Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Os seguintes protocolos de descrever o procedimento detalhado para C. elegans pele ferindo e para ensaiar respostas feridas. 1. Needle Ferimento 3,4 <ol><li> Crescer vermes unstarved saudáveis ​​na NGM standard (meio de crescimento nematóide) placas com E. bactérias coli OP50 como alimentos, mantidos em um 20 ° C incubadora. NOTA: Os métodos para placas de agar NGM e cultivo de rotina de C. elegans pode ser encontrada em www.wormbook.org 6. </li><li> Escolha 25 L4 vermes palco para um recém-semeadas placa 1 dia antes ferindo e cultura a 20 ° CO / N. </li><li> Antes ferindo, puxe agulhas dos capilares usando um extrator de agulha. As agulhas utilizadas no ferir, são idênticos aos utilizados para microinjecção de C. elegans. </li><li> Certifique-se que todos os vermes estão em fase de adulto jovem. Colocar a placa de vermes em gelo durante cerca de 30 min. Resfriamento faz com que os animais a ser lento, facilitando agulha ferimento. <br /&gt; NOTA: Dentro de 5 min de remoção do gelo, os vermes vai começar a mover-se normalmente. É possível, mas desafiador para ferir vermes em movimento. Com a experiência, 5 min tempo suficiente para ferir 25 worms. Imobilizar com drogas como o levamisol (como usado no ferimento laser, ver abaixo), embora os animais vai demorar mais tempo para se recuperar. </li><li> Remova a placa de agar a partir de gelo para um estereomicroscópio de dissecação. Usando uma picareta verme, vermes mover 25 para o centro da placa de agar. </li><li> Coloque a agulha em uma ponteira 100 l para manter mais facilmente a agulha. Perfurar a parte anterior ou posterior do corpo do sem-fim com a agulha, evitando o desenvolvimento das gónadas. Em geral, tentar ferida entre a faringe posterior e anterior das gônadas, ou entre a gônada posterior e do reto. Re-use agulhas muitas vezes, até que eles quebram. NOTA: Certifique-se as feridas são breves, picadas suaves que perfuram a cutícula e pele, penetrando ~ 5-10 mm para o animal. A agulha deve entrar no animal em aproximadamente um ângulo reto com a pele. As feridas não deve causar danos evidentes aos órgãos internos, ou ruptura imediata do corpo. Observar uma pequena quantidade de citoplasma escorrendo para fora por alguns segundos depois que a ferida; no entanto, se o conteúdo celulares vazar durante um tempo prolongado os animais não vão sobreviver. Para imagem ideal, ferir o syncytium laterais epidérmico (hyp7) ou a costura lateral. NOTA: Este procedimento inclui a utilização de uma agulha de vidro. </li><li> Permitir vermes para recuperar, à TA, em seguida a cultura a 20 ° C. Julgar o sucesso de ferimento da agulha por uma série de ensaios a seguir descritos. Mais de 95% dos animais de tipo selvagem sobrevivem 24 horas após o ferimento da agulha na fase de adulto jovem. O efeito de ferir em larvas ou adultos mais velhos ainda não foi amplamente analisada. </li></ol> 2. Laser Ferimento 3 Use a irradiação com laser de femtossegundos (800 nm) para realizar ferimento mais preciso. <ol><li> Prepare agar pAnúncios sobre uma lâmina de vidro derretido com 2% agar 7. Assegurar que as almofadas são semelhantes para as almofadas de agar utilizadas para imagens em tempo real de C. elegans. </li><li> Transferir 10 vermes adultos jovens sobre o bloco de agarose com sem-fim de seleção e adicionar uma gota 2 mL de solução de 12 Levamisole mM. Cubra os animais e para o líquido com uma lamela. Espere 1-2 min para os vermes para paralisar. </li><li> Coloque a lâmina de vidro em um microscópio confocal disco giratório. Mova o palco para encontrar os vermes e se concentrar nas anterior e posterior sincicial epiderme laterais com um objetivo 100X (NA 1,4-1,46). </li><li> Defina a potência do laser femtosegundo a 140 mW (medido antes da objetiva). Use o laser de femtosegundo uma taxa de repetição de 80 MHz. NOTA: Dois pulsos de 200 ms cada (separados por 20 ms) são suficientes para ferindo em nossas mãos. </li><li> Concentre-se na superfície apical da célula epidérmica e ferir a epiderme. Observe rompimento local do citoplasma (borbulhando), ou o local de branqueamentof qualquer marcador fluorescente utilizado. NOTA: Siga os procedimentos de segurança a laser apropriadas quando se utiliza o laser de femtosegundo. Ponto ou linha scans usando lasers de femtossegundos, tais como aqueles em dois microscópios de fótons deve fornecer energia suficiente para ferir laser. NOTA: Enquanto não temos experiência direta do uso de outros lasers, em princípio, o ferimento deve ser possível usando lasers UV convencionais (como usado em C. elegans ablações celulares). Opcionalmente, use uma recuperação de fluorescência Após Fotodegradação módulo (FRAP) no giro confocal disco de ferir a epiderme (N. Pujol, comunicação pessoal). </li></ol> 3. A visualização das Epidérmico Ca 2+ As respostas do ferimento <ol><li> Use C. transgênico elegans estirpes que expressam Ca 2+ sensores (tais como os da série GCaMP) na epiderme, sob o controlo do promotor específico adulto epidérmico col-19 (Figura 1A; transgenes são listados em <strong&gt; Tabela 1). Usar um transgene que expressa uma proteína fluorescente vermelha, como tdTomato como um controlo interno para o nível de expressão do transgene. NOTA: Temos usado tdTomato como um controlo interno para a expressão do transgene como epidérmica tdTomato fluorescência é relativamente estável e não interfere com GCaMP imagem. </li><li> Ambos agulha eo laser ferindo gatilho Ca 2+ elevação na epiderme. No entanto, como ferimento da agulha não pode ser prontamente realizada em um disco confocal fiação, ferimento laser é preferível para análise quantitativa da resposta de Ca2 + (Figura 1). </li><li> Adquirir imagens de lapso de tempo em modo de aquisição multi-dimensional (tempo de intervalo de 2 segundos com 114 ms exposição laser de excitação), utilizando um confocal fiação disco com objetivo 100X (NA 1,4-1,46) e filtros adequados (filtros GFP irá trabalhar para GCaMP3). NOTA: Adquirir imagens de lapso de tempo a cada 30 seg por cerca de 2 horas para examinar o Ca 2+ response do ferimento durante um curso de tempo mais longo. </li><li> Usando o software de análise de imagem medir a fluorescência média GCaMP em dez regiões equivalentes de interesse (ROI), cinco dos quais estão centradas no citoplasma de células epidérmicas e cinco no fundo. </li><li> Obter fluorescência basal (F 0) fazendo a média da fluorescência em 5 ROIs na epiderme, em seguida, subtraindo a média de 5 ROIs no fundo antes da lesão. Expressar a alteração na fluorescência Af como a razão de alteração relativamente à linha de base [(t F ​​-F 0) / 0 F]. </li></ol> 4. visualização da dinâmica da F-actina após o ferimento <ol><li> NOTA: Em resposta ao ferimento da agulha, observar um anel de actina no sítio da ferida que fecha gradualmente em torno da ferida. Esta seção de protocolo ensaios de fechamento da ferida através da medição do diâmetro do anel de actina. </li><li> Gerar vermes transgénicos que expressam um marcador de F-actina, tais como o domínio de ligação da actina moesina Drosophila fundido comGFP, expressa sob o controlo de um promotor específico da epiderme tais como col-19 (Figura 2A) (transgene juIs352). NOTA: Temos obtido resultados semelhantes usando outros marcadores de domínio, tais como Lifeact ou F-tractin (resultados não publicados) actina. </li><li> Execute agulha ferindo em P col-19- vermes transgênicos GFP moesin. Depois de agulha ferimento, observar um anel de GFP-moesin ao redor do local da ferida por ~ 5 min. O anel de actina torna-se menor em diâmetro e, eventualmente, fecha 2-3 horas após o ferimento, em animais de tipo selvagem (Figura 2A). </li><li> Prepara-se uma almofada de 2% de agar em uma lâmina de vidro e transferir 10 para o bloco de vermes em 2 ul Levamisol solução 12 mM. Imagem dos anéis GFP-moesin 1 hora após o ferimento usando microscopia confocal convencional. NOTA: microscopia confocal Uso de adquirir z pilhas (13 x 0,5 m) de anéis de actina 1 hora após o ferimento. </li><li> Meça o diâmetro do anel de actina após o ferimento. Para quantificar epidérmico LFP-moesin, primeiro fazer uma projeção de intensidade máxima do z-stack e depois tirar 4 scans de linha (em 45 ° entre si) sobre o anel de GFP-moesin. O diâmetro do anel é definido como o pico médio da distância pico dos quatro varrimentos das linhas (Figura 2B). Para anéis que já fechadas, o diâmetro é definido como 0 mm. NOTA: F-actina anéis são convenientemente medidos 1 hora após o ferimento como este é, aproximadamente, a meio caminho através do processo de encerramento de feridas no tipo selvagem. Anéis F-actina também pode ser medido em vários pontos de tempo para derivar um curso de tempo de encerramento de feridas. Filmes lapso de tempo de fechamento da ferida pode ser adquirido usando vermes imobilizada-levamisole e girando microscopia confocal disco. </li></ol> 5. Ensaio de Indução de epidérmicas Antimicrobial Peptides NOTA: Ferimento também desencadeia respostas imunitárias inatas na C. elegans pele. A transcrição de genes que codificam peptídeos antimicrobianos (AMPs) é induced na epiderme. A PNL-29 (proteína neuropeptídeo-like) AMP é fortemente induzido pelo ferindo quatro. Para analisar como a epiderme controla a expressão AMP após o ferimento, utilize repórteres transgénicos ou PCR em tempo real para detectar os níveis individuais de transcrição AMP. <ol><li> Ensaio de repórter transgênica para a resposta imune inata para ferindo quatro. </li><li> Execute ferimento agulha (como no protocolo 1) em animais adultos que expressam o repórter transgênico frIs7, que contém P PNL-29- GFP e P-12 col DsRed como um controlo interno. Observe os animais adultos sem ferimentos vermelho escuro ou laranja em uma GFP filtro passe longo. NOTA: Ferir do tipo selvagem vermes vão induzir a P-29 PNL -GFP expressão, mas não afetará P col-12 -dsRed, resultando em vermes que aparecem laranja, amarelo, verde ou GFP sob iluminação passe longo. A perda da função de genes na via de p38 MAPK, tais como pmk-1 ou NSY-1 irá bloquear PNL-29 -GFPindução após ferindo quatro. GFP P PNL-29- é expresso em níveis elevados em estágios larvais </li><li> Execute AMP ensaios de indução nos animais adultos jovens. Certifique-se de que os animais de controle sem ferimentos têm baixos níveis de GFP. NOTA: P PNL-29- expressão da GFP também é induzida por stress osmótico 8, e podem ser sensíveis a outros tipos de stress ambiental. </li><li> 6 horas após o ferimento, marcar o número de vermes que têm pnl P-29 -GFP indução (Figura 3) 9 utilizando uma fluorescência escopo de dissecação com GFP filtro de passagem longa. NOTA: Em 1 hora após o ferimento P PNL-29- GFP é induzida visivelmente, atingindo um pico de cerca de 6 horas após o ferimento e, em seguida, permanecendo elevado até 24 horas após o ferimento. Quantificar a expressão por 4,9 de pontuação visual. Alternativamente, quantificar os níveis de expressão usando uma fluorescência ativado verme classificador 4. Para o classificador de verme, pelo menos 50 animais precisam ser ferido. </li><li> Ensaio de PCR em tempo real para quantitating níveis de transcrição dos genes AMP individuais. Níveis de transcrição de ensaio para vários genes: PNL-29, a PNL-30, cnc-1, e cnc-5. </li><li> Execute agulha ferindo on-tipo selvagem ou vermes mutantes (ver protocolo 1) </li><li> Colete 50 vermes feridos e 50 vermes sem ferimentos nos horários desejados (por exemplo, 3, 6, 24 horas) após o ferimento. </li><li> Extrai-se o ARN utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Realizar a transcrição reversa para obter ADNc total de 20 uL utilizando um kit comercial da transcriptase reversa. </li><li> Para RT-PCR, utilizar 0,2 ul de cDNA (1/40) de cada amostra em combinação com um Supermix verde com fluoresceína e 0,2 uM iniciadores. Para comparar a qualidade RNA, utilize ama-1 ou SNB-1 RT-PCR como referência; comparar o nível de expressão relativa AMP normalizando ao controlo interno (AMA-1 ou SNB-1), ou comparar indução vezes após o ferimento (indução AMP em vermes feridos / worms sem ferimentos) por normaalizing para controle interno. NOTA: cnc-1 e cnc-5 são caenacin família peptídeos antimicrobianos cuja transcrição é ativado por ferindo 10. Normalmente, agulha ferimento induz a expressão (~ 500 vezes para cnc-1), no período máximo de 4 horas 10. Os iniciadores utilizados em trabalhos publicados são apresentadas na Tabela 2. </li></ol> 6. ensaio de sobrevivência após o ferimento <ol><li> NOTA: Ferimento activa pelo menos duas vias de sinalização independentes na epiderme: a Ca 2+ dependente via de reparação de feridas e a via de resposta imune inata. Ambas as vias são necessários para a sobrevivência completa do ferimento estéril. Para testar se um mutante ou tratamento RNAi afecta a cicatrização de feridas, em medir a sobrevivência de 24-48 horas após o ferimento. Opcionalmente, use o tempo de vida ensaios convencionais para determinar o efeito de ferir sobre a longevidade 4,9. </li><li> Execute agulha ferindo em adulto jovem (L4 + 24 hr) vermes (50 vermes, repita sevevezes RAL) seguindo o protocolo 1 acima. Manter um número equivalente de vermes sem ferimentos como controles. </li><li> Verifique sobrevivência cada 24 horas (de transferência de vermes feridos para uma nova placa de ágar a cada 24 horas). Observe ~ 50% de sobrevivência de 24 horas após o ferimento em mutantes que estão com defeito no reparo de feridas, como GTL-2 ou tir-1, quando normalizado para animais de controle sem ferimentos. A morte é definida como uma falta de resposta locomotor para tocar por verme picareta. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G&#945;q-Ca2++signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans.">A G&#945;q-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 .</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li><li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase.">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li><li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis.">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo.">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., &amp; Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li><li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

Os métodos apresentados aqui por agulha e ferimento a laser oferecem abordagens complementares para avaliar a capacidade do epitélio epidérmico para reparar os danos. Ferimento Laser é relativamente localizada e (dependendo da configuração laser) pode ser confinado à epiderme, enquanto ferimento agulha interrompe a epiderme, cutícula e membranas basais internos prováveis. Ferimento Needle pode assemelhar-se com mais precisão as feridas infligidas por patógenos ou danos mecânicos no ambiente natural. Como reg...

Pele ferida mecanismos de cura são de interesse biológico básico e relevantes para a saúde humana. Cicatrização de feridas nos animais vertebrados e mamíferos compreende uma série complexa de respostas coordenadas de vários tecidos e de sinalização 1. Muitas simples organismos modelo genético também são capazes de curar feridas de pele 2. É, portanto, de interesse para analisar modelos geneticamente tratáveis ​​de reparação de feridas de pele. Nós e os outros começaram a usar Caenorhabditis elegans como novo modelo para a pele ferida cura 3,4. O objetivo deste protocolo é permitir que um conjunto mais amplo de pesquisadores para usar C. elegans como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares da epiderme a cicatrização de feridas. A C. elegans pele compreende a epiderme (também conhecidos como hipoderme) e a cutícula extracelular 5. A epiderme adultos é formado a partir de um pequeno número de sincícios multinucleados, das quais a maior é a sincício known como hyp7. A epiderme é um epitélio simples que segrega a cutícula na sua superfície apical. A pele pode defender ativamente contra patógenos de penetração na pele e reparar pequenos ferimentos 4. Reparação de feridas do C. elegans pele é robusta, como quase todos os animais do tipo selvagem sobreviver podem sobreviver pequenas perfurações causadas por agulhas, ou danos à pele local provocada pela irradiação laser. C. elegans ferimento da pele desencadeia uma série de respostas, incluindo uma resposta epidérmica imunológica inata, fechamento da ferida, e formação de cicatriz 4. A epiderme adultos é pós-mitótico, e cicatrização de feridas envolve respostas celulares locais em oposição à proliferação epidérmica ou migração celular. Mostrámos que o ferimento da pele provoca um aumento considerável e sustentado epidérmico Ca 2+, exigindo o canal TRPM membrana GTL-2 e internas de Ca 2+ lojas 3. O sinal de Ca2 + da epiderme é necessário para a formação e fecho dos anéis de F-actina no wolocal und. Ferimento também induz resposta imune inata que ativam a transcrição de AMPs como PNL-29. A transcrição induzida pelo ferimento de AMPs é dependente de um / PMK-1 MAP-quinase p38 cascata agindo autonomamente na epiderme 4 TIR-1. Defeitos quer na via de sinalização de Ca2 + ou na resposta imune inata irá conduzir a uma baixa sobrevivência após o ferimento. A estrutura relativamente simples do C. elegans epiderme, sua rastreabilidade genética e as vantagens para a imagem in vivo torná-lo um excelente sistema para estudar vários aspectos da reparação de feridas. Aqui apresentamos os protocolos para os dois métodos mais comuns de ferimento: ferimento agulha e ferindo laser. Ferimento da agulha requer nenhum equipamento especializado (excepto o puxador de agulha), e com experiência pode ser realizado em centenas de vermes por dia. Ferimento da agulha é realizada em animais em crescimento em placas de agar. Em contraste, o ferimento do laser é realizado em anesanimais thetized montado em agar almofadas sob uma lamela, e é adequada para imagens ao vivo das respostas celulares a danos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

A C. elegans epiderme e cutícula formar uma camada de pele simples mas sofisticado que pode reparar danos localizados resultante do ferimento. Os estudos da resposta de feridas e reparação neste modelo ter iluminado a nossa compreensão do citoesqueleto e respostas genómicas para danos nos tecidos. Os dois métodos mais comumente usados ​​para ferir a C. elegans pele de um adulto são picadas com agulhas microinjeção, e irradiação com laser local. Agulha ferindo interrompe localmente a cutícula, epiderme, e matriz extracelular associada, e também podem danificar os tecidos internos. Resultados da irradiação com laser em danos mais localizada. Ferimento desencadeia uma sucessão de respostas prontamente ensaiada, incluindo epidérmico elevada Ca 2+ (segundo minutos), a formação e fecho de um anel que contém actina no sítio da ferida (1-2 hr), a transcrição de genes elevada de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), e formação de cicatriz. Essencialmente todos os animais adultos de tipo selvagem sobrevivem ferimento, ondecomo mutantes defectivos na reparação de feridas ou outras respostas mostram diminuição sobrevivência. Protocolos detalhados para agulhas e ferimento a laser, e ensaios para a quantificação e visualização de respostas feridas e processos de reparação (dinâmica de Ca, dinâmica de actina, indução peptídeo antimicrobiano e sobrevivência) são apresentados.

Laser ou agulha ferimento irá desencadear uma elevação rápida e sustentada dos níveis de Ca epidérmicas, como visualizado com sensores Ca como GCaMPs (Figura 1). A elevação Ca ocorre em poucos segundos, e permanece elevada por dezenas de minutos. Agulha ferindo reprodutivelmente resulta na formação de anéis de F-actina em locais de ferida (Figura 2); estas aparecem dentro de minutos, e fechar gradualmente ao longo de 1-2 horas após o ferimento. Anéis de actina são menos fr...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K visualizações.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Biologia

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Ensaios Neurocircuit para Apreensões em mutantes de Epilepsia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Medições de Respostas de Estresse Fisiológico em C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...