Este protocolo foi desenvolvido através de nosso trabalho dentro e em colaboração com os laboratórios de Paul Martin e Antonio Jacinto. Agradecemos ao Centro de Ações Bloomington pelo seu excelente serviço e da comunidade Drosophila para continuar compartilhando linhas de voar. BS é atualmente financiado por uma doação do projeto BBSRC. WW é financiado por uma bolsa de Desenvolvimento de Carreira Wellcome Trust.

Preparação <ol><li> Obter linhas apropriadas Drosophila contendo um hemócitos específicos Gal4 driver (por exemplo, srp-Gal4 2) e um repórter geneticamente codificado fluorescente sob controle UAS (por exemplo, uas-GFP). Moscas homozigotos para srp-Gal4, uas-GMA 3 ou CRQ-Gal4, uas-GFP 4, 5 são particularmente úteis para fins de imagem (nb GMA é GFP fundida ao domínio de ligação de actina de moesin), veja abaixo para uma discussão sobre a gama de Gal4 motoristas e uas construções disponíveis (o Centro de Bloomington stock contém uma grande variedade). </li><li> Cruzes tipicamente genética são realizadas de tal forma que alelos mutantes são equilibradas usando fluorescentes balanceadores CTG ou TTG 6, com Gal4 motoristas e uas construções realizadas em alternativa cromossomos homólogos. Isto torna possível selecionar mutantes homozigotos com base na ausência de CTG / TTG-associado de fluorescência da GFP (isto é feito na fase 2.11). </li><li> Ampliar ações e moscas lugar em uma gaiola de assentamento com uma placa de ágar suco de maçã 7. As moscas precisa de pelo menos dois dias para aclimatar à gaiola que estabelece o suficiente antes de embriões começam a ser estabelecidas. Em geral twenty moscas de cada sexo deve ser suficiente para gerar embriões suficiente para geração de imagens, mas deve ser notado que linhas diferentes têm diferentes graus de fertilidade. Nós usamos 55 milímetros pratos de Petri que se encaixam na parte inferior de um copo de plástico, perfurado na sua base para permitir o fluxo de ar. A forma exata da colheita de embriões não é importante, mas os horários são críticos, a fim de coletar corretamente encenado embriões. </li><li> Coletar embriões de um dia para o outro placa de ágar suco de maçã mantida a 25 ° C ou a partir de uma placa cronometrados. Para este último que geralmente permitem que as moscas para colocar em um prato pré-aquecido por 4 horas, antes de remover a placa e colocá-lo a 18 ° C por 15-16 horas antes da montagem de embriões, o que fornece embriões de fase tardia de 12 a para o estágio 15 de desenvolvimento. Uma placa de overnight contém uma maior diversidade de fases, mas oferece a vantagem de níveis mais elevados de expressão repórter fluorescentes em hemócitos devido a um longo período de tempo a 25 ° C como o sistema Gal4-UAS é sensível à temperatura. </li></ol> Procedimento <ol><li> Desalojar embriões a partir da placa de ágar suco de maçã utilizando uma pequena quantidade de água e um pincel macio de ponta. Embriões desalojado pode ser visto facilmente a olho nu. </li><li> Transferência de embriões para um filtro de células (Fisher), ou home-made cesta de 7 por despejar água a partir da placa de ágar suco de maçã na cesta realizada ao longo de um copo para pegar água de resíduos. </li><li> Repita o passo 2,2 até ficar satisfeito você tem embriões suficientes transferidos da placa de ágar suco de maçã. </li><li> Lavar embriões em coador de células / cesta com água. </li><li> Célula local do filtro / cesta na tampa placa de Petri da placa de ágar suco de maçã e acrescente o suficiente lixívia pura para suspender embriões no coador de células / cesta. </li><li> Siga dechorionation dos embriões em um microscópio de dissecção sob brightfield: dechorionation está completa quando os apêndices dorsal ter dissolvido, o que deve ocorrer dentro de dois minutos. </li><li> Remover células do filtro / cesta contendo embriões a partir da lixívia e lavar lixívia residual com água. Todos os vestígios de água sanitária deve ser removido antes de prosseguir para o passo 2.8. Um truque para avaliar se todos os lixívia foi removido para fora da água residual blot em tecidos de cor azul laboratório - se houver lixívia residual a cor azul vai ser branqueada branco / rosa. </li><li> Blot fora da água restante através de tecidos de laboratório / mediwipes aplicado na face inferior da célula coador / cesta. </li><li> Coloque uma gota de água em uma tampa de placa de Petri. Com um pincel fino, recolher todos os embriões dechorionated da cesta embrião e ressuspender-los na gota. Em seguida secar os embriões por aspiração de água usando uma micropipeta ou absorvendo-o cuidadosamente com um tecido de laboratório / mediwipes. </li><li> Uma vez que os embriões foram secos, adicione uma gota de óleo voltalef para cobrir todos os embriões. Colocar uma segunda gota pequena de óleo junto ao gotículas contendo os embriões. NB temos sido incapazes de encontrar um fornecedor baseada no Reino Unido de óleo voltalef; halocarbono óleo 700 (Sigma) pode ser utilizado. </li><li> Sob um microscópio fluorescente dissecção selecionar adequadamente encenado embriões do genótipo desejado usando um par de fórceps relojoeiros (número 5) a partir da gota de óleo. Estas pinças devem ser dobrados para dentro (Figura 1), a fim de colher-se os embriões sem a sua perfuração da membrana vitelina. Transferência de embriões selecionados para a segunda gota de óleo. É importante que você é capaz de ver hemócitos fluorescente no microscópio de dissecação, a fim de ser capaz de coletar boas imagens no microscópio confocal (Figura 2). Normalmente, montagem embriões em estágio 13/14 à migração imagem lateral do hemócitos na linha média ventral ou estágio 15 embriõespara a imagem da motilidade dos hemócitos seguintes dispersão sobre o embrião. </li><li> Vara duas lamelas (18x18mm, espessura 1) para a parte inferior de um prato Petriperm / Lumox (Sarstedt), usando duas pequenas gotas de óleo voltalef, deixando cerca de um centímetro entre eles (Figura 3), que serão utilizados para apoiar uma lamela colocada sobre os embriões, de modo a não esmagá-los. Pratos Petriperm (diâmetro 50mm) contêm uma hidrofóbica, a membrana gás-permeáveis. Nós achamos que os pratos se tornam mais fáceis de usar, uma vez que têm sido usadas várias vezes (os pratos podem ser limpas com álcool 70% e reutilizados). </li><li> Sob brightfield no microscópio de dissecção, pegar embriões selecionados, um por um com a pinça dobrados e alinhá-las lado ventral para cima e paralela à borda da lamínulas (Figura 3). É possível alinhar até 15 embriões, desta forma, dependendo da sua destreza e paciência. É importante para manipular os embriões gentilmente tanto como os embriões e da membrana prato Petriperm são frágeis e podem ser facilmente rompido. </li><li> Uma vez que os embriões são alinhados adicionar uma pequena gota de óleo e deixe-a se espalhar para formar uma camada homogênea entre as duas lamelas. Depois que o óleo se espalhou (isso pode levar alguns minutos) verificar que os embriões ainda estão lado ventral para cima. Se os embriões têm rolado ligeiramente, reposicioná-los novamente com a pinça. </li><li> Finalmente, usando uma pinça (número 3) coloque uma lamínula (18x18mm, espessura 1) ao longo dos embriões, descansando sobre as duas lamínulas previamente aderido. Cola esta lamela à lamela suporta o uso de unha polonês (Figura 3). </li><li> Leve o prato Petriperm com embriões montado ao microscópio confocal ou wide-campo e montar o prato Petriperm no palco usando um adaptador apropriado. Ou um microscópio vertical ou invertida pode ser usado, com a lente objetiva com foco através da lamela (ao contrário através da membrana). </li></ol> Resultado representante: Este protocolo descreve como montar Drosophila embriões para geração de imagens ao vivo de hemócitos no lado ventral do embrião. Se feito corretamente, será fácil de gerar ou fotos ou filmes de hemócitos. O principal determinante é o microscópio usado para a imagem do hemócitos (em particular a lente objetiva), mas a natureza das imagens adquiridas também vai depender do estágio de desenvolvimento, a temperatura, os embriões foram levantadas na e as linhas Gal4 e uas usado. Níveis mais elevados de expressão da proteína fluorescente permitirá hemócitos a ser trabalhada com maior facilidade, por isso é importante ser capaz de ver hemócitos quando os embriões estão em fase de 2,11 do protocolo (Figura 2 contém exemplos de hemócitos clara dentro embriões, tiradas com uma câmera equipada com um microscópio de dissecção). Números, portanto, aumento da Gal4 e constrói uas permitir uma maior relação sinal-ruído. Além disso reduz a necessidade de laser de alta intensidade ou tempo de exposição aumentou quando de imagem, que por sua vez permite um comportamento hemócitos a serem seguidos por longos períodos de tempo. Níveis muito altos de expressão GFP vai aparecer pequenos detalhes da morfologia hemócitos, particularmente as lamelas como folhas finas que circundam o corpo da célula circular (Figura 4A-B). Regiões circulares excluindo GFP representam fagossomos (Figura 4A-C). Dedo-como filopodia também pode ser visto emergindo das lamelas (Figura 4B). Dois motoristas permanecem Gal4 suficiente para ver estes processos (Figura 4C), especialmente se um ou mais é srp-Gal4 (ver discussão), porém menor velocidade de digitalização ou maior poder de laser sobre o microscópio confocal pode ser necessária. Como diminuir os níveis de expressão se torna mais difícil para a imagem do saliências de hemócitos, no entanto, ainda é possível acompanhar a migração dos hemócitos sob essas condições como o corpo da célula continua a ser evidente, mesmo quando as saliências são menos claras (Figura 4D). Em fases anteriores de desenvolvimento (até estágio 13) hemócitos migram em estreito contacto uns com os outros e muitas vezes é difícil distinguir células individuais. Ao final do estágio 13 hemócitos formaram uma única linha para baixo da linha mediana ventral (Figura 5A), então, cada vez mais móveis, migrar lateralmente para as bordas do cordão nervoso ventral (Figura 5B). O citoesqueleto de actina dentro do saliências dinâmica de hemócitos pode ser observado diretamente através da expressão do GMA (Figura 5C) ou cereja-moesin. Montagem da embriões desta forma permite trocas gasosas e evita a desidratação e embriões permanecem viáveis ​​imagem seguinte. Se o embrião é danificado durante a montagem é geralmente óbvia como o conteúdo do embrião vai vazar através da sua membrana vitelina. Se um embrião não começar a desidratar, então este pode muitas vezes foi visto por deformações na membrana vitelina. Ocasionalmente, um embrião vai rolar durante o curso de um filme timelapse, no entanto isso só tende a ser problemático para filmes mais longos prazos. Lastly, montando vários embriões ao mesmo tempo dá ao experimentalista a melhor chance de obter um embrião na orientação perfeita para seu experimento. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pinças para a manipulação de embriões dechorionated. As pontas dos relojoeiros fórceps (número, tamanho 5) devem ser dobrados para dentro, a fim de moda uma ferramenta para recolher embriões como mostrado aqui. A superfície externa da região dobrado também é útil para manipular embriões ao se posicionar sobre a membrana Petriperm como eles não possuem bordas afiadas que podem perfurar o embrião. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Imagens representativas de embriões que renderá bons resultados de imagem ao vivo. Imagens de embriões dechorionated em óleo voltalef (2,11 na fase do protocolo), tomada em um microscópio de fluorescência de dissecação. Vistas laterais do estágio 13 (A) e estágio 15 (B) srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, uas-GFP embriões. Vista lateral de um palco 15 srp-Gal4, uas-GFP / +; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP/uas-N17Rac (C) em que hemócitos não conseguiram migrar para fora da cabeça, demonstrando que os embriões olhar como quando hemócitos não são aparentes ao longo de suas rotas migratórias. Vista lateral de um palco 17 srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP mostrando a estrutura complicada do intestino, nesta fase de desenvolvimento (D); o início da contração muscular impede imagens ao vivo de embriões para além deste estágio de desenvolvimento. Vista ventral da etapa 13 (E) ea fase 14 (F) srp-Gal4, embriões uas vermelho stinger mostrando dispersão de hemócitos com núcleos fluorescente etiquetado. Observação de hemócitos por fluorescência em fase de 2,11 do protocolo é um pré-requisito para obtenção de imagens excelentes; anterior está à direita de todas as imagens. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Montagem de embriões em um prato Petriperm / Lumox. Duas lamínulas 18x18mm (espessura 1) estão presos à face inferior do prato Petriperm usando uma pequena gota de óleo, separados por cerca de um centímetro, como mostrado. Embriões são então alinhadas lado ventral com seu eixo longo (ântero-posterior) para as bordas das lamínulas e coberto com uma pequena gota de óleo. Depois que o óleo se espalhou para preencher a lacuna entre as duas lamínulas uma lamela terceiro (18x18mm espessura 1) é gentilmente colocada em cima dos embriões de óleo coberto com as duas lamínulas previamente aderido como uma ponte para evitar os embriões de ser esmagado. Esta lamela é então colada às duas pontes lamela usando duas pequenas gotas de unha polonês. Uma vez definido, os embriões podem ser visualizados num microscópio vertical ou invertida com a lente objetiva com foco para baixo através da lamela (ao contrário através da membrana Petriperm). <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Resultados representativos de imagens ao vivo de hemócitos GFP rotulados. Z-projeções de hemócitos no lado ventral de um estágio 14 srp-Gal4, uas-GFP; CRQ-Gal4, embrião uas-GFP (AB). (A) é uma imagem de menor ampliação, como as utilizadas para monitorar hemócitos migrações de desenvolvimento em filmes timelapse. (B) é uma ampliação maior ainda de hemócitos na linha média ventral, mostrando detalhes de sua morfologia. (C) é uma fatia única m 1 de hemócitos na linha média ventral em um estágio 14 srp-Gal4, uas-GFP / +; CRQ-Gal4, uas-GFP / + embrião, revelando que menor número de cópias de Gal4 motoristas e uas construções também são suficientes para gerar boas imagens. (D) exibe uma z-projeção de hemócitos em um estágio CRQ-14 Gal4, embrião uas-GFP. Aqui saliências hemócitos são menos óbvios devido à menor expressão da GFP, mas ainda é possível fazer filmes e acompanhar a migração hemócitos com esta combinação de Gal4 motorista e uas construir. Imagens foram obtidas em um microscópio confocal LSM510 Leica; anterior é em todas as imagens, os anéis na periferia de imagens são causadas por vitelínico autofluorescência membrana. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Resultados representativos de imagens ao vivo de hemócitos GMA expressar. Z-projeções de hemócitos na linha média ventral do estágio 13 (A) e estágio 14 (B) srp-Gal4, uas-GMA embriões, retiradas de filmes timelapse para mostrar as migrações de desenvolvimento de hemócitos. Informações detalhadas sobre a dinâmica de actina pode ser obtido por imagem maior ampliação de hemócitos GMA expressar (C). GMA consiste de GFP fundida ao domínio de ligação de actina dos filamentos de actina moesin e etiquetas. Anterior é em todas as imagens, as imagens foram tiradas em um microscópio confocal.

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF/VEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila.">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7, 73-84 (2004).</li><li>Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+morphogenetic+movements+in+Drosophila+using+Gal4-UAS-driven+expression+of+GFP+fused+to+the+actin-binding+domain+of+moesin.">Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin.</a> Genesis. 34, 146-151 (2002).</li><li>Stramer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes.">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34, 135-138 (2002).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila protocols. , (2000).</li><li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila.">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120, 1829-1837 (1994).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135, 621-626 (2008).</li><li>Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+PAR-1+in+regulating+the+polarised+microtubule+cytoskeleton+in+the+Drosophila+follicular+epithelium.">The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium.</a> Development. 130, 3965-3975 (2003).</li><li>Olofsson, B., Page, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+the+central+nervous+system+in+embryonic+Drosophila+is+inhibited+by+blocking+hemocyte+migration+or+neural+activity.">Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity.</a> Dev Biol. 279, 233-243 (2005).</li><li>Paladi, M., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+Rho+GTPases+in+embryonic+blood+cell+migration+in+Drosophila.">Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila.</a> J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).</li><li>Vlisidou, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+embryos+as+model+systems+for+monitoring+bacterial+infection+in+real+time.">Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time.</a> PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).</li><li>Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin-based+epithelial+adhesion+and+cell+matching+during+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.</a> Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+movement+during+dorsal+closure+in+Drosophila+embryos.">Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos.</a> Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).</li><li>Kunwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tre1+GPCR+initiates+germ+cell+transepithelial+migration+by+regulating+Drosophila+melanogaster+E-cadherin.">Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin.</a> J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).</li></ol>

Os elementos mais importantes deste processo são a seleção de embriões saudáveis ​​com hemócitos claramente identificados e montá-los sem danificá-los com cuidado. Uma vez que os embriões são no óleo halocarbonos são resistentes à desidratação e uma vez montada pode ser trabalhada por várias horas. Em nossas mãos, podemos hemócitos imagem para três horas, com desidratação insignificante do embrião ou do óbvio foto danos, tendo um z-stack de imagens a cada três minutos no nosso microscópio co...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352350</td>
<td>70&mu;m pores</td>
</tr>
<tr>
<td>Halcarbon oil 700</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H8898</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lumox/Petriperm dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>96077305</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations

Muitos estudos de migração de células endereço usando<em&gt; In vitro</emMétodos&gt;, enquanto que o ambiente fisiologicamente relevante é a do próprio organismo. Aqui apresentamos um protocolo para a montagem de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embriões e imagens ao vivo subseqüente de hemócitos fluorescente etiquetado, os macrófagos embrionário deste organismo. Usando o sistema Gal4-uas<sup&gt; 1</sup&gt; Nós dirigimos a expressão de uma variedade de milho geneticamente codificado, marcadores fluorescentes marcado em hemócitos de seguir sua dispersão ao longo do desenvolvimento do embrião. Após a coleta de embriões no estágio de desenvolvimento desejado, o córion externa é removida e os embriões são, então, montado em óleo halocarbono entre um hidrofóbico, gás-permeáveis ​​membrana e uma lamela de vidro para imagens ao vivo. Além bruta parâmetros migratórias, tais como velocidade e direção, a imagem de alta resolução juntamente com o uso de repórteres fluorescentes de F-actina e microtúbulos pode fornecer informações mais detalhadas sobre a dinâmica desses componentes do citoesqueleto.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations at JoVE.com

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

15.6K visualizações.  University of Bath. Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Vídeo: Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medição do Tempo de vida em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...