Microarrays de DNA e RNA são muito úteis para estudar as interações entre ácidos nucleicos e proteínas, mas também são um método conveniente para a preparação de bibliotecas de sequências. A fotolithografia permite que centenas de milhares de sequências únicas sejam sintetizadas em paralelo e é atualmente o único método direto para a síntese de RNA em microarrays. A síntese fotolithográfica in situ de microarrays também pode ser estendida a oligonucleotídeos quimicamente modificados, por exemplo, com dois fluoros primos de ácidos nucleicos de peptídeos.
Ver o processo de fabricação e manuseio de microarray pode ajudar a entender como esse maquinário complexo foi desenvolvido a partir da conhecida síntese de DNA de fase sólida padrão. Inicie este procedimento com design de microarray e funcionalidade deslizante, conforme descrito no protocolo de texto. Ligue o LED UV sintetizador de DNA e seu ventilador de resfriamento.
Conecte um medidor de intensidade UV no ponto focal da luz UV de entrada e ligue-o. No computador, inicie o software WiCell Controller. Ligue e inicialize o dispositivo de micromere.
Carregue um arquivo de máscara toda branca clicando com o botão direito do mouse em DMD e, em seguida, selecionando a imagem de carga. Clique com o botão direito do mouse no ícone UVS e selecione abertura do obturador UV. Leia o valor de potência no medidor de intensidade e conte 60 segundos.
Após 60 segundos, leia novamente o valor de energia e observe os valores de início e fim. Feche o obturador selecionando o obturador UV e desligue o medidor de intensidade. Calcule o valor médio de intensidade UV em milímetros por centímetro quadrado.
No software WiCell, carregue os arquivos de trabalho, sequência e protocolo em suas respectivas sub-janelas e clique em enviar os arquivos de sequência e protocolo para o sintetizador de DNA. Para montar a célula de síntese coloque uma espessa junta perfluoroelestomer no bloco de quartzo da célula. Em seguida, coloque um slide de microscópio perfurado e funcionalizado em cima da primeira junta, e verifique se os orifícios nos slides se conectam com a entrada e a tubulação de saída da célula de síntese.
Coloque uma segunda junta de politetrafluoroetileno fina sobre o escorregador perfurado, ao redor dos dois orifícios. Por fim, coloque um segundo slide funcionalizado, mas não ondulado, em cima da segunda junta. Agora coloque uma estrutura metálica de 4 parafusos em cima da célula de substrato duplo montada Aperte o parafuso à mesma força de fixação usando uma chave de fenda de torque.
Conecte a entrada e a tubulação de saída ao sintetizador de DNA. Prime a linha de lavagem de acetonitrila e verifique o fluxo adequado de acetonitrilo através dos substratos. Meça o volume de acetonitrila na linha de resíduos depois de passar por sete ciclos de escoramento de acetonitrilo.
Este volume deve ser de dois mililitros. Conecte a célula de síntese no plano focal da luz UV de entrada. No caso da preparação da biblioteca, conecte uma linha extra de entrada e saída na parte de trás da célula e encha a câmara traseira com os dois mililitros da solução betacarotena.
Inicie a síntese clicando pela primeira vez em Executar no software WiCell. No primeiro comando de espera no arquivo de trabalho, pressione o sintetizador de DNA. Após a síntese de microarrays regulares, desconecte a célula do sintetizador e desmonte a célula.
Use uma caneta de diamante para gravar o número da síntese nas lâminas de vidro. Etch o número na face não sintetizada de cada slide. Transfira os slides para tubos de centrífugas de 50 mililitros e armazene em uma área dessecada até que seja mais utilizado.
Após a síntese de microarrays da biblioteca, primeiro drene a solução betacarotena para fora da câmara e depois lave a câmara duas vezes, fluindo cinco mililitros de cloreto de metileno antes de drenar. Para desproteção de microardo de DNA, encha um frasco de vidro de coloração com 20 mililitros de etanol e 20 mililitros de EDA. Coloque as microarrays somente de DNA verticalmente no frasco, feche a tampa e deixe os slides para desprotegir por duas horas à temperatura ambiente.
Depois de duas horas, recupere os slides usando pinças e enxágue-as completamente com água duplamente destilada. Seque as lâminas em uma centrífuga de microarray por alguns segundos antes de armazená-las em um desiccador. Para desproteção de microarray RNA, prepare uma solução seca de trietilamina de 20 mililitros e 30 mililitros de acetonitrilo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Transfira um slide de microarraia de RNA para o tubo de centrífuga, feche a tampa e enrole com filme de vedação de plástico. Agite suavemente o tubo de centrífuga em um agitador orbital por uma hora e 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o slide e lave duas vezes com 20 mililitros de acetonitrilo seco antes de secar em uma centrífuga de microarray por alguns segundos.
Após a primeira etapa de desproteção, transfira o deslizamento de RNA para a solução de hidrazina, feche a tampa e enrole com filme de vedação de plástico. Depois de duas horas tremendo suavemente em um agitador orbital, remova o slide e lave-o duas vezes com 20 mililitros de acetonitrila seca. Em seguida, seque em uma centrífuga microarray por alguns segundos.
Se a microarray RNA também contiver nucleotídeos de DNA, proceda com uma terceira etapa de desproteção. Adicione a microarraia dna/RNA a um tubo de 50 mililitros contendo uma solução de um a um EDA-etanol Após 5 minutos à temperatura ambiente, remova a lâmina e lave a microarray duas vezes com 20 mililitros de água estéril. Seque o escorregador em uma centrífuga de microarray e armazene em um desiccador.
Em um tubo de microcentrifuso estéril de 1,5 mililitro, prepare o tampão de hibridização contendo DNA rotulado cy3, conforme descrito no protocolo de texto. Misture e vórtice a solução. Coloque cuidadosamente uma câmara de hibridização de 300 microliter autoadesivo sobre a área de síntese em cada slide e tubulação na solução de hibridização.
Cubra os orifícios da câmara com pontos adesivos e enrole todo o slide em papel alumínio. Coloque o deslizamento de microarray no forno de hibridização, cubra e deixe girar suavemente na temperatura de hibridização selecionada por duas horas. Após duas horas, retire o slide, remova a folha de alumínio, pipeta a solução de hibridização e retire cuidadosamente a câmara de hibridização.
Transfira os slides para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de buffer de lavagem não rigoroso. Agite vigorosamente por dois minutos em temperatura ambiente. Transfira o slide para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de Tampão de Lavagem Rigoroso e agite vigorosamente por um minuto.
Finalmente, transfira o slide para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de Buffer de Lavagem Final. Agite por alguns segundos. Seque o deslizamento em uma centrífuga de microarray.
Agora, coloque a microarray seca, área de síntese voltada para baixo, no porta-slides do scanner de microarray. Para desprotegar e cortar bibliotecas de DNA, mergulhe o slide na solução de decote, em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Feche o tubo e enrole com filme de vedação de plástico, antes de girar suavemente em um agitador orbital por duas horas em temperatura ambiente.
Depois de duas horas, remova o escorregador e lave duas vezes com 20 mililitros de acetonitrilo escrupulosamente seco antes de deixá-lo secar o ar. Com uma pipeta, aplique 100 microliters de água estéril sobre a área de síntese agora perceptível. Enconha a solução algumas vezes antes de transferi-la para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Repita o processo e misture a microarraia no mesmo tubo. Evaporar o chip eluar até o ressecamento e, em seguida, ressolver em 10 microlitres de H2O sem nuclease. Aqui estão os resultados de um ensaio de hibridização realizado em uma microarray contendo as versões de DNA e RNA de uma sequência de 25mer.
O escaneamento aparece em um formato de escala verde correspondente à excitação, espectro de emissão de fluorescência Cy3, com intensidade de fluorescência registrada em unidades arbitrárias. Há variabilidade significativa nos valores absolutos de fluorescência entre os experimentos. Os resultados de três sínteses independentes usando os mesmos parâmetros de fabricação e o mesmo manuseio pós-sintético são mostrados.
O DNA de 25mer, quando hibridizado à sua vertente de DNA com rótulo Cy3 complementar, produzirá sinais de fluorescência que variam de 20.000 a 30.000, muito raramente acima ou abaixo. O RNA de 25mer, quando hibridizado para o mesmo complemento de DNA rotulado cy3, dará intensidades de fluorescência nas características correspondentes que variam de 15.000 a 20.000. No entanto, a intensidade de fluorescência dos duplexes de RNA/DNA ocasionalmente cairá abaixo de 8.000, quando os duplexes correspondentes de DNA/DNA ainda fluorescem dentro da faixa de 20.000 a 30.000.
Nesses casos, os resultados do RNA podem ser considerados como sub-ideais. Como em qualquer outro experimento baseado em RNA, é importante lembrar que as microarrays de RNA são sensíveis à degradação e devem ser tratadas em condições estéreis. Bibliotecas de ácido nucleico coletadas a partir de microarrays podem ser usadas em sequenciamento de DNA ou RNA, bem como na codificação de informações digitais no DNA.
O NED produz uma luz UV intensa que não deve ser diretamente examinada. Por causa disso, é aconselhável usar óculos de proteção enquanto o instrumento estiver em uso.
