O ECLIA é um método simples, mas eficiente, para quantificar os níveis celulares de MeCP2. O ECLIA é rápido, mais sensível e mais fácil de manusear em comparação com outros métodos de quantificação, como a mancha ocidental e a ELISA. Para preparar a solução de lavagem, que é 0,5%Tween 20 em PBS, adicione 500 microliters de Tween 20 a um litro de PBS e misture vigorosamente.
Prepare uma solução de bloqueio de 3% Bloqueador A e PBS e mexa suavemente. Esterilize a solução de bloqueio por filtragem. Para preparar a solução diluente de ensaio, 1%Blocker A e PBS, adicione cinco mililitros de solução de bloqueio a 10 mililitros de PBS.
Em seguida, descongele o anticorpo anti-MeCP2 do rato monoclonal no gelo. Misture 0,67 microliters do anticorpo com quatro mililitros de PBS, depois vórtice da solução. Para a solução revestir a placa de ligação de 96 poços, dispense cuidadosamente 25 microliters de solução de revestimento no canto inferior de cada poço, usando um pipetter multicanal.
Dab a placa de 96 poços suavemente de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra a parte inferior de cada poço. Sele a placa com papel alumínio adesivo e incuba durante a noite a quatro graus Celsius. Retire a placa de 96 poços da geladeira e retire a folha.
Remova a solução de revestimento de anticorpos nos poços, jogando-a em um recipiente de resíduos. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Em seguida, adicione 125 microliters de solução de bloqueio a cada poço.
Em seguida, sele novamente a placa com papel alumínio. Coloque a placa em um agitador de microplaco orbital, fixado em 800 RPM, e incuba-a por 90 minutos em temperatura ambiente. Descongele no gelo um frasco de solução de estoque de proteínas MeCP2 ou Tat-MeCP2, lises cerebrais de camundongos e lisess hdf.
Diluir a solução de estoque de proteínas em tubos limpos, conforme descrito na tabela dois do manuscrito. Em seguida, diluir as amostras de lise. Para os lises cerebrais do camundongo, use de um a 20 microgramas por 25 microliters de tampão de lise.
Para o hdf lysate, adicione 0,25 a um micrograma por 25 microliters de tampão de lise. Depois que a placa de 96 poços estiver incubada por 90 minutos, remova a solução de bloqueio dos poços, jogando-a em um recipiente de lixo. Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante.
Em seguida, lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem, adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de padrões e amostras aos poços da placa de 96 poços. Sele a placa e incuba-a por mais quatro horas em temperatura ambiente com constantes tremores de 800 RPM.
Descongele o anticorpo de detecção não rotulado, coelhinho policlonal anti-MeCP2, no gelo. Utilizando solução diluída de ensaio, diluir o anticorpo em uma proporção de um a 6.000. Quando a placa de 96 poços terminar de incubar no agitador, remova os padrões e amostras, jogando a placa em um recipiente de resíduos.
Em seguida, toque na placa em uma toalha de papel para remover qualquer solução restante. Lave a placa três vezes com 150 microliters de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente. Adicione 25 microliters de solução de anticorpos de detecção sem rótulo para cada poço com o pipetter multicanal.
Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM. Obtenha o anticorpo secundário específico da geladeira e coloque-o um gelo. Diluir o corpo secundário na solução diluída do ensaio e misture suavemente.
Para remover o anticorpo de detecção sem rótulo livre da placa de 96 poços, entre no recipiente de resíduos e, em seguida, bata a placa em uma toalha de papel. Depois de lavar a placa três vezes como descrito perviosamente, adicione 25 microliters de anticorpo secundário a cada poço com o pipetter multicanal. Sele a placa e incuba-a por uma hora em temperatura ambiente com agitação constante a 800 RPM.
Remova o anticorpo secundário livre, clicando no recipiente de lixo e batendo na placa em uma toalha de papel e, em seguida, lave a placa três vezes, como descrito anteriormente. A cada poço da placa, adicione 150 microlitadores de 1X Tris base Gold Read Buffer com surfactante, contendo tripropilamina como um coreactante para geração de luz. Para evitar produzir bolhas de ar, use técnicas de tubulação reversa.
Coloque a placa de 96 poços na plataforma de microplaca com sistema de detecção de eletroquimiluminascência. Usando a câmera CCD incorporada, comece imediatamente a capturar dados. Contagem de sinais de registro que correspondem a unidades de luz relativas e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.
As curvas padrão MeCP2 foram geradas a partir de MeCP2 humano em múltiplas medições. O ECLIA pode quantificar com precisão meCP2 humano recombinante sobre uma faixa de um nanograma por mililitro a 1800 nanogramas por mililitro. Usando ECLIA, os níveis de proteína MeCP2 foram medidos em lises nucleares cerebrais de camundongos heterozigosos e fêmeas e de um rato-nocaute MeCP2.
O ECLIA foi conduzido em lisescelulares a partir de um controle saudável e da linha celular c. 806delG usada como modelo para síndrome de Rett. Nenhuma proteína MeCP2 foi detectada nas linhas celulares mutantes pela ECLIA ou por imunofluorescência.
O ECLIA também foi usado para investigar a absorção de Tat-MeCP2 pela linha de celular deficiente MeCP2 horas extras. A precisão eclia inter e intra ensaio foi determinada ao longo de três dias consecutivos. Para futura terapia de substituição de proteínas, a entrega de MeCP2 pode ser repetidamente otimizada após a avaliação do nível de proteína pela ECLIA.
