ambiente até o uso.</li>
	<li>Prepare as ferramentas de incisão quebrando uma navalha na diagonal para obter um ponto afiado(Figura 1A).</li>
	<li>Prepare a solução anticogulante sanguínea (0,05 U/μL de heparina de sódio) diluindo 25 μL de heparina de sódio em 500 μL de 1x PBS. Armazene a solução anticopante a 4 °C até usar.</li>
	<li>Prepare duas agulhas de vidro de um capilar de vidro de 90 mm de comprimento puxando um capilar de vidro com um puxador de agulha(Figura 1B) seguindo as instruções do fabricante. NOTA: O diâmetro externo da agulha de vidro é de 1 mm, enquanto o diâmetro interno é de 0,6 mm.</li>
	<li>Prepare uma tampa de tubo plástico de 1,5 mL cortando a tampa e faça um orifício que se encaixe com o diâmetro externo da agulha(Figura 1C). Para fazer o orifício, aqueça uma extremidade do capilar de vidro de 9 mm e esfaqueie o capilar de vidro aquecido através da tampa. Alternativamente, use uma agulha para furar a tampa até que o diâmetro do orifício se encaixe com o capilar de vidro de 9 mm.</li>
</ol>2. Procedimento de gonadectomia
<ol><li>Prepare 0,02% da solução anestésico diluindo um tubo de estoque tricaine (0,6%) em 30 mL de água do aquário.</li>
	<li>Prepare ferramentas de dissecção, incluindo um ultra-fino e dois fórceps finos (um com ponta relativamente larga), tesoura pequena, fio de nylon e navalha como descrito na etapa 1.3.</li>
	<li>Anestesiar o peixe colocando-o na solução anestésico de 0,02% por 30-60 segundos. NOTA: A duração da anestesia depende do tamanho e peso do peixe e deve ser adaptada. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, o corpo do peixe pode ser perfeitamente beliscado usando fórceps. Se o peixe não reagir, a gonadectomia pode ser iniciada.</li>
	<li>Retire o peixe da solução anestésico e coloque o peixe horizontalmente de lado, fora d'água sob um microscópio de dissecção.</li>
	<li>Ovaectomia (OVX) em fêmeas<ol>
<li>Remova os ovos ovipositados (ovos pendurados fora do corpo feminino) se houver e raspe as escamas na área de incisão(Figura 2A).</li>
		<li>Faça delicadamente uma incisão de cerca de 2-2,5 mm de comprimento entre as costelas, entre as aletas pélvicas e anais(Figura 2A),utilizando a lâmina de barbear. Em seguida, belisque suavemente o abdômen do peixe enquanto tira os ovários pouco a pouco usando fórceps finos com ponta larga.</li>
		<li>Corte a extremidade dos ovários usando fórceps finos e coloque os ovários de lado(Figura 2B). NOTA: Tome cuidado para não quebrar o saco ovariano, se possível. Se o saco ovariano estiver quebrado, remova qualquer traço de gônada o mais completamente possível sem deixar nenhum óvulo não ovulado.</li>
	</ol></li>
	<li>Orquídea em machos<ol>
<li>Faça suavemente uma incisão entre as costelas acima do ânus(Figura 2A),e abra a incisão lentamente usando fórceps finos.</li>
		<li>Pegue suavemente os testículos usando os fórceps finos e lentamente retire os testículos. Depois, corte a extremidade dos testículos para remover completamente os testículos(Figura 2B). Para orquídeas machos, todas as preparações são semelhantes às das fêmeas até a parte da incisão. Ao pegar os testículos, às vezes a gordura que se assemelha aos testículos é obtida. No entanto, após a restauração da gordura, é possível tentar encontrar os testículos novamente(Figura 2B). NOTA: Tanto para homens quanto para fêmeas, é importante minimizar o tamanho da incisão no abdômen para evitar danos excessivos que possam levar à mortalidade. Às vezes, os intestinos também podem aparecer através da incisão junto com as gônadas, por isso certifique-se de que elas sejam devidamente devolvidas dentro da incisão antes do fechamento. O conhecimento prévio sobre ovários e localização de testículos no abdômen medaka é essencial.</li>
	</ol></li>
	<li>Sutura a incisão da mesma forma em machos e fêmeas(Figura 3).<ol>
<li>Coloque a linha de nylon ao lado da área de incisão e esfaqueie a pele do lado direito da incisão através da cavidade interna do corpo usando fórceps ultrafinas para levar o fio com fórceps finos(Figura 3; 1-2).</li>
		<li>Apunhale a pele do lado esquerdo da incisão através da cavidade externa do corpo para tirar a rosca ( Figura 3; 3-4).</li>
		<li>Feche a abertura da incisão e faça dois nós e corte a rosca excessiva(Figura 3; 4-6). NOTA: A sutura deve estar adequadamente apertada, e o restante do fio do peixe deve ser longo o suficiente para evitar o afrouxamento da sutura. Todo o procedimento desde anestesia até a sutura geralmente leva até 6 minutos. Tempo mais longo pode levar à mortalidade.</li>
		<li>Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário. NOTA: Peixes gonadectomizados geralmente apresentam comportamento normal após 1-2 horas na água de recuperação. Portanto, dependendo do propósito do experimento, pode-se provar o peixe após esse intervalo de tempo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedimento de amostragem de sangue
<ol><li>Prepare as ferramentas: uma agulha de vidro, um capilar de silicone, um tubo de plástico com um orifício, um tubo plástico vazio de 1,5 mL, uma minicentrifuagem e fita.</li>
	<li>Anestesiar o peixe utilizando solução anestésico de 0,02%, conforme descrito na etapa 2.1 e colocar o peixe sob um microscópio de dissecção em posição vertical(Figura 4A). Coloque o peixe em uma superfície brilhante para facilitar a visualização da veia de punção caudal.</li>
	<li>Instale a gaveta de sangue anexando uma agulha de vidro ao capilar de silicone(Figura 4B). Quebre a ponta da agulha com adoçam de ponta larga e cubra o interior da agulha com solução anticogulante por sucção e sopro. NOTA: Recomenda-se o uso de um e um capilar de silicone com pelo menos 50 cm de comprimento para medidas de segurança para evitar qualquer contato direto do sangue ao sucumbir. Além disso, certifique-se de que a abertura da ponta da agulha é suficientemente grande para permitir o desenho do sangue.</li>
	<li>Direcione a agulha em direção à área do pedículo do peixe, aponte para a veia peduncle caudal(Figura 5A) e tire o sangue usando a boca até pelo menos um quarto o volume total da agulha é preenchido(Figura 5B). NOTA: É importante parar de aspirar antes de remover a agulha do corpo do peixe.</li>
	<li>Solte a agulha e coloque um pedaço de fita na proximidade do lado afiado da agulha. Coloque a tampa com um orifício em um tubo de coleta e coloque a agulha dentro do tubo através do orifício com a ponta da agulha por fora(Figura 5C).</li>
	<li>Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário. NOTA: Para realizar uma segunda amostragem de sangue do mesmo peixe, prove o sangue uma semana após a primeira amostragem de sangue.</li>
	<li>Gire o sangue coletado por 1-2 segundos com 1.000 x g à temperatura ambiente para coletar o sangue no tubo.</li>
	<li>Proceda diretamente para aplicações a jusante ou armazene o sangue a -20 °C até o uso. NOTA: Consulte o estudo anterior para extração de esteroides sexuais de todo o sangue48.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.
<p clas...

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária9,10, e assim servem papéis cruciais na plasticidade cerebral e pituitária. Apesar do conhecimento relativamente bom em mamíferos, o mecanismo de regulação do eixo BPG mediado por esteroides sexuais está longe de ser compreendido em espécies não-mamíferas, levando à má compreensão dos princípios evolutivos conservados11. Ainda há um número limitado de estudos documentando o papel dos esteroides sexuais na plasticidade cerebral e pituitária, aumentando assim a necessidade de investigações adicionais sobre o papel e os efeitos dos esteroides sexuais em diversas espécies de vertebrados.
Entre os vertebrados, as teleostas tornaram-se animais modelo poderosos no enfrentamento de inúmeras questões biológicas e fisiológicas, incluindo resposta ao estresse12,13, crescimento14,15, fisiologia nutricional16,17 e reprodução2. Teleosts, nos quais os esteroides sexuais são representados principalmente por estradiol (E2) em fêmeas e 11-cetosetosterona (11-KT) em machos18,19, têm sido modelos experimentais confiáveis para investigar o princípio geral da reprodução entre espécies. As teleóstas mostram singularidade em sua conexão hipotalâmica-pituitária20,21 e distintas células gonadotrope22, que às vezes são convenientes para a elucidação de mecanismos regulatórios. Além disso, devido à sua comodidade tanto para experimentos de laboratório quanto de campo, os teleosts oferecem muitas vantagens em comparação com outros organismos. Eles são relativamente baratos para comprar e manter23,24. Em particular, pequenos modelos de teleost como o zebrafish (Danio rerio) e o medaka japonês (Oryzias latipes), são espécies com fecundidade muito alta e um ciclo de vida relativamente curto, permitindo a análise rápida da função genética e mecanismos de doença23, proporcionando assim vantagens ainda maiores no enfrentamento de uma infinidade de questões biológicas e fisiológicas, considerando os inúmeros protocolos bem desenvolvidos e kit de ferramentas genéticas disponíveis para essas espécies25.
Em inúmeros estudos, a remoção de gônadas (gonadectomia) juntamente com técnicas de amostragem de sangue têm sido utilizadas como método para investigar muitas questões fisiológicas, incluindo seu impacto na fisiologia reprodutiva de vertebrados nos mamíferos26,27,28, aves29 e anfíbios30. Embora o efeito gonadectomia na fisiologia reprodutiva possa ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuais, como tamoxifen e clomifeno, o efeito das drogas parece ser inconsistente devido aos efeitos bimodais31,32. A exposição crônica a um antagonista de esteroides sexuais pode levar ao alargamento ovariano33,34, que pode desativar a observação de seus efeitos para fins de longo prazo devido a um fenótipo não saudável. Além disso, é impossível realizar um experimento de recuperação após o tratamento antagonista de esteroides sexuais, para justificar o efeito específico de certos esteroides sexuais. Junto com esses pontos acima mencionados, outras trocas de uso de antagonistas de esteroides sexuais foram amplamente revisadas31,32. Portanto, a gonadectomia ainda aparece hoje como uma técnica poderosa para investigar o papel dos esteroides sexuais.
Enquanto as técnicas de gonadectomia e amostragem de sangue são relativamente fáceis de executar em espécies maiores, como o robalo europeu (Dicentrarchus labrax)35, o tálamo azul(Thalassoma bifasciatum)36, o dogfish(Scyliorhinus canicula)37 e o bagre(Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, eles levantam desafios quando aplicados em peixes pequenos como medaka. Por exemplo, o uso do Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 é menos viável e parece ser propenso a danos físicos excessivos para peixes pequenos. Além disso, um procedimento de gonadectomia que é comumente usado para peixes maiores40 não é adequado para peixes pequenos que requer alta precisão para evitar danos excessivos. Finalmente, a amostragem de sangue é desafiadora devido ao acesso limitado aos vasos sanguíneos e à pequena quantidade de sangue nesses animais. Portanto, um protocolo claro demonstrando cada passo de gonadectomia e amostragem de sangue em um pequeno teleost é importante.
Este protocolo demonstra os procedimentos passo a passo da gonadectomia seguidos pela amostragem de sangue em medaka japonesa, um pequeno peixe de água doce nativo do leste da Ásia. Medaka japonesa tem um genoma sequenciado, várias ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25, e um sistema de determinação genética de sexo que permite a investigação de diferenças sexuais antes que características sexuais secundárias ou gônadas sejam bem desenvolvidas41. Curiosamente, medaka japonesa possui gônadas fundidas contrárias a muitas outras espécies de teleost42. Essas duas técnicas combinadas levam apenas 8 minutos no total e completarão a lista de protocolos de vídeo já existentes para esta espécie que incluía rotulagem de vasos sanguíneos43,grampo de remendo nas seções pituitárias44 e neurônios cerebrais45, e cultura celular primária46. Essas técnicas permitirão que a comunidade de pesquisa investigue e entenda melhor os papéis dos esteroides sexuais em mecanismos de feedback, bem como na plasticidade cerebral e pituitária no futuro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram.
<p class="jove_content" fo:keep-t...

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.2K visualizações.  Norwegian University of Life Sciences. O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal. 

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Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

A amostragem da água do mar e Cobrança

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Biologia

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Não invasivo In Vivo Pequenos Animais MRI e MRS: Basic procedimentos experimentais

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Técnicas de coleta de sangue não terminal em cobaias

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...