Este protocolo pode ser usado para estudar poliploidização induzida por feridas. Um processo de reparação de tecidos conservado, no qual as células crescem em vez de se dividir na mosca de frutas adultas. Uma simples perfuração pode ser feita para induzir poliploide no epitélio de mosca dentro de apenas dois dias.
O tamanho das células epiteliais, a ploidia e a organização podem então ser avaliados facilmente. Comece coletando dois frascos, contendo de 10 a 15 moscas de frutas fêmeas recém-fechadas da variedade de interesse. E envelhecer as moscas em frascos de comida fresca, com aproximadamente cinco moscas machos por frasco a 25 graus celsius, até três a cinco dias de idade.
Para ferimentos abdominais, no final da incubação, use um único pino de aço inoxidável de 0,1 milímetro para montar vários suportes de pinos, com a extremidade afiada de cada pino andando para fora. Anestesiar as moscas de frutas fêmeas envelhecidas em uma plataforma de mosca de dióxido de carbono sob um microscópio estéreo. E use um pincel para organizar as moscas em uma fileira.
Usando óculos de segurança, com um suporte de alfinete em uma mão e fórceps na outra, use os fórceps para posicionar as moscas com seus abdômens ventrais voltados para cima. Em seguida, puna as moscas fêmeas adultas dentro da região azul epitelial direita do alvo A4 em ambos os lados da linha média ventral agitar as noites e retornar as moscas feridas para o frasco de comida até o ponto de tempo experimental desejado pós-lesão. No ponto final experimental, verifique a presença da ferida e cicatriz em cada mosca anestesiada sob o microscópio estéreo e encha um poço de um prato de dissecção de vidro de nove poços com a solução de Grace.
Usando um par de fórceps, segure uma fêmea ferida voar pelo lado dorsal do tórax e submergir a mosca no poço da solução. Por outro lado, use um segundo par de fórceps para perfurar e remover a cutícula dorsal abaixo do alvo A6, na parte traseira da mosca frutífera. Se os órgãos internos não forem extraídos, aplique pressão no lado dorsal do abdômen para espremer os órgãos restantes.
Use os fórceps para tirar o abdômen completo na junção do tórax acima do alvo A2 e transfira o abdômen para um poço contendo aproximadamente 100 microliters da solução de Grace. Quando todos os abdômens tiverem sido coletados, reduza o volume da solução de Grace na coleção para 30 microliters. Use fórceps em uma mão para segurar o lado dorsal do abdômen para baixo e use a outra mão para inserir a lâmina inferior da tesoura de mola de Veneza na cavidade abdominal de cada abdômen e corte ao longo da linha dorsal até que os abdômens estejam totalmente abertos.
Adicione 30 microliters da solução de Grace em cada área de montagem de uma placa de dissecação seca com 4,1 milímetros de pinos por área de montagem abdominal e coloque o abdômen filé na gota da solução. Quando todos os abdômens tiverem sido preenchidos e colocados, fixe os abdômens no prato nos quatro cantos dorsais. Tomando cuidado para que os tecidos estejam deitados sem rasgar ou esticar o tecido abdominal.
Em seguida, substitua a solução da Grace por 30 microliters uma solução fixa por área de montagem. E coloque uma etiqueta de fita na parte inferior de cada prato para marcar cada controle e grupo experimental. Para montar as amostras de tecido de mosca.
Após a coloração, use fórceps para despresar os abdômens da placa dissecando sob o microscópio estéreo. E use fórceps para transferir cada amostra pelo seu flanco dorsal em aproximadamente 30 microliters de meio de montagem em deslizamentos individuais de cobertura de vidro. Sob o microscópio estéreo orientar o tecido abdominal de modo que o interior esteja voltado para baixo em direção ao deslizamento da tampa e use fórceps para puxar os abdômens orientados para a borda de cada gota de mídia.
Coloque cada deslizamento de cobertura montado em um slide de vidro rotulado. E use um tecido de laboratório para remover qualquer meio de montagem em excesso. Em seguida, sele as bordas da tampa com esmalte claro e armazene os slides na caixa de slides a quatro graus celsius até sua imagem.
A proteína de junção de septate rápida três que rotula as junções celulares, fornece um indicador de se alguma perturbação de processamento ocorreu durante a preparação. Abdômens com grandes arranhões de área não manchada que perturbam a área da ferida, devem ser descartados e não incluídos na análise. O reparo da ferida é completo quando uma grande célula multinucleada central cobre a cicatriz da ferida.
Lacunas de mais de 10 micrômetros na folha epitelial são consideradas defeitos no fechamento da ferida e re-epitelialização. Nesta análise representativa utilizando moscas com ativação celular mitótica inibida, 52% das feridas não foram capazes de formar uma folha epitelial contínua sobre a cicatriz da ferida. Este ensaio de cicatrização da ferida da membrana fornece mais informações sobre a extensão do defeito de reparação da ferida permitindo que defeitos de re-epitelialização sejam agrupados como completamente abertos, parcialmente fechados ou completamente fechados.
Por exemplo, neste experimento a inibição da poliploidização induzida pela ferida pelo bloqueio simultâneo da replicação endo e fusão celular, causada por 92% das feridas epiteliais permanecerem completamente abertas. Enquanto a ativação do ciclo das células mitóticas resultou em um defeito de fechamento da ferida epitelial. Além disso, a atividade do ciclo celular foi detectada pela incorporação da EDU analógica da timmidina e a ploidia epitelial foi determinada medindo diretamente o conteúdo do DNA nuclear.
Ao dissecar o epitélio abdominal, tome cuidado para não tocar no tecido com nenhuma das ferramentas de dissecção, pois isso arranhará a amostra. Após dissecção, proliferação celular, morte celular, tamanho da incisão de perda celular ou avaliações de conteúdo de DNA nuclear podem ser realizadas para entender melhor a poliploidização induzida pela ferida. ou outros processos dentro do epitélio.
