Name: methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
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Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Os seguintes protocolos de descrever o procedimento detalhado para C. elegans pele ferindo e para ensaiar respostas feridas. 1. Needle Ferimento 3,4 <ol><li> Crescer vermes unstarved saudáveis ​​na NGM standard (meio de crescimento nematóide) placas com E. bactérias coli OP50 como alimentos, mantidos em um 20 ° C incubadora. NOTA: Os métodos para placas de agar NGM e cultivo de rotina de C. elegans pode ser encontrada em www.wormbook.org 6. </li><li> Escolha 25 L4 vermes palco para um recém-semeadas placa 1 dia antes ferindo e cultura a 20 ° CO / N. </li><li> Antes ferindo, puxe agulhas dos capilares usando um extrator de agulha. As agulhas utilizadas no ferir, são idênticos aos utilizados para microinjecção de C. elegans. </li><li> Certifique-se que todos os vermes estão em fase de adulto jovem. Colocar a placa de vermes em gelo durante cerca de 30 min. Resfriamento faz com que os animais a ser lento, facilitando agulha ferimento. <br /&gt; NOTA: Dentro de 5 min de remoção do gelo, os vermes vai começar a mover-se normalmente. É possível, mas desafiador para ferir vermes em movimento. Com a experiência, 5 min tempo suficiente para ferir 25 worms. Imobilizar com drogas como o levamisol (como usado no ferimento laser, ver abaixo), embora os animais vai demorar mais tempo para se recuperar. </li><li> Remova a placa de agar a partir de gelo para um estereomicroscópio de dissecação. Usando uma picareta verme, vermes mover 25 para o centro da placa de agar. </li><li> Coloque a agulha em uma ponteira 100 l para manter mais facilmente a agulha. Perfurar a parte anterior ou posterior do corpo do sem-fim com a agulha, evitando o desenvolvimento das gónadas. Em geral, tentar ferida entre a faringe posterior e anterior das gônadas, ou entre a gônada posterior e do reto. Re-use agulhas muitas vezes, até que eles quebram. NOTA: Certifique-se as feridas são breves, picadas suaves que perfuram a cutícula e pele, penetrando ~ 5-10 mm para o animal. A agulha deve entrar no animal em aproximadamente um ângulo reto com a pele. As feridas não deve causar danos evidentes aos órgãos internos, ou ruptura imediata do corpo. Observar uma pequena quantidade de citoplasma escorrendo para fora por alguns segundos depois que a ferida; no entanto, se o conteúdo celulares vazar durante um tempo prolongado os animais não vão sobreviver. Para imagem ideal, ferir o syncytium laterais epidérmico (hyp7) ou a costura lateral. NOTA: Este procedimento inclui a utilização de uma agulha de vidro. </li><li> Permitir vermes para recuperar, à TA, em seguida a cultura a 20 ° C. Julgar o sucesso de ferimento da agulha por uma série de ensaios a seguir descritos. Mais de 95% dos animais de tipo selvagem sobrevivem 24 horas após o ferimento da agulha na fase de adulto jovem. O efeito de ferir em larvas ou adultos mais velhos ainda não foi amplamente analisada. </li></ol> 2. Laser Ferimento 3 Use a irradiação com laser de femtossegundos (800 nm) para realizar ferimento mais preciso. <ol><li> Prepare agar pAnúncios sobre uma lâmina de vidro derretido com 2% agar 7. Assegurar que as almofadas são semelhantes para as almofadas de agar utilizadas para imagens em tempo real de C. elegans. </li><li> Transferir 10 vermes adultos jovens sobre o bloco de agarose com sem-fim de seleção e adicionar uma gota 2 mL de solução de 12 Levamisole mM. Cubra os animais e para o líquido com uma lamela. Espere 1-2 min para os vermes para paralisar. </li><li> Coloque a lâmina de vidro em um microscópio confocal disco giratório. Mova o palco para encontrar os vermes e se concentrar nas anterior e posterior sincicial epiderme laterais com um objetivo 100X (NA 1,4-1,46). </li><li> Defina a potência do laser femtosegundo a 140 mW (medido antes da objetiva). Use o laser de femtosegundo uma taxa de repetição de 80 MHz. NOTA: Dois pulsos de 200 ms cada (separados por 20 ms) são suficientes para ferindo em nossas mãos. </li><li> Concentre-se na superfície apical da célula epidérmica e ferir a epiderme. Observe rompimento local do citoplasma (borbulhando), ou o local de branqueamentof qualquer marcador fluorescente utilizado. NOTA: Siga os procedimentos de segurança a laser apropriadas quando se utiliza o laser de femtosegundo. Ponto ou linha scans usando lasers de femtossegundos, tais como aqueles em dois microscópios de fótons deve fornecer energia suficiente para ferir laser. NOTA: Enquanto não temos experiência direta do uso de outros lasers, em princípio, o ferimento deve ser possível usando lasers UV convencionais (como usado em C. elegans ablações celulares). Opcionalmente, use uma recuperação de fluorescência Após Fotodegradação módulo (FRAP) no giro confocal disco de ferir a epiderme (N. Pujol, comunicação pessoal). </li></ol> 3. A visualização das Epidérmico Ca 2+ As respostas do ferimento <ol><li> Use C. transgênico elegans estirpes que expressam Ca 2+ sensores (tais como os da série GCaMP) na epiderme, sob o controlo do promotor específico adulto epidérmico col-19 (Figura 1A; transgenes são listados em <strong&gt; Tabela 1). Usar um transgene que expressa uma proteína fluorescente vermelha, como tdTomato como um controlo interno para o nível de expressão do transgene. NOTA: Temos usado tdTomato como um controlo interno para a expressão do transgene como epidérmica tdTomato fluorescência é relativamente estável e não interfere com GCaMP imagem. </li><li> Ambos agulha eo laser ferindo gatilho Ca 2+ elevação na epiderme. No entanto, como ferimento da agulha não pode ser prontamente realizada em um disco confocal fiação, ferimento laser é preferível para análise quantitativa da resposta de Ca2 + (Figura 1). </li><li> Adquirir imagens de lapso de tempo em modo de aquisição multi-dimensional (tempo de intervalo de 2 segundos com 114 ms exposição laser de excitação), utilizando um confocal fiação disco com objetivo 100X (NA 1,4-1,46) e filtros adequados (filtros GFP irá trabalhar para GCaMP3). NOTA: Adquirir imagens de lapso de tempo a cada 30 seg por cerca de 2 horas para examinar o Ca 2+ response do ferimento durante um curso de tempo mais longo. </li><li> Usando o software de análise de imagem medir a fluorescência média GCaMP em dez regiões equivalentes de interesse (ROI), cinco dos quais estão centradas no citoplasma de células epidérmicas e cinco no fundo. </li><li> Obter fluorescência basal (F 0) fazendo a média da fluorescência em 5 ROIs na epiderme, em seguida, subtraindo a média de 5 ROIs no fundo antes da lesão. Expressar a alteração na fluorescência Af como a razão de alteração relativamente à linha de base [(t F ​​-F 0) / 0 F]. </li></ol> 4. visualização da dinâmica da F-actina após o ferimento <ol><li> NOTA: Em resposta ao ferimento da agulha, observar um anel de actina no sítio da ferida que fecha gradualmente em torno da ferida. Esta seção de protocolo ensaios de fechamento da ferida através da medição do diâmetro do anel de actina. </li><li> Gerar vermes transgénicos que expressam um marcador de F-actina, tais como o domínio de ligação da actina moesina Drosophila fundido comGFP, expressa sob o controlo de um promotor específico da epiderme tais como col-19 (Figura 2A) (transgene juIs352). NOTA: Temos obtido resultados semelhantes usando outros marcadores de domínio, tais como Lifeact ou F-tractin (resultados não publicados) actina. </li><li> Execute agulha ferindo em P col-19- vermes transgênicos GFP moesin. Depois de agulha ferimento, observar um anel de GFP-moesin ao redor do local da ferida por ~ 5 min. O anel de actina torna-se menor em diâmetro e, eventualmente, fecha 2-3 horas após o ferimento, em animais de tipo selvagem (Figura 2A). </li><li> Prepara-se uma almofada de 2% de agar em uma lâmina de vidro e transferir 10 para o bloco de vermes em 2 ul Levamisol solução 12 mM. Imagem dos anéis GFP-moesin 1 hora após o ferimento usando microscopia confocal convencional. NOTA: microscopia confocal Uso de adquirir z pilhas (13 x 0,5 m) de anéis de actina 1 hora após o ferimento. </li><li> Meça o diâmetro do anel de actina após o ferimento. Para quantificar epidérmico LFP-moesin, primeiro fazer uma projeção de intensidade máxima do z-stack e depois tirar 4 scans de linha (em 45 ° entre si) sobre o anel de GFP-moesin. O diâmetro do anel é definido como o pico médio da distância pico dos quatro varrimentos das linhas (Figura 2B). Para anéis que já fechadas, o diâmetro é definido como 0 mm. NOTA: F-actina anéis são convenientemente medidos 1 hora após o ferimento como este é, aproximadamente, a meio caminho através do processo de encerramento de feridas no tipo selvagem. Anéis F-actina também pode ser medido em vários pontos de tempo para derivar um curso de tempo de encerramento de feridas. Filmes lapso de tempo de fechamento da ferida pode ser adquirido usando vermes imobilizada-levamisole e girando microscopia confocal disco. </li></ol> 5. Ensaio de Indução de epidérmicas Antimicrobial Peptides NOTA: Ferimento também desencadeia respostas imunitárias inatas na C. elegans pele. A transcrição de genes que codificam peptídeos antimicrobianos (AMPs) é induced na epiderme. A PNL-29 (proteína neuropeptídeo-like) AMP é fortemente induzido pelo ferindo quatro. Para analisar como a epiderme controla a expressão AMP após o ferimento, utilize repórteres transgénicos ou PCR em tempo real para detectar os níveis individuais de transcrição AMP. <ol><li> Ensaio de repórter transgênica para a resposta imune inata para ferindo quatro. </li><li> Execute ferimento agulha (como no protocolo 1) em animais adultos que expressam o repórter transgênico frIs7, que contém P PNL-29- GFP e P-12 col DsRed como um controlo interno. Observe os animais adultos sem ferimentos vermelho escuro ou laranja em uma GFP filtro passe longo. NOTA: Ferir do tipo selvagem vermes vão induzir a P-29 PNL -GFP expressão, mas não afetará P col-12 -dsRed, resultando em vermes que aparecem laranja, amarelo, verde ou GFP sob iluminação passe longo. A perda da função de genes na via de p38 MAPK, tais como pmk-1 ou NSY-1 irá bloquear PNL-29 -GFPindução após ferindo quatro. GFP P PNL-29- é expresso em níveis elevados em estágios larvais </li><li> Execute AMP ensaios de indução nos animais adultos jovens. Certifique-se de que os animais de controle sem ferimentos têm baixos níveis de GFP. NOTA: P PNL-29- expressão da GFP também é induzida por stress osmótico 8, e podem ser sensíveis a outros tipos de stress ambiental. </li><li> 6 horas após o ferimento, marcar o número de vermes que têm pnl P-29 -GFP indução (Figura 3) 9 utilizando uma fluorescência escopo de dissecação com GFP filtro de passagem longa. NOTA: Em 1 hora após o ferimento P PNL-29- GFP é induzida visivelmente, atingindo um pico de cerca de 6 horas após o ferimento e, em seguida, permanecendo elevado até 24 horas após o ferimento. Quantificar a expressão por 4,9 de pontuação visual. Alternativamente, quantificar os níveis de expressão usando uma fluorescência ativado verme classificador 4. Para o classificador de verme, pelo menos 50 animais precisam ser ferido. </li><li> Ensaio de PCR em tempo real para quantitating níveis de transcrição dos genes AMP individuais. Níveis de transcrição de ensaio para vários genes: PNL-29, a PNL-30, cnc-1, e cnc-5. </li><li> Execute agulha ferindo on-tipo selvagem ou vermes mutantes (ver protocolo 1) </li><li> Colete 50 vermes feridos e 50 vermes sem ferimentos nos horários desejados (por exemplo, 3, 6, 24 horas) após o ferimento. </li><li> Extrai-se o ARN utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Realizar a transcrição reversa para obter ADNc total de 20 uL utilizando um kit comercial da transcriptase reversa. </li><li> Para RT-PCR, utilizar 0,2 ul de cDNA (1/40) de cada amostra em combinação com um Supermix verde com fluoresceína e 0,2 uM iniciadores. Para comparar a qualidade RNA, utilize ama-1 ou SNB-1 RT-PCR como referência; comparar o nível de expressão relativa AMP normalizando ao controlo interno (AMA-1 ou SNB-1), ou comparar indução vezes após o ferimento (indução AMP em vermes feridos / worms sem ferimentos) por normaalizing para controle interno. NOTA: cnc-1 e cnc-5 são caenacin família peptídeos antimicrobianos cuja transcrição é ativado por ferindo 10. Normalmente, agulha ferimento induz a expressão (~ 500 vezes para cnc-1), no período máximo de 4 horas 10. Os iniciadores utilizados em trabalhos publicados são apresentadas na Tabela 2. </li></ol> 6. ensaio de sobrevivência após o ferimento <ol><li> NOTA: Ferimento activa pelo menos duas vias de sinalização independentes na epiderme: a Ca 2+ dependente via de reparação de feridas e a via de resposta imune inata. Ambas as vias são necessários para a sobrevivência completa do ferimento estéril. Para testar se um mutante ou tratamento RNAi afecta a cicatrização de feridas, em medir a sobrevivência de 24-48 horas após o ferimento. Opcionalmente, use o tempo de vida ensaios convencionais para determinar o efeito de ferir sobre a longevidade 4,9. </li><li> Execute agulha ferindo em adulto jovem (L4 + 24 hr) vermes (50 vermes, repita sevevezes RAL) seguindo o protocolo 1 acima. Manter um número equivalente de vermes sem ferimentos como controles. </li><li> Verifique sobrevivência cada 24 horas (de transferência de vermes feridos para uma nova placa de ágar a cada 24 horas). Observe ~ 50% de sobrevivência de 24 horas após o ferimento em mutantes que estão com defeito no reparo de feridas, como GTL-2 ou tir-1, quando normalizado para animais de controle sem ferimentos. A morte é definida como uma falta de resposta locomotor para tocar por verme picareta. </li></ol>

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	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. 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The authors are not aware of any competing interests.

Os métodos apresentados aqui por agulha e ferimento a laser oferecem abordagens complementares para avaliar a capacidade do epitélio epidérmico para reparar os danos. Ferimento Laser é relativamente localizada e (dependendo da configuração laser) pode ser confinado à epiderme, enquanto ferimento agulha interrompe a epiderme, cutícula e membranas basais internos prováveis. Ferimento Needle pode assemelhar-se com mais precisão as feridas infligidas por patógenos ou danos mecânicos no ambiente natural. Como reg...

Pele ferida mecanismos de cura são de interesse biológico básico e relevantes para a saúde humana. Cicatrização de feridas nos animais vertebrados e mamíferos compreende uma série complexa de respostas coordenadas de vários tecidos e de sinalização 1. Muitas simples organismos modelo genético também são capazes de curar feridas de pele 2. É, portanto, de interesse para analisar modelos geneticamente tratáveis ​​de reparação de feridas de pele. Nós e os outros começaram a usar Caenorhabditis elegans como novo modelo para a pele ferida cura 3,4. O objetivo deste protocolo é permitir que um conjunto mais amplo de pesquisadores para usar C. elegans como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares da epiderme a cicatrização de feridas. A C. elegans pele compreende a epiderme (também conhecidos como hipoderme) e a cutícula extracelular 5. A epiderme adultos é formado a partir de um pequeno número de sincícios multinucleados, das quais a maior é a sincício known como hyp7. A epiderme é um epitélio simples que segrega a cutícula na sua superfície apical. A pele pode defender ativamente contra patógenos de penetração na pele e reparar pequenos ferimentos 4. Reparação de feridas do C. elegans pele é robusta, como quase todos os animais do tipo selvagem sobreviver podem sobreviver pequenas perfurações causadas por agulhas, ou danos à pele local provocada pela irradiação laser. C. elegans ferimento da pele desencadeia uma série de respostas, incluindo uma resposta epidérmica imunológica inata, fechamento da ferida, e formação de cicatriz 4. A epiderme adultos é pós-mitótico, e cicatrização de feridas envolve respostas celulares locais em oposição à proliferação epidérmica ou migração celular. Mostrámos que o ferimento da pele provoca um aumento considerável e sustentado epidérmico Ca 2+, exigindo o canal TRPM membrana GTL-2 e internas de Ca 2+ lojas 3. O sinal de Ca2 + da epiderme é necessário para a formação e fecho dos anéis de F-actina no wolocal und. Ferimento também induz resposta imune inata que ativam a transcrição de AMPs como PNL-29. A transcrição induzida pelo ferimento de AMPs é dependente de um / PMK-1 MAP-quinase p38 cascata agindo autonomamente na epiderme 4 TIR-1. Defeitos quer na via de sinalização de Ca2 + ou na resposta imune inata irá conduzir a uma baixa sobrevivência após o ferimento. A estrutura relativamente simples do C. elegans epiderme, sua rastreabilidade genética e as vantagens para a imagem in vivo torná-lo um excelente sistema para estudar vários aspectos da reparação de feridas. Aqui apresentamos os protocolos para os dois métodos mais comuns de ferimento: ferimento agulha e ferindo laser. Ferimento da agulha requer nenhum equipamento especializado (excepto o puxador de agulha), e com experiência pode ser realizado em centenas de vermes por dia. Ferimento da agulha é realizada em animais em crescimento em placas de agar. Em contraste, o ferimento do laser é realizado em anesanimais thetized montado em agar almofadas sob uma lamela, e é adequada para imagens ao vivo das respostas celulares a danos.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

A C. elegans epiderme e cutícula formar uma camada de pele simples mas sofisticado que pode reparar danos localizados resultante do ferimento. Os estudos da resposta de feridas e reparação neste modelo ter iluminado a nossa compreensão do citoesqueleto e respostas genómicas para danos nos tecidos. Os dois métodos mais comumente usados ​​para ferir a C. elegans pele de um adulto são picadas com agulhas microinjeção, e irradiação com laser local. Agulha ferindo interrompe localmente a cutícula, epiderme, e matriz extracelular associada, e também podem danificar os tecidos internos. Resultados da irradiação com laser em danos mais localizada. Ferimento desencadeia uma sucessão de respostas prontamente ensaiada, incluindo epidérmico elevada Ca 2+ (segundo minutos), a formação e fecho de um anel que contém actina no sítio da ferida (1-2 hr), a transcrição de genes elevada de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), e formação de cicatriz. Essencialmente todos os animais adultos de tipo selvagem sobrevivem ferimento, ondecomo mutantes defectivos na reparação de feridas ou outras respostas mostram diminuição sobrevivência. Protocolos detalhados para agulhas e ferimento a laser, e ensaios para a quantificação e visualização de respostas feridas e processos de reparação (dinâmica de Ca, dinâmica de actina, indução peptídeo antimicrobiano e sobrevivência) são apresentados.

Laser ou agulha ferimento irá desencadear uma elevação rápida e sustentada dos níveis de Ca epidérmicas, como visualizado com sensores Ca como GCaMPs (Figura 1). A elevação Ca ocorre em poucos segundos, e permanece elevada por dezenas de minutos. Agulha ferindo reprodutivelmente resulta na formação de anéis de F-actina em locais de ferida (Figura 2); estas aparecem dentro de minutos, e fechar gradualmente ao longo de 1-2 horas após o ferimento. Anéis de actina são menos fr...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K visualizações.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Vídeo: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser axotomia em C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Neurociência

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Microinjeção Ferida Ensaio e<em&gt; In vivo</em&gt; Localização de Epidermal Wound resposta Jornalistas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Bioengenharia

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Um dispositivo para executar a migração celular / cicatrização de feridas em uma placa de 96 poços

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Biologia do Desenvolvimento

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Um modelo de Drosophila para estudar poliploidização induzida por feridas

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Imunologia e Infecção

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Medicina

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Biologia

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Caracterização da cicatrização de feridas epiteliais in vivo utilizando o organismo modelo cnidário Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Epidermal Laser Wounding: Inducing Localized Damage to Examine Repair Processes in C. elegans

Source: Xu, S. and Chisholm, A. D. <a href="https://www.jove.com/video/51959/methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans">Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in&#160;C. elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2014).
This video introduces a method of laser wounding, which is used to cause very precise injuries in the worm epidermis.&#160; The sample protocol is from a study of wound response and repair.

Lesão epidérmica a laser: induzindo danos localizados para examinar processos de reparo em C. elegans

Source: Xu, S. and Chisholm, A. D. Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in&#160;C. elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2014).
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Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no

Resumo

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